Для определения количества живых бактерий в нитрагине делают глубинный посев

Обновлено: 05.10.2024

Посев на микрофлору отделяемого тракта женщины с определением чувствительности к антибиотикам — это бактериологическое исследование, с помощью которого определяется количественный и качественный состав микрофлоры и её чувствительность расширенному спектру антибиотиков, антимикотиков и бактериофагов.

Суть метода заключается в посеве исследуемого материала на питательные среды с целью выявления и идентификации чистой культуры возбудителя.

Микрофлора — совокупность микроорганизмов, обитающих на определённых участках среды. В организме человека существует постоянная и транзиторная микрофлора. Транзиторная микрофлора не может существовать в организме длительно. Постоянная микрофлора состоит из микроорганизмов, которые постоянно находятся в нем и она подразделяется на облигатную и факультативную микрофлору. Облигатная флора представлена лактобактериями, бифидобактериями, пептострептококками и кишечными бактериями, ее количественный состав преобладает над факультативной. Факультативная флора это стафилококки, стрептококки, клебсиеллы, клостридии, некоторые грибы. В организме человека микроорганизмы нормальной микрофлоры заключены в полисахаридную биологическую пленку, устойчивую к различным воздействиям.

  • фактор неспецифической резистентности;
  • защитная функция по отношению к патогенной и гнилостной микрофлоре;
  • участие в водно-солевом обмене;
  • участие в рециркуляции стероидных гормонов, желчных солей;
  • участие в формировании и поддержании иммунитета;
  • хранилище и источник хромосомных и плазмидных генов, в частности генов лекарственной устойчивости к антибиотикам.

Микрофлора урогенитального тракта
Слизистая оболочка передней уретры в норме может содержать стафилококки, непатогенные нейсерии, коринеморфные бактерии и др.

Нормальная микрофлора влагалища включает: лактобактерии, бифидобактерии, бактероиды, пропионибактерии, порфиромонады, превотеллы, пептострептококки, коринеформные бактерии др., в ней преобладают анаэробы. В норме соотношение анаэробы/аэробы равно 10:1. В репродуктивный период жизни преобладают грамположительные бактерии, в период менопаузы — грамотрицательные. Примерно у 5–60% здоровых женщин выявляются Gardenerella vaginalis, у 15–30% — Mycoplasma hominis, у 5% — бактерии рода Mobilunculus.

Качественный и количественный состав микрофлоры зависит от фазы менструального цикла, беременности и др. Эстрогены способствуют накоплению гликогена, который расщепляется лактобактериями с образованием молочной кислоты. В результате pH составляет 4–4,6. Подкисленный вагинальный секрет, наличие перекиси водорода и наличие бактерицидов подавляют рост посторонней микрофлоры.

Цервикальный канал и полость матки в норме стерильны.
Инфекционные заболевания
Инфекционные заболевания вызывают патогенные и условно-патогенные микроорганизмы. К условно-патогенным относят представителей нормальной микрофлоры человека, так как эволюционно они сохранили способность к паразитическому образу жизни. В отличие от патогенных микроорганизмов, они проявляют свои свойства при условии снижения сопротивляемости организма.

Бактериологический посев позволяет выделить: энтеробактерии (включая сальмонеллы), стрептококки, энтерококки, стафилококки, неферментирующие грамотрицательные микроорганизмы и дрожжеподобные грибы.

Определение чувствительности к антибиотикам проводится при выявлении роста 10 2 и более КОЕ/мл.

Определение дрожжеподобных грибов рода Candida и постановка чувствительности к антимикотическим средствам входит в данный анализ.

  • инфекции мочевыводящих путей;
  • контроль после лечения.

Сдача мазка не допускается в дни менструации. За трое суток до взятия необходимо отказаться от применения вагинальных свечей, тампонов, спермицидов, за сутки исключить половые контакты. Нельзя спринцеваться накануне проведения обследования. После УЗИ-исследования с применением вагинального датчика, кольпоскопии, биопсии должно пройти не менее 48 часов.

Интерпретация результатов
Интерпретация результатов исследования содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, учитывая результаты данного обследования и данные анамнеза, результатов других обследований и т.д.

На бланке результата указывается наличие или отсутствие роста; степень бактериурии, выраженная в КОЕ/мл, наименование возбудителя; степень бактериурии, выраженная в КОЕ/мл; чувствительность к антимикробным препаратам (определяется при бактериурии в титре более 10 4 КОЕ/мл).

В норме — рост микробной флоры отсутствует. При выделении ассоциации бактерий 10 5 КОЕ/мл и более является критическим. Повышение уровня говорит с большей вероятностью о развитии гнойной инфекции или генерализации процесса. При обсеменённости менее 10 5 КОЕ/мл, раны заживают без явлений нагноения.

Внимание!

При обнаружении роста нормальной, сопутствующей и условно-патогенной флоры в низком титре, и не имеющей диагностического значения, определение чувствительности к антимикробным препаратам не проводится.

Юрий Веляев

Коллеги, добрый, почти день! Сегодня у второй подгруппы пара, как Вы помните, в 14.00. Занятие уже в Мудле. Заходим туда. Смотрим видео. Читаем презентации. Отвечаем рефлексию по тестам. Сюда делаем дубль ответа по тестам.

Тест:
1) Для определения количества живых бактерий в нитрагине делают глубинный посев:
1. на маннитный агар-агар
2. на бобовый агаг-агар
3. на дрожжевой агар-агар
4. на мясопептонный агар-агар

2) Для борьбы с плесенью используют:
1. ксилонафт-5
2. формалин
3. тиозон
4. оксидифенолят натрия

3) Перитрихи-это бактерии:
1. с полярно расположенными пучками жгутиков
2. со жгутиками по всей поверхности клетки
3. не имеющие жгутиков
4. с двумя полярными жгутиками

4) К осветительной системе биологического микроскопа не относится:
1. конденсор
2. диафрагма
3. окуляр
4. зеркало

5) К прямым санитарно-биологическим показателям эпидемической опасности почвы относятся:
1. обнаружение яиц гельминтов и их личинок
2. обнаружение сальмонелл и бактерий паратифа А и В
3. обнаружение стафилококков и стрептококков
4. обнаружение патогенных энтеробактерий и энтеровирусов

Глубинный метод посева в плотные среды. Жидкий продукт или разведение навески вносят параллельно в две чашки Петри и заливают не позднее чем через 15 мин расплавленной и охлажденной до температуры 45±0,5 °С питательной средой. Высота слоя питательной среды должна быть 4–5 мм.

Среду немедленно равномерно перемешивают с посевным материалом круговыми движениями чашки так, чтобы среда не вытекла из чашки и не загрязнила крышку. После застывания среды чашки с посевами вверх дном помещают в термостат.

На подсушенную среду наносят жидкий продукт или разве­дение навески и равномерно растирают по поверхности шпа­телем – изогнутой стеклянной палочкой.

Засеянную поверхность подсушивают, выдерживая чашки в горизонтальном положении в течение 15 мин.

Метод посева в жидкие среды. В колбу или пробирки с питательной средой вносят навеску продукта или разведения навески. При определении количества микроорганизмов пита­тельные среды засевают продуктом и(или) разведениями наве­сок так, чтобы последовательно выдерживалась заданная крат­ность количества посевного материала.

Метод мембранных фильтров. Мембранные фильтры приме­няют для анализа легко фильтруемых жидких продуктов или продуктов, дающих растворы с высоким осмотическим давле­нием. При фильтрации раствора с высоким осмотическим дав­лением раствор предварительно разводят дистиллированной или пептонной водой в соотношении, позволяющем легко профильтровать разведенные растворы.

Жидкий продукт, содержащий небольшое число взвешен­ных частиц, фильтруют в два этапа. Для освобождения от частиц его фильтруют через фильтр со средним диаметром пор 4 мкм, а затем – через фильтр, диаметр и размеры пор кото­рого выбраны в соответствии с группой или видом выявляемых микроорганизмов. Оба фильтра культивируют в аналогичных условиях.

После осаждения микроорганизмов на фильтре из растворов с высоким осмотическим давлением или из растворов, содер­жащих антимикробные вещества, его промывают дистиллиро­ванной водой или пептонно-солевым раствором.

Фильтрацию заканчивают в момент исчезновения влаги на поверхности фильтра. Немедленно после окончания фильтра­ции фильтр переносят на плотные или в жидкие питательные среды. На плотную среду фильтр накладывают нижней сторо­ной так, чтобы она полностью соприкасалась с поверхностью среды. Посевы термостатируют в условиях, благоприятных для роста определяемых микроорганизмов.

Обработка результатов. После термостатирования, установ­ленного соответствующим стандартом на конкретный метод испытания, подсчитывают количество колоний на каждой чашке, содержащей менее 300 колоний (или менее другого количества, установленного соответствующим стандартом на конкретный метод испытания).

В некоторых случаях подсчет колоний может быть затруднен (например, в присутствии инвазивных микроорганизмов). Эти случаи рассматриваются в соответствующих стандартах на кон­кретные методы испытаний.

Пример метода расчета (общий случай). Для получения до­стоверных результатов при подсчете количества колоний необ­ходимо, чтобы хотя бы в одной чашке содержалось не менее 15 колоний. Количество микроорганизмов N в 1 г (см 3 ) пробы вычисляют как средневзвешенное значение из подсчетов на двух последовательных разведениях по формуле

где ΣС – сумма колоний, подсчитанных на всех чашках в двух последовательных разведениях, из которых хотя бы одна чашка содержит не менее 15 колоний; V– объем посевного материа­ла, внесенного в каждую чашку, см 3 ; n1 – количество отобран­ных для подсчета чашек в первом разведении; n2 – количество отобранных для подсчета чашек во втором разведении; d – коэффициент разбавления, соответствующий первому разведе­нию.

Результат вычисления округляют до двух значащих цифр. Для этого, если последняя цифра меньше 5, предшествующую цифру не изменяют; если последняя цифра равна или более 5, предшествующую увеличивают на единицу. Округление прово­дят поэтапно до получения двух значащих цифр.

За результат принимают количество микроорганизмов в 1 см 3 (жидкие продукты) или в 1 г (прочие продукты), выраженное в виде числа от 1,1 до 9,9, умноженного на 10 в соответствую­щей степени.

Округление результата дает 19 000, или 1,9·10 4 микроорга­низмов в грамме продукта.

Метод расчета при проведении идентификации. Если исполь­зуемый метод требует идентификации, определенное количе­ство колоний (обычно 5) пересевают с каждой чашки, ото­бранной для подсчета колоний. После идентификации рассчи­тывают для каждой чашки количество идентифицированных микроорганизмов а по формуле

где А – количество колоний, отобранных для идентификации; b – количество колоний, соответствующих критериям иденти­фикации; С – общее количество колоний.

Результат вычисления округляют до целого числа.

Количество N идентифицированных микроорганизмов, присутствующих в 1 г (см 3 ) испытуемой пробы, рассчитывают как средневзвешенное значение, заменив ΣС на Σa.

Прямой подсчет жидкого продукта дал следующие резуль­таты:

  • в первом выбранном разведении (10 -3 ) в двух чашках вы­явлено соответственно 66 и 80 колоний;
  • во втором выбранном разведении (10 -4 ) – 4 и 7 колоний.
  • из чашки с 66 колониями для идентификации отобрано 8 колоний, из которых 6 соответствовали критериям; следо­вательно, а = 50;
  • из чашки с 80 колониями отобрано 9 колоний, из которых 6 соответствовали критериям; следовательно, а = 53;
  • из чашки с 7 колониями отобрано 5 колоний, из которых 4 соответствовали критериям; следовательно, а = 6;
  • из чашки с 4 колониями все 4 идентифицированы положи­тельно; следовательно а = 4.

Таким образом, количество обнаруженных в пробе микро­организмов составляет 5,1·10 4 в 1 см 3 .

Приближенные оценки количества микроорганизмов.

Если в каждой из двух чашек содержится менее 15 колоний на уровне исходной пробы (жидкие продукты) или исходной суспензии (прочие продукты), то рассчитывают среднее ариф­метическое у колоний, подсчитанных на этих чашках.

Результат выражают следующим образом:

  • для жидких продуктов – приближенное количество микро­организмов в 1 см 3 NE= Υ,
  • для прочих продуктов – приближенное количество микро­организмов в 1 г Ng = Υ/d, где d – коэффициент разбавления исходной суспензии.

Если две чашки не содержат колоний на уровне исходной пробы (жидкие продукты) или исходной суспензии (прочие продукты), то результаты выражают следующим образом:

  • менее 1 микроорганизма в 1 см 3 (жидкие продукты);
  • менее 1/d микроорганизмов в 1 г (прочие продукты), где d – коэффициент разбавления исходной суспензии.

Метод подсчета с использованием жидкой среды. Метод наи­более вероятного числа (НВЧ). Возможны два способа посева.

В наиболее часто используемом способе, называемом "симмет­ричным", применяется одинаковое количество пробирок в каж­дом разведении, объемы соседних разведений обычно соотно­сятся как 1:10. Этот способ используют, если нужно определить не только превышение определенных предельных норм, но и количество присутствующих микроорганизмов.

Используют также способ, называемый "асимметричным", который предусматривает разное количество пробирок в от­дельных разведениях.

В действующих стандартах рассматривается только "сим­метричный" способ с десятикратными разведениями.

В зависимости от требуемой точности результатов засевают необходимое количество флаконов или пробирок одним и тем же разведением (например, три, пять или десять). Как правило, применяемые методы требуют трех пробирок или флаконов на разведение.

Значения индекса НВЧ для приемлемых сочетаний находят по табл. 22.1. С помощью индекса НВЧ определяют наиболее вероятное количество микроорганизмов СS в заданном объеме VS по Формуле

где М – индекс НВЧ, взятый из табл. 22.1 для базового разве­дения V0; F – число, обратное коэффициенту разбавления ис­ходной пробы. Это разведение (1,0) использовано в табл. 22.1 как базовое разведение (обычно F = 10,100 и т.д.); VS – задан­ный объем, выбранный для выражения содержания микроор­ганизмов; V0 - объем, использованный для посева базового разведения.

Если наименьшее разведение из отобранных соответствует пробирке, приготовленной из среды двойной концентрации (посев 10 см 3 ), индекс НВС, взятый из табл. 22.1, делят на 10.

Если НВЧ меньше 0,3 микроорганизма в 1 см 3 (жидкие продукты) или в 1 г (другие продукты) и если была использо­вана методика, предназначенная для малых количеств микро­организмов, результаты должны выражаться следующим обра­зом: менее 1 микроорганизма в 1 см 3 для жидких продуктов или 1 г для прочих продуктов.

Для твердого продукта установлен индекс НВС, равный 24; первая выбранная пробирка соответствует посеву 1 см 3 исход­ной суспензии (F = 10), отсюда СS в 1 г составляет

Цель занятия. Освоить технику посева микроорганизмов на плотные и жидкие питательные среды и методы выделения чис­тых бактериальных культур. Ознакомить студентов с основными культуральными характеристиками микроорганизмов и методами определения количества бактерий.

Оборудование и материалы. Бульонные и агаровые культуры В. cereus, Е. coli и S. aureus в пробирках и в чашках Петри, сме­шанная бульонная культура Е. соli и S. aureus, стерильные МПА и МПБ в пробирках, чашках Петри, солевой МПА (8 % хлорида натрия) в чашках Петри, стеклянные шпатели, стерильные пи­петки Пастера, бактериологические петли.

Культура микроорганизмов — это популяция (расплодка) кле­ток на питательной среде. Посев и пересев культур микроорга­низмов на питательные среды — наиболее частый методический прием, который используют для первичного выделения микро­организма из какого-либо объекта, а также для поддержания культур в жизнеспособном состоянии в лабораторных условиях.

Чистая культура — это популяция бактерий одного вида или биологического варианта (биовара), выращенная на питательной среде.

Штаммы — чистые культуры микроорганизмов одного вида, выделенные из разных объектов или из одного и того же объекта, но в разное время.

Колония — макроскопически видимое скопление клеток мик­роорганизма на поверхности или внутри плотной питательной среды, образовавшихся в результате размножения одной жизне­способной клетки. По этой причине колонию обычно рассматри­вают как чистую культуру микроорганизма.

Посев на жидкую питательную среду. Пробирку с исследуемым материалом и пробирку с питательной средой держат в левой руке, в правую руку берут бактериологическую петлю или пипет­ку и'пробки от пробирок (рис. 37). Над пламенем горелки обжи­гают края пробирок, бактериологическую петлю (пипетку) вводят в пробирку с материалом, переносят материал в пробирку со сте­рильной питательной средой и стряхивают с петли в среду, не смачивая при этом петледержатель. Края пробирок вновь прово­дят над пламенем горелки, закрывают пробирки пробками, сте­рилизуют петлю и ставят ее в штатив. Использованную пипетку опускают концом вниз в банку с дезинфицирующим раствором.

Посев на плотную питательную среду. Выполняют разными способами.



При посеве на чашку Петри: чашку берут в левую руку, большим пальцем левой руки слегка приподнимают крышку, об­жигают на пламени горелки края чашки в зоне щели, вносят по­севной материал на поверхность питательной среды, затем рас­тирают его при помощи стеклянного шпателя или бактериологи­ческой петли (рис. 40).

Посев на полужидкую питательную среду. Выполняют методом укола в столбик питательной среды.

Выделение чистых культур микроорганизмов. При бактериоло­гическом исследовании искомый микроорганизм обнаруживают в материале, как правило, в смеси с бактериями других видов. Классическими методами бактериологии возможно идентифици­ровать микроорганизм только при условии, что он находится в виде чистой культуры.

Методы, основанные на механическом разобщении клеток. Эти методы наиболее часто применяют при выделении чистых куль­тур микроорганизмов.

Метод Пастера (метод разведений): из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных разведений на стерильной жидкой питательной среде в пробир­ках или колбах (10 -1 …10 -10 ). Предполагают, что количество мик­робных клеток в каждом последующем разведении будет меньше, чем в предыдущем, и в какой-то из пробирок останется только одна микробная клетка, которая и даст/начало чистой культуре Микроорганизма. Однако для успешного применения этого мето­да необходимо, чтобы искомый микроорганизм в материале ко­личественно преобладал над сопутствующими видами.

Метод Коха (метод заливок): исследуемый материал в небольшом количестве вносят в пробирку с расплавленным и ох­лажденным до 45. 50 "С МПА, перемешивают, затем каплю пи­тательной среды переносят во вторую пробирку с расплавленным МПА и т. д. Количество разведений зависит от предполагаемой численности микроорганизмов в исследуемом материале. Затем содержимое каждой пробирки выливают в стерильные чашки Петри, после затвердения среды посевы помещают в термостат. Фиксированные в плотной среде микробные клетки при размно­жении формируют колонии, из которых можно отвить (пересе­ять) чистую культуру микроорганизма.

Метод Дригальского: берут три—пять чашек Петри с плотной питательной средой. В одну из чашек вносят посевной материал и распределяют его шпателем по поверхности пита­тельной среды. Не обжигая шпатель, оставшийся на нем матери­ал последовательно растирают на поверхности среды во второй, третьей и остальных чашках. В последних чашках Петри после инкубирования в термостате обычно наблюдают формирование изолированных колоний бактерий.


Более экономичен следующий способ получения изолированных колоний. Бактериологичес­кой петлей с посевным матери­алом несколько раз делают па­раллельные штрихи в одном секторе чашки Петри с пита­тельным агаром (рис. 41). Пет- о лю прожигают в пламени горел­ки, дают остыть и часть матери­ала из первого сектора <А) ана­логичным образом распре­деляют во втором секторе (В), затем в третьем (С) и четвертом (Д) секторах. Даже при рассеве бактериальной массы из коло­ний в секторе Д при таком спо­собе получают рост изолирован­ных колоний.

Методы, основанные на био­логических особенностях микроорганизмов. Направлены на подав­ление роста сопутствующей микрофлоры.

Прогревание: при выделении чистой культуры споро-образующего вида бактерий исследуемый материал прогревают при 80 °С 20 мин или кратковременно кипятят. Вегетативные клетки сопутствующей микрофлоры в этих условиях погибают, а споры искомого микроорганизма сохраняют жизнеспособность и прорастают после посева на питательные среды.

Использование селективных питатель­ных сред, которые содержат вещества, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры (антибиотики, красители и т. д.), — частый прием при исследовании контаминированного материа­ла. Однако необходимо учитывать, что селективные факторы ча­сто находятся не в бактерицидных, а в бактериостатических кон­центрациях, поэтому клетки сопутствующих микроорганизмов не растут, но остаются жизнеспособными на поверхности пита­тельной среды и при отвивке колоний исследуемой культуры на обычные среды могут быть причиной получения смешанной культуры.

При выделении чистых культур некоторых видов бактерий ис­пользуют их другие биологические особенности. Например, спо­собность микроорганизма расти при низких (листерии) или высо­ких (термофильные бактерии) температурах, которые лежат за пределами температурных диапазонов сопутствующих видов бак­терий. Для выделения культуры P. vulgaris используют способность данного вида давать ползучий рост (роение) на поверхности плот­ной питательной среды. С этой целью материал, содержащий P. vulgaris, засевают в конденсационную воду на дне пробирки со скошенным МПА, не касаясь поверхности среды. Сопутствующая микрофлора растет в нижней части питательной среды, а протей в виде прозрачной пленки распространяется вверХ.

Для выделения С. tetani материал засевают точечно на плот­ную питательную среду в чашках Петри и после выращивания отвивают культуру с периферии ползучего роста.

Культуральные свойства микроорганизмов. В процессе иденти­фикации наряду с другими свойствами у микроорганизмов изу­чают культуральные признаки — особенности роста на плотных, жидких и полужидких питательных средах при определенных ус­ловиях.

На плотных средах изучают колонии микроорганизмов. Бакте­рии каждого вида формируют колонии с определенными призна­ками, которые обычно учитывают при идентификации. Раз­мер колоний: крупные — диаметром 4. 6 мм и более, сред­ние—2. 4 мм, мелкие — 1. 2мм и точечные колонии диаметром менее 1 мм. Форма колоний может быть правильной круг­лой, неправильной (амебовидной, розеткообразной), корневид­ной (рис. 42). Цвет зависит от способности микроорганизма образовывать пигмент: белый, желтый, красный, сине-зеленый и т. д. Бактерии, не синтезирующие пигмент, формируют бесцвет­ные колонии. Учитывают характер поверхности, ко­торая может быть шероховатой, блестящей, матовой, сухой, влажной, гладкой, радиально или концентрически исчерченной. Края колонии могут быть ровными, волнистыми, зазубренны­ми, бахромчатыми, их исследуют невооруженным глазом и под малым увеличением микроскопа (рис. 43). Рельеф (про­филь) определяют, рассматривая колонию сбоку; различают плоские, конусообразные, куполообразные, плоские с конусо­видным центром или углублением в центре колонии, с утолщен­ными (валикообразными) краями (рис. 44). Учитывают про­зрачность колонии: непрозрачная, полупрозрачная, про­зрачная. Структура может быть однородной, зернистой, волокнистой и т.д. (рис. 45). Ее выявляют при слабом увеличе­нии микроскопа. Консистенция может быть пастообраз­ной, слизистой, плотной (сухой) и т.д.; ее определяют, дотраги­ваясь до колонии бактериологической петлей. Колонии некото­рых видов врастают в толщу питательной среды, что также определяют при помощи бактериологической петли. Запах: многие виды бактерий в процессе роста на питательных средах выделяют специфические ароматические вещества.



Ценную дополнительную информацию об особенностях стро­ения колоний дает их изучение в косопадающем пучке света (рис. 46). Культуры на прозрачной агаровой среде в чашках Пет­ри помещают на предметный столик бинокулярной лупы. Между бинокулярной лупой и источником света помещают зеркало от микроскопа вогнутой стороной вверх таким образом, чтобы лучи, отраженные от него, попадали в плоскость изучаемого объекта под углом 40. 45°. Зеркало устанавливают на равном удалении от объекта и источника света (12. 14 см). При таком осве­щении колонии бактерий могут быть окрашены в различные цве­та. Цвет зависит как от видовых особенностей, так и от состоя­ния культуры (S-, R-формы, см. тему 12).

В жидких средах учитывают следующие признаки: степень помутнения среды (интенсивное, среднее, слабое), на­личие или отсутствие пристеночного кольца на гра­нице мениска и внутренней поверхности пробирки, харак­тер поверхностной пленки (толщина, цвет, поверхность), характер осадка (обильный, скудный, ком­пактный, хлопьевидный, слизистый). При характеристике осадка пробирку слегка встряхивают и учитывают результат: осадок раз­бивается в гомогенную равномерную суспензию; образуются мелкие или крупные хлопья, глыбки; слизистый осадок при встряхивании обычно поднимается в виде косички. Пигментообразующие микроорганизмы вызывают окрашивание питательной среды и осадка (желтое, зеленоватое, красное и т. д.).

Определение количества бактерий. При характеристике разви­тия микробной популяции, санитарной оценке кормов, продук­тов питания, при вычислении показателя вирулентности микро­организма необходимо устанавливать количество микробных клеток в единице объема того или иного материала.

Определение общего количества микроорганизмов. Можно при­менять метод прямого счета и метод измерения светорассеяния.

Метод прямого счета: бактерии подсчитывают в камерах Горяева, Тома или в окрашенных мазках. В последнем случае 0,01 мл бактериальной суспензии микропипеткой нано­сят на предметное стекло и равномерно распределяют на 1 см2. Мазок фиксируют, окрашивают и подсчитывают клетки в 10. 15 полях зрения по диагонали квадрата. Определяют сред­нее число клеток в одном поле зрения. Делят 1 см 2 на площадь поля зрения, которую измеряют методом микрометрии (см. тему 1), затем частное умножают на среднее число микробных клеток в поле зрения, получают их количество в 0,01 мл взвеси бактерий.

Метод измерения светорассеяния считают более точным. Количество света, рассеиваемого суспензией бак­терий, пропорционально их концентрации. Этот показатель дос­таточно точно можно измерить при помощи фотоэлектроколориметра. Зависимость между оптической плотностью и концентра­цией клеток различна для бактерий разных видов. Поэтому при работе с таким прибором для каждого вида бактерий необходимо строить свою калибровочную кривую зависимости.

Например, в пробирку поместили 0,1 мл суспензии бактерий, содержащей неизвестное количество клеток. Для уравнивания оптической плотности исследуемой суспензии со стандартом мутности 10 ед. в пробирку добавили 0,9 мл физиологического раствора, т. е. исходную суспензию развели в 10 раз. Известно, что суспензия данного вида бактерий при оптической плотности 10 ед. содержит 1,3*10 9 кл/мл. Следовательно, концентрация ис­следуемой суспензии составляет 1,3*10 10 кл/мл.

Определение количества живых микроорганизмов. Метод осно­ван на выводе, что бактериальная колония — это результат деле­ния единичной клетки на плотной питательной среде (исключе­ние составляют бактерии, образующие цепочки из клеток).

Мерной пипеткой объемом 1 мл добавляют 1 мл культуры Е. coli в бактериологическую пробирку с 9 мл стерильного физио­логического раствора, подогретого до 37. 38 °С (разведение 10-1). Далее аналогичным способом готовят разведения культуры от 10 -2 до 10 -8 . Для каждого разведения используют новую пипетку того же объема и класса. Из пяти последних пробирок суспензию бактерий по 0,1 мл наносят на поверхность подсушенного МПА в две чашки Петри. Внесенный материал стерильным шпателем распределяют по поверхности питательной среды. Посевы инку­бируют при 37. 38 ºС 24 ч.

Учет результатов: в чашках Петри, где выросло более 150. 300 и менее 10 колоний, результаты не учитывают. Выбирают чашки Петри с параллельными посевами (из одного разведения), содер­жащими 10. 150 колоний. Подсчитывают колонии на чашках из одного разведения, суммируют, определяют среднее число коло­ний и с учетом степени разведения рассчитывают содержание жизнеспособных клеток (колониеобразующих единиц) в 1 мл исходной суспензии бактерий.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Провести пересев бульонной и агаровой культур бактерий на скошенный МПА и в МПБ в пробирках.

2. Провести посев смешанной бульонной культуры на МПА в чашках Петри по методу Дригальского.

3. Описать характер роста Е. coli, S. aureus, В. cereus на МПА (колонии) и в МПБ.

4. Определить количество микробных клеток в 1 мл бульонной культуры Е. coli методом прямого счета и при помощи стандарта мутности.

5. Провести посев бульонной культуры Е. coli на МПА в чаш­ках Петри с целью определения количества жизнеспособных клеток.

Контрольные вопросы

1. Что такое культура, смешанная культура, чистая культура, штамм и колония бактерий?

2. Какие методы применяют для получения чистых культур микроорганизмов?

3. Какие культуральные признаки учитывают при идентификации бактерий?

4. Какими методами определяют общее число микроорганизмов и количество жизнеспособных клеток?

Читайте также: