Для определения содержания в продуктах микроорганизмов производят посев методом серийных разведений
Обновлено: 05.10.2024
Позволяют количественно оценить чувствительность выделенного микроба к антибактериальным средствам и определить МИК препарата. Методы серийных разведений основаны на прямом определении величины МИК.
Для определения величины МИК заданные концентрации антибиотиков вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма. После инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.
В зависимости от характера используемой питательной среды различают метод серийных разведений в бульоне, метод серийных разведений в агаре.
В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют также методы серийных макро – и микроразведений.
Разновидностью метода серийных разведений является также метод, основанный на использовании только двух концентраций антибиотиков или даже одной концентрации, соответствующих пороговым (то есть концентрациям, отделяющим чувствительные микроорганизмы от промежуточных и промежуточные от резистентных). Метод обеспечивает получение качественных результатов, позволяющих отнести исследуемый микроорганизм к определенной категории чувствительности, и часто используется в коммерческих тест-системах.
Метод серийного разведения антибиотика в питательной среде (бульоне).
Первоначально готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотиков в специальном растворителе. Из него готовят ряд убывающих разведений антибиотиков в пробирках с бульоном (чаще двухкратные) и добавляют испытуемую культуру (обычно 10 5 -10 6 бактериальных клеток). Контролем служит пробирка с бульоном и культурой без антибиотиков. Сроки инкубации зависят от вида микроорганизма (чаще сутки). Определяют МИК, которая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста (прозрачная питательная среда). Для определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) из нескольких последних пробирок с задержкой роста делают посев петлей на сектора чашки Петри. За МБК, которая, как правило, на несколько разведений меньше МИК, принимают концентрацию препарата в последней пробирке, посев из которой не дал роста.
Метод серийных разведений в плотной питательной среде.
Этот метод более чувствителен и точен, чем метод бумажных дисков. Каждый антибиотик испытывают, как правило, в трех концентрациях (исходя из уровней чувствительности микроорганизмов), которые добавляют к расплавленному и охлажденному агару. Агар с антибиотиками разливают в чашки Петри. Контролем служит чашка с агаром без антибиотиков. Посев производят петлей или лучше штампом-репликатором, который позволяет одновременно определить чувствительность к трем концентрациям антибиотиков 25-50 культур (в зависимости от числа лунок в штампе). Учет роста в термостате осуществляют спустя сутки. Культура считается чувствительной, если на месте посева нет роста ни одной колонии.
- чувствительные культуры – их рост подавлен всеми тремя концентрациями (можно применять антибиотики в средней терапевтической дозе);
- среднечувствительные (можно применять антибиотики только в увеличенной дозе) – рост подавляют вторая и третья концентрация антибиотиков;
- умеренно-устойчивые подавляет только третья наиболее высокая концентрация (антибиотики применяют только местно);
- устойчивые (антибиотики применять нельзя по тестам in vitro) - растут на всех трех концентрациях.
Приготовление растворов антибиотиков. Различают основные растворы антибиотиков (пригодные для хранения) и рабочие — те, которые необходимо использовать ex tempore для приготовления питательных сред.
Для приготовления основных растворов антибиотиков используют субстанции препаратов с известной активностью; лекарственные формы непригодны. Для приготовления навесок антибиотиков следует использовать аналитические весы или другие равного класса точности.
Основные растворы антибиотиков готовят в концентрации 1000 мкг/мл и выше. Навески антибиотиков для приготовления основных растворов готовят с учетом их активности. Расчет навески антибиотика для приготовления основного раствора проводят по формуле
Масса навески = (Объем растворителя ∙ Необходимая концентрация):(Активность субстанции (содержание антибиотика))
В связи с тем что антибактериальные препараты существенно различаются по растворимости, в ряде случаев используют разные растворители, а для доведения их до заданной концентрации — разбавители. В тех случаях, когда растворители и разбавители являются разными веществами, для солюбилизации антибиотика необходимо использовать минимально возможное количество растворителя.
Основные растворы необходимо хранить при температуре не выше —20 °С (сроки хранения отдельных антибиотиков при этой температуре существенно различаются). Оптимальные условия для хранения основных растворов антибиотиков — температура —60 °С и ниже, продолжительность не более 6 мес. При этом необходимо иметь в виду, что основные растворы бета-лактамных антибиотиков могут терять активность и в более ранние сроки.
Извлеченные из холодильника флаконы с основными растворами не открывают и доводят до комнатной температуры для предотвращения конденсации влаги. Размороженные основные растворы должны быть использованы для приготовления рабочих растворов; повторное замораживание не допускается.
Из основных растворов готовят рабочие 2-кратные концентрации антибиотиков. За основу принимают конечную концентрацию антибиотика в питательной среде — 1 мкг/мл (более высокие — 2, 4, 8 и т. д.; более низкие — 0,5, 0,25, 0,125 и т. д.). При этом, рассчитывая реальные концентрации рабочих растворов, учитывают фактор разбавления раствора антибиотика в питательной среде (обычно 1 : 10). Для приготовления рабочих растворов используется дистиллированная вода. Диапазон концентраций зависит от целей исследования.
Метод серийных разведений в агаре. Приготовление чашек Петри с растворами антибиотиков. Сухую агаризованную питательную среду растворяют и автоклавируют в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования колбы с питательной средой помещают на водяную баню, где выдерживают до достижения 48…50 °С. После этого в них асептически вносят рабочие растворы антибиотиков (1 часть рабочего раствора антибиотика на 9 частей расплавленного агара) и при необходимости термолабильные питательные добавки. Затем среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри; толщина слоя должна быть 3…4 мм.
Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах при 4…8 °С в течение 5 сут, однако некоторые бета-лактамные антибиотики (прежде всего ампициллин, цефаклор, имипенем), особенно при низких концентрациях, не выдерживают даже указанный срок хранения. В этой связи стабильность антибиотиков в приготовленных в лаборатории чашках Петри целесообразно устанавливать экспериментально с использованием референтных штаммов.
Для контроля роста используют чашки Петри без антибиотиков.
Инокуляция, инкубация. Конечная посевная доза исследуемого микроорганизма на поверхности питательной среды должна составлять 10 4 КОЕ. Поскольку коммерческие инокуляторы или стандартная бактериологическая петля диаметром 3 мм переносят 1…2 мкл жидкости, концентрация микроорганизмов в исходной суспензии должна быть 10 7 КОЕ/мл.
Полученную суспензию необходимо инокулировать на поверхность агара в течение 15 мин после приготовления, при этом образуется пятно диаметром 5…8 мм.
После засева чашки Петри оставляют при комнатной температуре для подсыхания, затем переворачивают и инкубируют при 37 °С в течение 16…20 ч.
Для контроля качества приготовления суспензий периодически проводят подсчет реальных колониеобразующих единиц путем высева на неселективные питательные среды.
Важнейшим требованием контроля качества применения метода оценки антибиотикочувствительности является высев использованной для инокуляции суспензии на плотную неселективную среду (например, МПА) для контроля чистоты культуры.
Оценивать антибиотикочувствительностъ имеет смысл только при подтверждении чистоты культуры.
Учет результатов. Учет результатов проводят, поместив чашку на темную неотражающую поверхность. За МПК принимают концентрацию, вызвавшую полную ингибицию видимого роста. Для дифференцировки нежного роста от налета, оставшегося после инокулята, в ряде случаев целесообразно использовать лупу. Наличие единственной колонии на чашке с концентрацией на одно разведение выше, чем явная МПК, можно не учитывать.
Методы серийных разведений в бульоне. Различают два основных варианта метода серийных разведений в бульоне: макрометод (пробирочный) и микрометод (при величине конечного объема 0,2 мл и меньше).
Рабочие растворы антибиотиков для макро — и микрометодов готовят по одинаковой схеме, аналогичной той, которая была описана для метода серийных разведений в агаре. Отличие заключается в том, что для приготовления используют не дистиллированную воду, а жидкую питательную среду. Необходимо также рассчитать концентрацию рабочего раствора антибиотика так, чтобы после инокуляции конечная его концентрация была равна заданной.
Жидкую питательную среду, прошедшую предварительный контроль качества, готовят в соответствии с инструкцией изготовителя.
При постановке методов серийных разведений необходим контроль роста культуры в среде без антибиотика и качества с использованием референтных штаммов. Выбор референтного штамма определяется видом исследуемого микроорганизма. Необходимо также контролировать чистоту суспензии микроорганизма, использованной для инокуляции, путем высева на неселективные среды.
Макрометод серийных разведений в бульоне. Наиболее распространен следующий способ.
Рабочие растворы антибиотиков в жидкой среде, приготовленные в асептических условиях в концентрациях, в 2 раза превышающих заданные, вносят по 1 мл в пробирки.
Суспензию исследуемого микроорганизма готовят из бульонной или агаровой культуры на стерильном изотоническом растворе. Затем ее разводят в жидкой питательной среде до концентрации 10 6 КОЕ/мл и вносят по 1 мл в пробирки с растворами антибиотиков. Таким образом, конечная концентрация микроорганизмов в инкубационной среде будет равна 5 ∙ 10 5 КОЕ/мл.
Пробирки закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками или металлическими колпачками, инкубируют при 37 °С в течение 16…20 ч.
Микрометод серийных разведений в бульоне. Метод серийных разведений в бульоне легко поддается модификациям для разработки коммерческих тест-систем. При использовании коммерческих тест-систем следует пользоваться инструкциями изготовителей.
Постановка метода в системах, изготовленных в лабораторных условиях, во многом сходна с методом серийных макроразведений. Наиболее удобно для постановки метода в лабораторных условиях использовать 96-луночные планшеты для иммунологических исследований. Значительным преимуществом метода микроразведений является возможность одновременно применять достаточное количество планшетов, хранить их и использовать по мере необходимости.
Первым этапом является изготовление планшетов, пригодных для хранения. Концентрацию рабочих растворов антибиотиков, вносимых в лунки планшетов, рассчитывают исходя из схемы последующей инокуляции, которая должна основываться на необходимости создания в лунке конечной концентрации исследуемого микроорганизма 5 ∙ 10 5 КОЕ/мл. После внесения рабочих растворов антибиотиков в лунки запаянные в полиэтилен планшеты могут храниться при температуре ниже —60 °С до момента использования. Повторное замораживание не допускается.
Для проведения исследования планшеты после извлечения из холодильника выдерживают до достижения ими комнатной температуры. Суспензию исследуемого микроорганизма готовят из агаровой или бульонной культуры и доводят до заданной концентрации.
Инокуляцию проводят в течение 15 мин после приготовления суспензии. Инкубацию осуществляют при 37 °С в течение 16…20 ч. Для предотвращения высыхания содержимого лунок планшеты закрывают крышкой.
Учет результатов при постановке макро — и микрометодов проводят визуально по появлению видимой мутности или спектрофотометрически. За МИК принимают минимальную концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста.
Общие замечания по методам серийных разведений. Несмотря на то что методы серийных разведений наиболее точные и информативные, их постановка в практических лабораториях сопряжена с определенными методическими трудностями: необходимость использования антибиотиков с четко известным уровнем активности, соблюдения жестких низкотемпературных режимов хранения, контроля качества питательных сред и трудоемкость приготовления рабочих растворов антибиотиков.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.
Результат учитывают по наличию или отсутствию роста микробов в опытных пробирках. МИК антибиотика соответствует концентрации его в последней пробирке, где отмечается задержка роста исследуемой культуры. Затем, по таблице определяют степень чувствительности микроба к антибиотику. Если рост микробов отмечают во всех пробирках, то штамм устойчив к максимальной взятой в опыт концентрации антибиотика. Если микробы не выросли во всех пробирках, кроме контрольной, то МИК антибиотика в отношении данного микроорганизма меньше используемой концентрации.
Метод серийных разведений в плотных средах для определения чувствительности к антибиотикам ( антибактериальным средствам ). Диффузионные методы. Метод дисков.
Диффузионные методы. Метод дисков.
Диффузионные методы менее точны, чем методы разведений, но более просты в исполнении и позволяют определять чувствительность к нескольким ЛС одновременно. Поэтому их чаще применяют на практике. Исходный метод. Чашки Петри заполняют питательной средой, соответствующей пищевым потребностям возбудителя, слоем в 4-5 мм.
После застывания агар подсушивают в термостате при 37 "С в течение 20 мин. Посев тест-культуры можно осуществлять внесением в полуостывший агар, но чаще микробную взвесь наслаивают на агар. После равномерного распределения по поверхности излишки взвеси удаляют, а чашки подсушивают в термостате. В агаре пробивают лунки и в каждую вносят по 0,1 мл раствора исследуемых препаратов, после чего инкубируют 18 ч при 37 °С (срок инкубации может варьировать в зависимости от скорости роста микроорганизма). Активность учитывают, измеряя диаметр зоны подавления роста для каждого препарата.
Метод дисков. В настоящее время вместо классического (исходного) метода повсеместно применяют модификацию, предложенную Кирби и Бауэром и признанную стандартным тестом. После посева тест-культуры на агар наносят диски из фильтровальной бумаги, пропитанные различными антимикробными препаратами (используют коммерческие образцы, содержащие известные концентрации). После инкубации при 37 "С в течение времени, необходимого для роста выделенного возбудителя, проводят определение диаметра зоны торможения роста. Размеры зон, полученные в опыте, сравнивают с величинами зон задержки роста, указанными в инструкциях, прилагаемых к дискам, после чего выделенные микроорганизмы относят к чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным.
Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.
Читайте также: