Инвитро саженцы микроклонального размножения
Обновлено: 19.09.2024
Для семенных растений характерно два способа размножения: семенной и вегетативный. Оба эти способа имеют как преимущества, так и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести, в первую очередь, генетическую пестроту получаемого посадочного материалa и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной.
Это обусловлено следующими причинами:
- не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.);
- практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10—15 лет;
- не всегда удается получать стандартный посадочный материал (возможность накопления и передачи инфекции);
- трудоемкостью и сложностью операций при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок;
- неэффективностью разработанных технологий для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года.
Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.
Этот метод, несомненно, имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:
- получение генетически однородного посадочного материала;
- освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;
- высокий коэффициент размножения (105—106 — для травянистых, цветочных растений, 104—105 — для кустарниковых древесных, 104 — для хвойных);
- сокращение продолжительности селекционного процесса;
- ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
- размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
- возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;
Первые достижения в области клонального микроразмножения были получены в конце 50-х годов XX столетия французским ученым Жоржем Морелем, которому удалось получить первые растения-регенеранты орхидей. Успеху Ж. Мореля в микроразмножении способствовала уже разработанная к тому времени техника культивирования апикальной меристемы растений в условиях in vitro. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы, одуванчика, салата и изучали влияние состава питательной среды на процессы регенерации и формирования растений. Ж. Морель в своих работах также использовал верхушку цимбидиума (сем. орхидные) состоящую из конуса нарастания и двух-трех листовых зачатков, из которой при определенных условиях наблюдал образование сферических сфер — протокормов. Сформировавшиеся протокормы можно было делить и затем культивировать самостоятельно на вновь приготовленной питательной среде до образования листовых примордиев и корней. В результате им было обнаружено, что этот процесс бесконечен и можно было получать в большом количестве высококачественный и генетически однородный, безвирусный посадочный материал.
В России работы по клональному микроразмножению были начаты в 60-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Под руководством чл.-корр. РАН, академика РАСХН Бутенко Р. Г. были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы, фрезии и некоторых других растений и предложены промышленные технологии. Таким образом, первые успехи в клональном микроразмножении связаны с культивированием апикальных меристем травянистых растений на соответствующих питательных средах, обеспечивающих в конечном итоге получение растений-регенерантов.
Однако область применения микроразмножения разнообразна и имеет тенденцию к постоянному расширению. Это в первую очередь относится к размножению in vitro взрослых древесных пород, особенно хвойных, и использование техники in vitro для сохранения редких и исчезающих видов лекарственных растений. В настоящее время в этом направлении наметился положительный сдвиг.
Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов XX столетия и связаны с именем французского ученого Готре.
В них сообщалось о способности камбиальных тканей некоторых видов вяза и сосны к каллусогенезу in vitro. В последующих работах 40-х годов было выяснено о способности различных тканей вяза листового к образованию адвентивных почек. Однако дальнейший рост и формирование побегов авторами не были получены. Лишь к середине 60-х годов Матесу удалось получить первые растения-регенеранты осины, которые были доведены до почвенной культуры. Культивирование тканей хвойных город in vitro долгое время использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования ювенильных и тем более взрослых тканей, изолированных с растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные, характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и другие вещества), которые в изолированных тканях окисляются различными фенолазами. В свою очередь, продукты окисления фенолов обычно ингибируют деление и рост клеток что ведет к гибели первичного экспланта или к уменьшению способности тканей древесных пород к регенерации адвентивных почек которая с возрастом растения-донора постепенно исчезает полностью. Однако, несмотря на все трудности, ученые все чаще используют в качестве объектов исследований различные ткани и органы древесных растений В настоящее время насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, осина, гибриды тополей с осиной, сосна, ель, секвойя и др.), а работы в этом направлении ведутся в научных учреждениях Москвы, Санкт-Петербурга, Воронежа, Уфы, Новосибирска, Архангельска, Киева, Одессы, Ялты и др.
Этапы микроклонального размножения растений
Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:
1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.
2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.
3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2оС, +10оС).
4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.
Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.
На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100—200 мг/л. Это в первую очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается тенденция к накоплению внутренней инфекции.
На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. В тех случаях, когда наблюдается ингибирование роста первичного экспланта, за счет выделения им в питательную среду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), снять его можно, используя антиоксиданты. Это возможно двумя способами: либо омывкой экспланта слабым его раствором в течение 4—24 ч, либо непосредственным добавлением в питательную среду. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую кислоту (1 мг/л), глютатион (4—5 мг/л), дитиотриэтол (1—3 мг/л), диэтилдитиокарбомат (2—5 мг/л), поливинилпирролидон (5000—10000 мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент - древесный активированный уголь в концентрации 0,5—1%. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.
2 этап — собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.
Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов—ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.
При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5—10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Вместе с тем, возможно наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Н.В. Катаевой и Р.Г. Бутенко, путем использования питательных сред с минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающих стабильный коэффициент микроразмножения, или путем чередования циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов.
3 и 4 этапы — укоренение микропобегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5—1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют β-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК.
Укоренение микропобегов проводят двумя способами:
1) выдерживание микропобегов в течение нескольких часов (2—24 ч) в стерильном концентрированном растворе ауксина (20—50 мг/л) и последующее их культивирование на агаризованной среде без гормонов или непосредственно в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка);
2) непосредственное культивирование микропобегов в течение 3—4 недель на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1—5 мг/л в зависимости от исследуемого объекта). В последнее время предложен метод укоренения пробирочных растений в условиях гидропоники. Этот метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям. Для картофеля возможно использовать безсубстратную гидропонику для получения мини-клубней. Затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной материей или добавление в питательную среду активированного угля способствует укоренению микропобегов.
Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений — весна или начало лета.
Растения с двумя-тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85—90° С в течение 1—2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1); торф, дерновую почву, перлит (1:1:1); торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют семейство орхидных, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1).
Приготовленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20—22° С), освещенностью не более 5 тыс. лк и влажностью 65—90%. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений.
Через 20—30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения подкармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасига и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным минеральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизированных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для каждого индивидуального вида растений.
Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Эти явления связаны, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтому целесообразно на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите растений от патогенов.
Индийскими учеными предложен простой метод предотвращения быстрого обезвоживания листьев растений, выращенных in vitro, во время их пересадки в полевые условия. Метод заключается в том, что листья в течение всего акклиматизационного периода следует опрыскивать 50%-ным водным раствором глицерина или смесью парафина, или жира в диэтиловом эфире (1:1). Применение этого метода помогает избежать длинных и затруднительных процессов закаливания пробирочных растений и обеспечивает 100%-ную их приживаемость.
Методы клонального микроразмножения
Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году, процесс можно осуществлять следующими путями:
1. Активация пазушных меристем.
2. Образование адвентивных побегов тканями экспланта.
3. Возникновение адвентивных побегов в каллусе.
4. Индукция соматического эмбриогенеза в клетках экспланта.
5. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани.
6. Формирование придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (деление первичных эмбриоидов).
Н.В. Катаева и Р.Г. Бутенко (1983) выделяют два принципиально различных типа клонального микроразмножения:
1. Активация уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля).
2. Индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo :
а) образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта;
б) индукция соматического эмбриогенеза;
в) дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.
Основной метод, использующийся при клональном микроразмножении растений - активация развития уже существующих в растении меристем. Он основан на снятии апикального доминирования.
Этого можно достичь двумя путями: а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной среде; б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин) и зеатин.
Мы предлагаем вашему вниманию посадочный материал декоративных и плодовых культур, полученный посредством микроклонального размножения, следующих категорий:
-Микрорастения in vitro. Укорененные микрорастения на питательной среде в пластиковой таре.
-Адаптированные саженцы. Адаптированные микрорастения с
закрытой корневой системой, выращенные в условиях защищенного грунта.
Категория посадочного материала
Отгрузка адаптированных растений в кассетах осуществляется в таких гофрокоробах.
Аквариумные культуры предлагаются только in vitro. Растения, в зависимости от вида, высаживаются в оптимальном количестве до полного заполнения объема контейнера.
Контейнер 120 мл вмещает 5-10 растений.
Контейнер 250 мл — 12-20 растений.
В разделе Каталог растений вы можете ознакомиться с нашим ассортиментом и сделать заказ, воспользовавшись формой заказа и нашими контактными данными.
Выращивание микрорастений в стандартизированных условиях обеспечивает высокую степень однородности посадочного материала между различными партиями, что дает возможность нашим клиентам более точно планировать объемы и сроки посадок.
Герметичная пластиковая тара и питательный субстрат, в котором выращиваются микрорастения, дают возможность транспортировки продукции на дальние расстояние с сохранением жизнеспособности и посадочных качеств микрорастений, что подтверждается широкой географией наших постоянных клиентов. Компактность упаковки и небольшой вес контейнеров значительно уменьшают транспортные расходы.
Особенности данного способа размножения позволяют в сжатые сроки получать омоложенный оздоровленный посадочный материал как старых, но не теряющих свою актуальность, сортов так и селекционных новинок.
Основной сложностью при работе с микрорастениями является процесс их адаптации к естественным условиям. Проведение адаптации микрорастений требует определенных навыков и наличия теплиц для первичного доращивания растений in vitro. Адаптация производится в условиях повышенной влажности и с применением других специальных мер по уходу (см. рекомендации по посадке и уходу здесь). Требуемые условия необходимо соблюдать в первые 3-5 недель (в зависимости от вида растений) после высадки микрорастений в субстрат. Допустимый выпад (гибель) микрорастений при соблюдении оптимальных условий адаптации составляет 5 – 10% в зависимости от культуры и сорта.
Ключевым потребителем продукции категории "микрорастения in vitro" являются тепличные хозяйства, располагающие зимними отапливаемыми теплицами (агрофирмы, тепличные комбинаты, питомники, фермерские хозяйства и т.д.).
Также мы производим микрорастения флоксов in vitro неукоренненные - in vitro Н.У.
В этой категории мы предлагаем микрорастения флоксов in vitro н/у для непосредственной высадки в теплицу.
Совмещение стадий укоренения и адаптации микропобегов флоксов открывает возможность увеличения эффективности производства для этой культуры и позволяет значительно сократить сроки получения готовых растений.
Что мы делаем, если хотим посадить на своем участке то или иное растение? Обычно мы покупаем семена или готовую рассаду для выращивания трав и овощей, саженцы – для посадки кустарников и деревьев, рассаду или луковицы – для выращивания цветов. Часто ли мы задумываемся над тем, каким образом получена рассада? Оказывается, помимо традиционных черенкования, прививок, выращивания из семян, размножения корневищами, луковицами и т.д. в большинстве стран рассаду многих растений сегодня получают путем микроклонального размножения. Особенно широко этот способ применяется для выращивания растений, которые плохо поддаются размножению другими способами. Также этот метод незаменим, если необходимо постоянно получать в достаточно короткие сроки значительное количество качественной рассады.
С помощью микроклонального размножения (другое название метода – меристемное размножение) выращивают декоративные и плодово-ягодные растения, комнатные и срезочные цветы, картофель и прочие овощи.
Микроклональное размножение растений широко применяется в США, Голландии, Польше, Франции, Японии, Таиланде. В России также накоплен большой опыт по меристемному размножению важных для сельского хозяйства видов растений. Практически во всех российских научно-исследовательских институтах и селекционных центрах созданы лаборатории для микроклонального размножения и оздоровления селекционного материала. Относительно недавно меристемные технологии начали применяться крупными питомниками растений и сельхозпредприятиями. В России наиболее широкое применение меристемная технология пока нашла в получении здоровых семян картофеля.
О методе
Меристема (от греч. meristos — делимый) — это ткань растений, в течение всей жизни сохраняющая способность к образованию новых клеток. Именно за счет меристемы растения растут, образуют новые листья, стебли, корни, цветки.
В процессе роста меристемная ткань в определенной степени сохраняется в некоторых частях растения: в узлах побега, в почках, в кончиках корней, в основаниях черешков листьев или цветоносах и т.д.
Читайте также: