Изолированные протопласты растений их получение и культивирование

Обновлено: 05.10.2024

Рефераты и конспекты лекций по географии, физике, химии, истории, биологии. Универсальная подготовка к ЕГЭ, ГИА, ЗНО и ДПА!

Изолированный протопласт - это растительная клетка, лишенная клеточной стенки ферментативным или механическим способом.

Культура изолированных протопластов это один из самых современных методов, который используется в генетике, физиологии, вирусологии и молекулярной биологии для получения соматических гибридов между удаленными в систематическом отношении видами или при половой несовместимости, для получения новых форм растений путем введения в клетку чужеродного генома или его части .

Отсутствие оболочки облегчает поступление в клетку различных физиологически активных веществ и позволяет наблюдать за первичной реакцией клетки на воздействие этих веществ, исследовать метаболизм в контролируемых условиях. Так как в изолированных протопластов сразу начинается регенерация клеточной оболочки, то они очень удобным объектом для изучения формирования целлюлозных микрофибрилл.

Протопласты высших растений можно получать механическим и / или ферментативным методом.

Впервые протопласты были выделены Клеркером в 1892 году при изучении плазмолиза из тканей листа водного растения телорез (Stratiotes aloides). Он сначала плазмолизував растительные ткани, а затем удалял клеточную стенку. Таким методом можно выделить протопласты с эпидермиса лука (в 0,1 М растворе сахарозы). Если после плазмолиза разрезать лезвием полоску эпидермиса, то протопласты будут выходить в среду, содержащего осмотическое стабилизатор. Такой метод выделения протопластов называются механическим или физическим.

Несмотря на модификации и усовершенствования механический метод и сегодня имеет определенные ограничения:

1) этим методом можно выделить только небольшое количество протопластов;

2) используются только те ткани, в которых происходит интенсивное плазмолиз, т.е. те которые имеют вакуолизирован клетки паренхимных типа;

3) метод длительный и трудоемкий, а потому сейчас используется очень редко.

Сегодня широко применяется ферментативный или химический метод выделения изолированных протопластов. В этом случае для разрушения клеточной стенки используются смеси ферментов. К первым работам по ферментативному выделению протопластов можно отнести опыты, в которых протопласты клеток гриба были изолированы в результате обработки клеточных стенок желудочным соком улитки Helix pomatia (1919).

Впервые протопласты из клеток высших растений энзиматическим методом выделил Кокинг в 1960 году. Он выделил протопласты из корешков проростков томатов, обрабатывая их гидролитическим ферментом (целлюлазой) с культуральной жидкости плесневых грибов Myrothecium verrucaria.

Ферментативный способ имеет большие преимущества, потому что он дает возможность получать значительные количества неповрежденных протопластов из любого органа или ткани, и сравнительно быстрый.

На сегодня протопласты получают из однодольных и двудольных растений, используя листья, побеги, колеоптиль, клубни, плоды, пыльца, каллусных культур. Для выделения протопластов, как правило, используют молодые растения. Предпочтение отдается растениям, которые выросли в стерильных условиях in vitro. В исследованиях ряда авторов (Хромова и др., 1984; Chaoxi et al., 1987; MC Tan et al., 1987) показано, что на жизнеспособность изолированных протопластов, и их способность к регенерации клеточной стенки, к разделов, образования микроколоний влияет физиологический состояние исходного материала, который определяется условиями культивирования. Кроме того, от физиологического состояния исходного материала зависела способность ткани к мацерации. Наилучшие результаты были получены при выращивании растений на среде с пониженным содержанием сахарозы (0,5%) и затмении растений перед выделением протопластов. Или при выращивании исходных растений при низкой интенсивности света (1500 - 2000 Лк) и коротком фотопериода (6 г). Исследователи объясняют увеличение количества жизнеспособных протопластов тем, что при слабом освещении или в среде с низким содержанием сахарозы резко снижается интенсивность фотосинтеза, в результате чего уменьшается содержание свободных сахаров и клетки синтезируют тонкую клеточную стенку, которая содержит меньше пектина. Относительно значения или влияния выращивания исходного материала при низких плюсовых температурах на выход изолированных протопластов, то данные противоположны: MC Tan (1987) отмечает увеличение количества изолированных протопластов при таких условиях, тогда как Хромова с сотр. (1984) отмечают, что снижение температуры в период культивирования исходных растений не приводило к повышению эффективности процесса получения жизнеспособных протопластов, активно делятся.

При выделении протопластов из культуры тканей (Калюс или клеточная суспензия) необходимо учитывать:

1) возраст исходной ткани в цикле выращивания: лучше использовать ткань, которая находится на стадии раннего экспоненциального роста, когда в популяции значительное количество клеток, которые способны начать разделение;

2) особенности роста ткани - для выделения протопластов лучше использовать рыхлую, недифференцированную ткань, которая образует небольшие агрегаты клеток при культивировании в жидкой среде.

Важное значение для успешного выделения жизнеспособных, нативных протопластов имеет подбор осмотического стабилизатора. С наличием клеточной стенки у растительной клетки связана регуляция ее водообмена. Как известно, сосущие силу формируют не только осмотические свойства клетки, но и тургорного давление. С увеличением количества воды в клетке возрастает тургорного давление и, соответственно, уменьшается ее сосущая сила. Процесс поступления воды в клетку прекращается полностью, когда тургорного давление становится равным осмотическому давлению. Таким образом, структурная организация клетки, которая включает протопласт и клеточную стенку, формирует саморегуляторные механизмы водообмена.

Поэтому для изолированных протопластов, лишенных клеточной стенки особое, очень важное значение имеют осмотические свойства среды выделения и культивирования. Как осмотические стабилизаторы используют сахара - глюкозу, сахарозу, маннит, сорбит, ксилозу и иногда ионные осмотикы - растворы солей Са02, KCl, Na2HPÜ4. Маннит используют чаще, чем сорбит так как он имеет слабую проникающую способность в клетки, проникновение в клетки сорбита сопровождается и проникновением ферментов. Используют смесь маннита и сорбита. Использование в ферментных системах растворов глюкозы и сахарозы создает условия близки к условиям культивирования, хотя эти сахара активно проникают через мембрану. В тех случаях, когда использование сахаров не дает хороших результатов, как осмотические стабилизаторы используют растворы солей. Хотя известно, что соли имеют большую проникающую способность, чем сахара, и снижают активность некоторых гидролитических ферментов. Растворы макро-и микросолей часто берут за основу которой добавляют другие физиологически активные вещества. Это смягчает процесс выделения протопластов. Особенно когда он длительный, и приближает его к условиям культивирования ткани в суспензии. Неправильный выбор осмотического агента может привести к разрыву плазмалемме или вызвать спонтанное слияния протопластов и образование многоядерных клеток. Оптимальным для выделения протопластов является 0,3 - 0,8 М растворы.

Для ферментативного разрушения клеточной стенки используют препараты трех типов - целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназу, получаемых из культур разных грибов (Myrothecium verrucaria, Trichoderma viride, Aspergillus и др.), а также пищеварительного сока улитки Helix pomatia. Чаще всего используют целюлазни препараты "Onozuka", "Driselase" и препараты пектиназу - "Macerozyme", "Pectinase" или "Pectinol". Действие этих ферментов направлена на разрушение основных компонентов клеточной стенки. У растений это целлюлоза, гемицеллюлоза и пектиновые вещества. Целлюлозные молекулы, которые собраны в микрофибрилл, формируют рыхлый, но крепкий структурный остов. Он погружен в аморфный матрикс, состоящий из гемицеллюлозы, пектиновых веществ и белков.

В первичной клеточной стенке на долю целлюлозы приходится до 30% от сухой массы и столько же на пектиновые вещества, 40% составляют гемицеллюлозы. Эти соотношения могут варьировать в клетках разных типов ткани зависимости от функциональных особенностей, возраста, наличия вторичных утолщений. Поэтому комбинации ферментных препаратов и их соотношение специфичны для каждого типа клеток. Так для получения протопластов из ткани плодов, которые обычно имеют высокое содержание пектина, особенно подходит пектиназу. Тогда как, при выделении протопластов с мезофилы листа следует использовать смесь пектиназу и целлюлазы - фермента, разрушающего целлюлозные компоненты клеточной стенки.

Оптимальные условия для выделения протопластов очень индивидуальны для разных тканей, а потому в каждом случае необходимо подбирать состав смеси ферментов, их концентрации и соотношения, а также продолжительность обработки. Выделенные протопласты должны контактировать с ферментом минимальное время, а затем их нужно тщательно отмыть.

Время выделения протопластов зависит от концентрации фермента. При больших концентрациях продолжительность инкубации составляет 1 - 4 ч, при невысоких -12 - 20 ч, оптимальные условия рН 5 - 6, температура 23 - 26 ° С. Иногда необходимо слабое покачивание течение инкубации с ферментом.

Протопласты растительных клеток как объект биологического конструирования

Способы получения и культивирования протопластов

Выделение протопластов

невысокая производительность,
можно использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом,
трудоемкость и длительность.

Другой метод выделения протопластов - энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 году Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 году Коккинг обработал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом.

одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн. из грамма ткани или клеток),
клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу,
клетки не повреждаются,
метод сравнительно быстрый.

Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток.

обработка ферментами,
выделение протопластов из клеточных стенок,
отделение интактных протопластов от клеточных осколков.

Стандартная методика протопластов (по Такебе) из тканей листа Nicotiana tabacum:

Зрелый, сформировавшийся лист отделяют от взрослого растения в возрасте 60 - 80 дней, окунают в 70% этанол, а затем помещают на 15 - 20 минут в 10% раствор гипохлорита кальция и многократно промывают дистиллированной водой. С помощью пинцета нижний эпидермис снимают, очищенные от эпидермиса листья разрезают скальпелем на небольшие кусочки площадью 4 кв. см. Для лучшего снятия эпидермиса листья должны немного подвянуть, можно также ограничить снабжение водой перед срезанием листьев.

Далее ткань обрабатывают последовательно или одновременно пектиназой, вызывающей мацерацию, и целлюлазой, разрушающей клеточные стенки. Оптимальная концентрация ферментов, как и время обработки, индивидуальны для разных тканей. Протопласты должны находиться в растворе ферментов минимальное количество времени, после чего следует тщательная промывка. Ферменты стерилизуют через бактериальные фильтры.

Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки. Когда протопласт "голый", один из компонентов регуляции водообмена теряется, поэтому важное значение приобретают осмотические свойства среды выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит, ксилозу), ионные осмотики (CaCl₂, KCl) в концентрации 0,3 - 0,8 моль/литр. Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта.

Удобнее обрабатывать ткани ферментами в чашке Петри, которую держат под углом 15 о . Смесь ферментов с протопластами переносят в центрифужные пробирки. Отделить протопласты от ферментативной смеси можно двумя способами: либо фильтрация с центрифугированием, либо флотация.

При фильтрации смесь пропускают через фильтры с размерами пор 40 мкм. На фильтре при этом остаются комки клеток и их большие осколки. При дальнейшем центрифугировании оседают протопласты, осколки остаются в супернатанте. При повторном центрифугировании идет отмывка от фермента, после чего протопласты переносятся в среду для культивирования.

Метод флотации предложен О. Гамборгом с сотрудниками в 1981 году, и предназначается для ослабленных протопластов. Он основан на том, что протопласты имеют более низкую плотность, чем органеллы или остатки клеточных стенок. К исходной смеси добавляют раствор сахарозы и центрифугируют при скорости от 40 – 80 до 350 g. Чистые протопласты плавают, осколки оседают на дно.

Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных культур. Лучше всего - в поздней стадии логарифмического роста, когда клеточные стенки легче поддаются разрушению, протопласты наиболее жизнеспособны.

Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического стабилизатора, неорганических соединений, источника углерода, азота, витаминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды 5,4 - 5,8, температура 22 - 28 о С, невысокая освещенность (не более 2000 лк).

Способы культивирования протопластов

Существуют два способа культивирования протопластов: метод жидких капель и метод платирования.

В первом случае суспензию протопластов в виде капель помещают на пластиковые чашки Петри. Вариацией этого способа является культивирование единичных изолированных протопластов в микрокаплях объемом 1 мкл, предложенное Ю. Глебой в 1978 г.

Во втором - суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же среды с 1% агаром при температуре не выше 45 о С. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28 о С. В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта: формированием клеточной стенки, делением, ростом и развитием растения. Вариантом этой техники является использование кормящих протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или γ-излучения, что блокирует их способность к делению. Такие протопласты или клетки смешивают с жизнеспособными протопластами и они поддерживают и стимулируют их рост.

Сразу после удаления раствора фермента начинается образование клеточной стенки. Труднее добиться деления клеток и регенерации растений. Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез, либо через развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого добавлением в среду ауксинов или сочетания ауксинов с цитокининами.

Процессы и технологии, рассматриваемые нами до настоящей лекции в основном относились к разделу биотехнологии, называемому “Промышленная микробиология” или “Технология микробиологических производств”, и основывались на использовании метаболитических процессов в различных простейших, одноклеточных микроорганизмах (бактериях, дрожжах, микрогрибах). Во многом эти технологии можно назвать технологиями “вчерашнего дня”. Определяющими направлениями как современной биотехнологии так и биотехнологии будущего, являются клеточная и генетическая инженерия, возникшие за последние 30-40 лет

Клеточная инженерия

Основным объектом клеточной инженерии являются протопласты.Они представляют собой растительные животные или иные клетки, полностью лишенные клеточной оболочки, но сохраняющие способностью осуществлять активный метаболизм, а также реакции биосинтеза и трансформации энергии. Их внутриклеточное содержимое ограниченно только цитоплазматической мембраной. Поэтому протопласты являются уникальной моделью для цитологических и биохимических исследований, и получения новых не существующих в природе организмов с необычными свойствами..

Получение протопластов

Принципиально отличающимся методом является ферментативный способ получения протопластов, при котором клеточная стенка удаляется с помощью ферментов. Таким методом уже в 1919 г. были получены протопласты клеток грибов в результате обработки их клеточных стенок ферментным комплексом, содержащимся в желудочном соке виноградной улитки Helix pomatia.Некоторые виды актиномицетов так же способны продуцировать ферменты лизирующие оболочки различных эукариотических клеток, в частности грибов. В микробиологических экспериментах протопласты получались путем разрушения клеточных стенок бактерий ферментом лизоцимом, выделяемым из белка куриных яиц. Изолирование протопластов растительных клеток с использованием ферментных препаратов было осуществлено в I960г. Е. Коккингом (Великобритания). Для получения протопластов наиболее пригодны клетки находящиеся в логарифмической стадии (Log-фазе) роста клеточной культуры.

По сравнению с механическими способами ферментативные методы получения протопластов имеют определенные преимущества:

1) можно одновременно получить большое количество протопластов;

2) формирующиеся протопласты не подвергаются сильному осмотическому

3) клетки остаются менее поврежденными;

4) метод сравнительно быстрый.

Для удаления клеточной стенки при получении растительных протопластов используются ферментные препараты трех типов – целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Действие этих ферментов состоит в деструкции основных компонентов клеточной стенки, обеспечивающих ее механическую прочность (ригидность). У растительных клеток этими компонентами являются целлюлоза, гемицеллюлоза и пектиновые вещества, которые находятся в клеточной стенке в различных соотношениях. Поэтому комбинации ферментных препаратов и их количественные соотношения и время обработки должны эмпирически подбираться для каждого конкретного случая (т.е. в зависимости от вида растения, его возраста и органа, из которого берется материал для получения протопластов). Формирующиеся протопласты должны находиться в контакте с ферментами минимальное время, после чего их необходимо тщательно отмыть. При этом на всех стадиях необходимо поддерживать жесткие асептические условия. Стерилизация используемых ферментных растворов производится, как правило, путем фильтрования через бактериальные фильтры. Поскольку протопластированные клетки лишены жесткой оболочки, то они становятся очень чувствительными к перепадам концентраций различных веществ внутри клетки и снаружи, в культуральной среде (осмотический шок). Поэтому для отмывки от ферментов нельзя использовать дистиллированную воду, а культивирование протопластов осуществляют на специально подобранных, так называемых гипертонических средах, содержащих различные осмотические стабилизаторы (обычно сорбитол, маннитол в концентрации примерно 125 мг/л). Кроме осмотических свойств среды должны быть подобраны и другие условия. Например, протопласты чаще всего получают в темноте или при слабом освещении. Температурные условия могут варьировать в пределах; 22-28 0 С, стабильности протопластов в определенной степени способствуют высокие концентрации двухвалентных ионов кальция и магния, воздействующих на мембранные системы клетки. Значение рН среды для культивирования протопластов должно быть в проделах 5,5-5,8. Уменьшение рН среды до 3.5 приводит к быстрому (за несколько минут) разрушению и гибели протопластов большинства видов растений.

Культивирование протопластов

Для культивирования протопластов используются два методических приема: инкубирование в каплях жидкой среды и помещение в агаровый слой. Естественно, что каждый из них имеет свои преимущества и свои недостатки.

В первом случае обеспечивается хороший обмен газами через воздушную фазу и легкая диффузия в раствор выделяемых продуктов обмена. Помимо этого, к растущим протопластам можно легко добавлять свежую питательную среду в желаемых концентрациях. Однако при этом способе протопласты имеют тенденцию агрегировать в центре капли, что препятствует наблюдению за судьбой индивидуальных колоний протопластов.

В соответствии со вторым методом определенный объем взвеси протопластов в жидкой среде добавляется к равному объему 1%-ной расплавленной и охлажденной агаризованной среды того же состава. После уплотнения (затвердевания) среды протопласты оказываются разобщенными друг от друга и фиксированными в одном положении, что обеспечивает наблюдение за развитием индивидуальных протопластов – формирование клеточной стенки, деление клеток и дальнейшие превращения. Недостатком метода является возможность механического повреждения протопластов при смешивании с агаром, а также температурные воздействия расплавленной среды при ее недостаточном охлаждении.

Существуют различные усовершенствованные модификации описанных выше методов культивирования протопластов. Удобным методом является культивирование протопластов в малом объеме жидкой питательной среды (до 1 мкл), метод получил название микроизоляции отдельных протопластов.

Очень важной проблемой клеточной инженерии растительных организмов является регенерация протопластов. Синтез клеточной стенки у образовавшихся протопластов практически начинается сразу после удаления раствора ферментов, вызвавших ее деструкцию, что можно относительно легко наблюдать с помощью флюоресцентного микроскопа. Для предотвращения преждевременной регенерации в питательную среду вводят кумарин в концентрации 200-250 мг/л. Если регенерация клеточных стенок – процесс достаточно распространенный у протопластов, то добиться деления сформировавшихся из протопластов клеток значительно труднее, а еще труднее получение из растительных протопластов целых растений.

Возможность регенерации растений из протопластов,обнаруженная в 1970 г, является свидетельством сохранения у них свойства тотипотентности. Регенерация растений осуществляется либо посредством эмбриогенеза, либо в процессе развития каллуса с последующей индукцией морфогенеза, посредством подбора оптимальных уровней гормонов, стимулирующих соответствующие этапы эмбриогенеза или морфогенетического процесса

Слияние протопластов

Некоторые изолированные протопласты за тот короткий промежуток времени, пока они не образуют клеточную стенку, могут сливаться друг с другом, т.е. ведут себя подобно половым клеткам. Такое слияние является спонтанным и происходит чаще, если используются протопласты, полученные из молодых тканей или из суспензионных культур клеток. Однако этот процесс может быть стимулирован путем добавления определенных веществ, что позволяет осуществить слияние не только протопластов одного вида, но и гетерологичных (парасексуальная гибридизация). Таким способом удалось даже получить регенерированное растение после слияния протопластов растения табака двух видов.

1 Применение изолированных протопластов
Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке.

Протопласты являются уникальной моделью для изучения фундаментальных физиологических проблем у растений. На схеме (рис.) представлены основные направления физиологических исследований с использованием культуры изолированных протопластов.

Изолированные протопласты имеют ряд областей применения, как теоретического, так и прикладного характера:

2. Изучение свойств плазмалеммы: ее организация, функционирование, действие гормонов и патогенов на плазмалемму и протопласт, поступление через плазмалемму низкомолекулярных веществ, частиц, органелл.

4. Наблюдение за закономерностями дифференцировки клеток при слиянии протопластов, отслеживание взаимодействия ядра и цитоплазмы в полученной гибридной клетке, изучение соматических гибридов.

5. Биологическое конструирование на уровне клетки (введение чужих органелл, чужеродной ДНК, микроорганизмов).

Рис. Изолированные протопласты – объект и модель в физиологических исследованиях (по Р.Г. Бутенко, 1981)
2 Способы выделения и культивирования протопластов
Выделение протопластов

Протопласты выделяют из клеток листьев, меристем, стеблей.

Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ. При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений:

– можно использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом;

– трудоемкость и длительность.

Другой метод выделения протопластов – энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 году Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 году Коккинг обработал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом.

Преимущества энзиматического метода по сравнению с механическим:

– одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн. из грамма ткани или клеток);

– клетки не повреждаются;

– метод сравнительно быстрый.

Выделение протопластов проводят в три этапа:

– выделение протопластов из клеточных стенок;

– отделение интактных протопластов от клеточных осколков.

Протопласты можно выделять также из суспензионных и каллусных культур. Лучше всего - в поздней стадии логарифмического роста, когда клеточные стенки легче поддаются разрушению, а протопласты наиболее жизнеспособны.

Способы культивирования протопластов

Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Однако способы культивирования протопластов специфичны. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического стабилизатора (сахароза, глюкоза, ксилоза, маннитол и др.), неорганических соединений, источника углерода, азота, витаминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды 5,4–5,8, температура 22–28 о С, невысокая освещенность (не более 2000 лк).

Существуют два способа культивирования протопластов: метод жидких капель и метод платирования.

Метод жидких капель. Суспензию протопластов в виде капель помещают на пластиковые чашки Петри. Вариацией этого способа является культивирование единичных изолированных протопластов в микрокаплях объемом 1 мкл, предложенное Ю. Глебой в 1978 г.

Метод платирования. Суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же среды с 1% агаром при температуре не выше 45 о С. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28 о С. В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта: формированием клеточной стенки, делением, ростом и развитием растения. Вариантом этой техники является использование кормящих протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или γ-излучения, что блокирует их способность к делению. Такие протопласты или клетки смешивают с жизнеспособными протопластами и они поддерживают и стимулируют их рост.

Сразу после удаления раствора фермента начинается образование клеточной стенки. Труднее добиться деления клеток и регенерации растений. Регенерация растений происходит осуществляется либо через эмбриогенез, либо через развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого добавлением в среду ауксинов или сочетания ауксинов с цитокининами.

На пролиферацию клеток, возникших из протопластов, влияет 4 фактора:

– видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани растения;

– способ и условия выделения протопластов;

– плотность высева протопластов;

– состав питательной среды.

На сегодняшний день успешно осуществляется регенерация из протопластов пасленовых (табак, картофель, томаты), есть проблемы получения регенерантов у многих злаковых (до 2000 года не удавалось получить регенаранты).
3 Парасексуальная гибридизация
Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточной стенки, могут сливаться между собой. Слияние протопластов – своеобразный метод гибридизации, так называемая парасексуальная, или соматическая гибридизация. В отличие от обычной гибридизации, где сливаются половые клетки (гаметы), в качестве родительских при парасексуальной гибридизации используются диплоидные клетки растений. Внеядерные генетические детерминанты (цитоплазматическая наследственность) у большинства высших растений наследуются в половом процессе строго одноядерно и матерински. Техника парасексуальной гибридизации может позволить. Возможности соматической гибридизации:

– скрещивание филогенетически отдаленных видов растений (организмов), которые невозможно скрестить обычным половым путем;

– получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цитоплазмой другого;

– слияние трех и более клеток;

– получение гибридов, представляющих сумму генотипов родителей;

– перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать жизнеспособные формы при слиянии протопластов, поскольку мутагенез довольно часто дает дефектное по морфогенезу растение;

– получение растений, гетерозиготных по внеядерным генам и др.

Парасексуальная гибридизация важна для анализа как ядерных генов, так и внеядерных геномов. Цитоплазматический геном кодирует ряд признаков – скорость фотосинтеза, устойчивость к патогенам, абиотическим факторам и т. д. Наличие косегрегация генов (признаки, контролирующие внеядерный геном, сегрегируют совместно) свидетельствует о физическом сцеплении генов.

Слияние протопластов бывает спонтанным (чаще у протопластов из молодых тканей или суспензионных культур) и индуцированным. Для стимуляции слияния протопластов предложен ряд методов, как физических, так и химических.

При физическом способе слияния протопластов, разработанном Г. Циммерманом с сотрудниками в 1981 году, протопласты помещают в камеру с неоднородным электрополем. На электродах образуются агрегаты из 2–3 протопластов, либо цепочки из 5–6 протопластов между электродами. Дополнительный единичный импульс постоянного тока приводит к образованию пор в сильно сжатых мембранах, происходит перетекание цитоплазмы, так как переменный ток удерживает протопласты вместе некоторое время, и протопласты в таких агрегатах сливаются. Затухающий ток приводит к возвращению сферической формы у слившихся протопластов.

В основе электрослияния лежит различное действие постоянного и переменного электрического тока на плазмалемму. Постоянное эклектическое поле сжимает мембраны, ведя к их локальному разрушению, а переменное электрополе вызывает латеральную диффузию белков мембраны, образуя свободные от гликопротеидов липидные области, где противоположные мембраны могут установить контакт.

Чаще для индукции слияния протопластов используют методику "ПЭГ - высокие значения рН – высокая концентрация Са 2+ ", которая дает до 50% слившихся протопластов (рН 9 –11, концентрация Са 2+ 100 – 300 ммоль/л). В присутствии полиэтиленгликоля наблюдается сильная адгезия протопластов, после удаления полиэтиленгликоля и добавления кальция - их слияние. Предполагают, что рН и ионы кальция увеличивают текучесть мембран, что связано с их жидкостно-мозаичной структурой.

При слиянии протопластов различных растений, например, А и В, могут с равной вероятностью образовываться комбинации АА, ВВ и АВ. Желаемый продукт слияния – АВ, поэтому разрабатываются способы увеличения частоты слияния именно такого типа и избирательного выделения только продукта слияния АВ. Один из таких методов заключается в следующем. Поверхность протопласта обычно несет отрицательный заряд. Путем обработки ее фосфолипидом, несущим положительный заряд, можно временно придать поверхности протопласта положительный заряд. Если теперь протопласты А, имеющие положительный заряд, смешать с необработанными протопластами В, несущими отрицательный заряд, то будут в основном образовываться комбинации АВ в результате притяжения разноименных зарядов.

Судьба геномов (ядерного и цитоплазматического) после слияния протопластов может быть различной:

1. Ядерные генетические детерминанты наследуются как дву-, так и однородительски. В последнем случае ядра не сливаются и впоследствии сегрегируют в процессе клеточных делений.

2. Внеядерные генетические детерминанты наследуются двуродительски. При этом в межвидовых комбинациях прослеживается тенденция к соматическому выщеплению и элиминации одного из родительских цитоплазматических геномов.

3. Возникновение гибридных клеток и растений в результате слияния более чем двух родительских клеток.

Таким образом, Слияние протопластов приводит к образованию:

Соматический гибрид – продукт слияния и цитоплазмы, и ядра обоих протопластов.

Цибрид (цитоплазматический гибрид) – растение-регенерант, содержащее цитоплазму обоих родителей и ядро одного из них. Цибриды получают, облучая перед слиянием один из протопластов γ-лучами для разрушения ядра. Скрининг таких клеток проводится по генам – маркерам ядерного и цитоплазматических (митохондриального и хлоропластного) геномов. Есть указания на рекомбинацию ДНК митохондрий и хлоропластов в гибридных клетках (Ю.Ю. Глеба, К.М. Сытник, 1984). Цибридизация позволяет ввести цитоплазматические гены, несущие признаки цитоплазматической мужской стерильности, устойчивости к гербицидам и патогенам.

Асимметричные гибриды – продукты слияния, имеющие полный хромосомный набор одного из партнеров и часть хромосом другого партнера. Такие гибриды часто возникают при слиянии клеток организмов, филогенетически удаленных друг от друга. В этом случае вследствие неправильных делений клетки, обусловленных некоординированным поведением двух разнородных наборов хромосом, в ряду поколений теряются частично или полностью хромосомы одного из родителей. Асимметричные гибриды бывают устойчивее, плодовитее и жизнеспособнее, чем симметричные, несущие полные наборы генов родительских клеток. В целях асимметричной гибридизации возможна избирательная обработка клеток одного из родителей для разрушения части его хромосом. Возможен прицельный перенос в клетку нужной хромосомы.

Асимметричные гибриды могут быть получены путем слияния трех и более родительских клеток. Из таких гибридных клеток могут выращены растения – регенеранты.
4 Виды соматических гибридов
Впервые зрелый межвидовой гибрид, полученный в результате парасексуальной гибридизации протопластов 2 сортов табака (Nicotiana glauca, c 24 хромосомами и N.langsdorfii c 18 хромосомами), описан Карлсоном в 1972 г. Каллус амфиплоидного гибрида мог расти на безгормональной среде. Гибридное растение цвело. С тех пор были получены жизнеспособные внутривидовые, межвидовые, межродовые гибриды табака.

Первая попытка по созданию межродовых гибридов принадлежит Г. Мельхерсу, создавшему в 1978 году гибрид картофель + томат, так называемый томатофель. Гибрид был стерилен, морфологически аномален: толстые корни, отсутствие типичных столонов, махровые цветки. Было еще несколько попыток получения таких гибридов, но все растения стерильны. Эти эксперименты показали ограниченность применения парасексуальной гибридизации для прикладной селекции. Японскими исследователями (Х. Кисака с соавт., 1997) путем электрослияния протопластов ячменя и риса был получен межродовой соматический гибрид. Протопласты риса получали из суспензионной культуры, а протопласты ячменя были изолированы из молодых листьев. Часть полученных каллусов сформировали зеленые участки и побеги. Только один побег сформировал корни, и это растение было успешно перенесено в почву. По морфологии было близко к растениям риса. Цитологический анализ показал, что растение имело и маленькие хромосомы от риса, и большие от ячменя. Были проанализированы также митохондриальная и хлоропластная ДНК. Растение содержало новые последовательности и в митохондриальной, и в хлоропластной ДНК, которые не обнаруживались ни в одном из родителей.

Была осуществлена гибридизация 2-х родов пасленовых Datura innoxia + Atropa belladonna. Удалось регенерировать растения. Во всех случаях выявлены хромосомы обоих родительских видов. Амфиплоиды оказались неспособны к стеблевому морфогенезу, в линиях с полиплоидным и анеуплоидным наборами хромосом получали аномальные стебли. Регенерировавшие растения были стерильны, похожи на дурман, но содержали небольшое количество хромосом красавки.

В других экспериментах сливали протопласты красавки с каллусными клетками китайского табака. Получили 12 клонов. В клетках всех клонов обнаружили хромосомные типы обоих родителей, через год только у двух клонов происходила полная элиминация хромосом красавки.

Морковь + сныть: из образовавшейся каллусной ткани через полгода регенерировали аномальные растения. Одно из них цвело, но у цветка отсутствовали пыльники и пестик.

Первые работы по получению межсемейственных гибридов проведены К.Као и В.Веттером в 1976–77 гг. (соя + табак). Позднее в лаборатории Ю.Ю.Глебы провели аналогичные эксперименты пасленовые + бобовые и лилейные (горошек + табак и лук + табак). И.Ф.Каневскому удалось индуцировать морфогенез стеблеподобных тератом в культуре межсемейственных гибридов N.tabacum + Vicia faba.

Практически у всех видов соматических гибридов наблюдали цитогенетические изменения, такие как:

– видоспецифичная элиминация хромосом одного из родителей;

– в культурах межсемейственных гибридов отмечали много многоядерных клеток, клеток с мини ядрами, в метафазах делений встречались гигантские хромосомы;

– отмечена асинхронность в расхождении родительских хромосом в анафазе;

– морфогенез у такого материала отмечен не был.

Вывод: для отдаленных соматических гибридов характерно (свойства):

1 Относительная стабильность гибридного состояния, при котором не наблюдается полной элиминации генетического материала одного из родителей.

2 Генетические перестройки (реконструкция и частичная элиминация хромосом).

3 Генетическая разнокачественность клонов гибридных клеток.

4 Ограниченная морфогенетическая способность.

Изучение межцарственных гибридов клеток "животное + растение" показало, что на этапе слияния видоспецифичность не проявляется, поэтому можно слить даже животную и растительную клетки. На более поздних этапах онтогенеза эти различия сказываются, что было установлено в экспериментах по слиянию протопластов арабидопсиса и табака с лимфоцитами человека. При этом происходило слияние цитоплазмы, ядра не сливались. Эдвард Коккинг параллельно проводил изучение ультраструктуры таких гибридов, работая с клетками амфибий и протопластами моркови. После объединения клеток ядра амфибии были окружены тонким слоем собственной цитоплазмы, но уже через 48 часов отмечалось полное смешивание цитоплазмы и регенерация клеточной стенки вокруг гетерокариона.
5 Конструирование клеток
Протопласты широко используются в качестве реципиентов для клеточных органелл. В 1973 году И. Потрикусс и Ф. Хоффман успешно трансплантировали изолированные ядра петуньи в протопласты табака. Кроме ядра трансплантируют и другие органеллы, такие как митохондрии и хлоропласты. Выбор этих органелл объясняется их полуавтономностью, то есть наличием собственной ДНК и способность делиться самостоятельно, независимо от деления самой клетки. Кроме того, эти органеллы контролируют важнейшие физиологические процессы растительной клетки, такие как фотосинтез и дыхание. Например, перенос хлоропластов может использоваться для выведения новых форм хозяйственно важных сортов растений. Трансплантация высокоэффективных хлоропластов может способствовать активации фотосинтеза и повышению продуктивности растения.

Одним из важных моментов является сохранение клеточных органелл, поэтому для переноса их в последнее время используются субпротопласты – фрагменты, полученные из протопластов. Они могут содержать большую часть цитоплазмы, но без ядра (цитопласты), ядро с небольшим количеством цитоплазмы (кариопласты), часть хромосом с небольшим количеством цитоплазматического материала (микропротопласты).

Каким образом можно ввести ядро или другие клеточные органеллы в протопласт?

Способы трансплантации ядра и других клеточных органелл в протопласт:

1 При использовании сэндвич-метода трансплантацию проводят в условиях слабого деплазмолиза протопласта.

2 Посредством липосом. Широкий спектр одно- и многоламелльных частиц, которые сливаются с мембранами протопластов, получен с применением таких веществ, как фосфатидилсерин, холистерол и т.д.

3 Путем микроинъекций. Этот метод сначала широко использовался для введения в клетку ДНК, РНК, а затем был успешно использован и для переноса клеточных органелл у растений.

Биологическое конструирование на уровне клетки может оказаться полезным и перспективным для создания клеток, клеточных систем и целых растений, удовлетворяющих потребности человека. Под биологическим конструированием следует понимать не только введение отдельных органелл (рис. 16). Аналогичным образом в клетку можно вводить и чужеродный генетический материал как в виде фрагментов ДНК, так и в виде отдельных хромосом. Кроме того, в изолированные протопласты можно вводить клетки микроорганизмов, создавая таким образом искусственные клеточные ассоциации.

Читайте также: