Методы посева воды учет численности бактерий в воде

Обновлено: 07.07.2024

Цель работы: изучение методов оценки санитарнобактериологического состояния питьевой воды и воды из естественных водоемов.

Вода, используемая на предприятиях пищевой промышленности, должна отвечать требованиям, предъявляемым к питьевой воде действующими нормативными документами. Безопасность воды в эпидемиологическом отношении определяют по общему числу микроорганизмов и количеству бактерий группы кишечных палочек в ее определенном объеме.

Качество воды централизованных систем питьевого водоснабжения определяют в соответствии с санитарными правилами и нормами. Питьевая вода должна быть безопасна в эпидемиологическом и радиационном отношениях, безопасна по химическому составу и иметь благоприятные органолептические свойства (табл. 12.1).

Таблица 12.1. Безопасность питьевой воды в эпидемиологическом отношении (по микробиологическим и паразитологическим показателям) СанПиН 2.1.4.1074-01

Общее микробное число (ОМЧ)

Число КОЕ в 1 см 3

Термотолерантные колиформные бактерии

Число бактерий в 100 см 3

Общие колиформные бактерии

Число бактерий в 100 см3

Число БОЕ* в 100 см 3

Споры сульфитредуцирующих бактерий

Число спор в 20 см 3

Число цист в 50 дм 3

* БОЕ - бляшкообразующие единицы.

12.1. Отбор проб и подготовка их к анализу

Воду для санитарно-бактериологического контроля отбирают в количестве 500 см 3 в бутылки, предварительно простерилизованные в бумажных пакетах, с ватно-марлевой пробкой, покрытой сверху бумажным колпачком.

Перед отбором пробы кран или край трубы обжигают зажженным ватным тампоном, пропитанным спиртом. Открывают кран и в течение 10-15 мин воду спускают, затем производят отбор пробы. Вода подлежит анализу не позже чем через 2 ч после отбора.

Пробы воды из открытых водоемов - колодцев, бассейнов, рек, озер - отбирают с помощью батометров, представляющих собой металлический каркас с массивным свинцовым дном - грузилом. В металлический каркас вставлена бутылка. Батометр погружают на заданную глубину и открывают бутылку, потягивая за веревку, привязанную к пробке. После наполнения бутылки батометр извлекают и закрывают ее стерильной пробкой.

Пробы хлорированной воды берут во флаконы с дехлоратором, так как под действием хлора микробы в воде погибают. В качестве дехлоратора используют серноватистый натрий из расчета 10 мг на 500 см исследуемой воды.

К отобранным пробам воды прилагают сопроводительный документ с указанием соответствующих данных. Доставку проб питьевой воды осуществляют в контейнерах-холодильниках при температуре от 4 до 10 °С.

12.2. Определение общего микробного числа воды

Общее микробное число (ОМЧ) - это количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, образующих колонии на мясопептонном агаре при посеве 1 см 3 воды с последующей инкубацией посевов при температуре 37±0,5 °С в течение 48 ч. ОМЧ должно быть не более 50 КОЕ/см 3 .

В зависимости от степени предполагаемого загрязнения производят посев не менее двух различных объемов воды, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках вырастало от 30 до 300 колоний. Водопроводную и артезианскую воду засевают в неразведенном виде по 1 см 3 . При бактериологическом исследовании загрязненных вод делают посевы разведенной воды. Разведения готовят так, как указано в разделе 8.3.

Из исследуемого образца и из пробирок с его разведениями в соответствии со степенью предполагаемого микробного загрязнения отбирают по 1 см 3 , вносят в стерильные чашки Петри и заливают 10-12 см расплавленного и остуженного до температуры 45 °С мясопептонного агара. Круговыми движениями руки, вращая чашки по горизонтальной поверхности стола, распределяют их содержимое равномерным слоем по всей площади дна. После застывания агара чашки с посевами помещают на 24 ч в термостат при температуре 37 °С. После инкубации подсчитывают число выросших колоний.

Определение микробного числа указанным методом позволяет выявить лишь мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы.

12.3. Определение содержания колиформных бактерий в воде

С эпидемиологической точки зрения особенно важным является обнаружение в воде патогенных микроорганизмов - возбудителей кишечных инфекций (брюшного тифа, дизентерии, холеры и др.) Однако в связи с большой трудностью обнаружения патогенных микроорганизмов при бактериологических анализах ограничиваются определением так называемых санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ). К санитарно-показательным относят микроорганизмы, постоянно находящиеся в естественных полостях человека или животных. Присутствие СПМ в различных объектах внешней среды является индикатором их загрязнения человеком. Чем больше СПМ во внешней среде, тем более вероятным становится присутствие специфических возбудителей инфекционных заболеваний.

В качестве СПМ наибольшее значение имеют бактерии группы кишечных палочек (БГКП). К группе кишечных палочек относят колиформные бактерии родов Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Serratia.

При определении количества СПМ в воде используют следующие характеристики:

• коли-титр - наименьший объем воды, в котором обнаружена одна кишечная палочка. Для питьевой воды, прошедшей очистку, титр кишечной палочки должен быть не менее 300 см 3 ;

• коли-индекс - количество кишечных палочек в 1 дм 3 воды. Коли-индекс для питьевой воды должен быть не более 3.

Колиформные бактерии определяют в воде методом мембранных фильтров или бродильным методом.

Бродильный метод. Сущность бродильного метода заключается в посеве определенных объемов исследуемой воды, инкубации

посевов при температуре 37 °С в средах накопления с последующим высевом на среду Эндо, дифференциацией выросших колоний и определением наиболее вероятного числа БГКП в 1 дм 3 воды.

При исследовании воды централизованного водоснабжения исследуемый материал дважды засевают в три объема: 100, 10 и 1 см 3 . Для исследования речной, озерной, прудовой воды готовят десятикратные разведения 1:10, 1:100, 1:1000 и засевают еще 10 см 3 и 1 см 3 без разведения. Посев воды производят в бродильные сосуды (колбы, бутылки, пробирки с поплавками), заполненные глюкозопептонной средой Эйкмана. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 24 ч.

Обработка результатов анализа. По окончании инкубации посевы просматривают и делают следующие выводы:

а) при отсутствии газообразования и изменения цвета среды дают отрицательный ответ на наличие БГКП в исследуемом объеме воды, дающим право закончить исследование через 24 ч;

б) при образовании кислоты и газа производится высев материала из бродильных сосудов на среду Эндо. Высев делается бактериологической петлей густым штрихом для получения изолированных колоний. Чашки с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 ч. После инкубации посевы просматривают. Отсутствие на среде Эндо характерных для кишечных палочек колоний дает основание на выдачу отрицательного ответа и окончание исследования;

в) при обнаружении на среде Эндо лактозоположительных темно-красных колоний, с металлическим блеском или без него, необходимо установить принадлежность выросших микроорганизмов к семейству кишечных бактерий. С этой целью производится микроскопирование препарата из колоний и постановка оксидазного теста.

Оксидазный тест предложен для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonodaceae и других водных сапрофитов, которые, в отличие от кишечных бактерий, вырабатывают фермент оксидазу.

Для постановки оксидазного теста со среды Эндо снимают петлей по 2-3 колонии каждого типа. Микробную массу наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную специальным реактивом (30 г α-д-нафтола растворяют в 2,5 см 3 этанола, прибавляют 7,5 см 3 дистиллированной воды и 40 мг диметил-парафенилендиамина. Раствор готовят непосредственно перед определением).

При отрицательном результате оксидазного теста бумага при контакте с колонией цвета не меняет. Если же бумага синеет в течение 1 мин при контакте с колонией, то оксидазный тест считают положительным.

Наличие в препарате грамотрицательных неспорообразующих палочек, не обладающих оксидазной активностью, позволяет немедленно дать ответ о наличии в воде БГКП.

При обнаружении на среде Эндо розовых и бесцветных колоний ведут подсчет и пересевают 2-3 изолированные колонии каждого типа в глюкозо-пептонную среду Эйкмана. Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение 3-4 ч. При образовании кислоты (изменение цвета среды) и газа, накапливающегося в поплавке, результат считается положительным, при отсутствии кислото- и газообразования - отрицательным.

После проведения анализа записывают в лабораторный журнал окончательные результаты (положительные и отрицательные) по каждому засеянному объему и определяют коли-титр и коли-индекс.

Метод мембранных фильтров. Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема воды на мембранных фильтрах с последующим выращиванием их на среде Эндо при температуре 37 °С, дифференцированием выросших колоний и подсчетом количества БГКП в 1 см 3 воды.

Подготовка мембранных фильтров. Для фильтрования воды отбирают мембранные фильтры № 3, помещают их в подогретую до температуры 80 °С дистиллированную воду и ставят на небольшой огонь для кипячения. Кипячение проводят трижды по 10 мин. После первого и второго кипячения воду сливают, а после третьего фильтры оставляют в воде до употребления.

Подготовка фильтровального аппарата. Фильтровальный аппарат стерилизуют в автоклаве или протирают ватным тампоном, смоченным в спирте, и обжигают в целях стерилизации. На столик фильтровального аппарата стерильным пинцетом помещают мембранный фильтр. Во избежание повреждения фильтра под него подкладывают кружок стерильной фильтровальной бумаги. На фильтровальный столик с положенными на него фильтрами устанавливают и закрепляют верхнюю часть прибора - воронку (рис. 12.1).

Рис. 12.1. Определение количества микроорганизмов методом мембранных фильтров


Обработка результатов анализа. По окончании инкубации посевы просматривают и делают следующие выводы:

а) отсутствие микробного роста на фильтрах или обнаружение на них колоний, не характерных для БГКП, позволяет закончить исследования на этом этапе анализа с выдачей отрицательного результата на присутствие БГКП в анализируемом объеме воды;

б) при обнаружении на фильтре колоний, характерных для БГКП, исследование продолжают. Из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Отсутствие в мазках мелких грамотрицательных неспороносных палочек является основанием для прекращения анализа с выдачей отрицательного результата на присутствие БГКП в исследуемом объеме воды;

в) при наличии в мазках грамотрицательных палочек, морфологически сходных с кишечными, ставится оксидазная проба. При обнаружении на мембранных фильтрах однотипных лактозоположительных колоний (темно-красных с металлическим блеском или без него), не вырабатывающих оксидазы, анализ воды на этом этапе заканчивают и подсчитывают число выросших на мембранном фильтре колоний кишечных палочек. Результат выражают в виде коли- индекса в пересчете на 1 дм 3 воды;

г) при обнаружении на мембранных фильтрах розовых и бесцветных колоний подсчитывают их число и пересевают 2-3 изолированные колонии каждого типа в глюкозо-пептонную среду Эйкмана. После инкубации в течение 3-4 ч при температуре 37 °С отмечают изменение цвета среды за счет образования кислоты и накопления газа в поплавке. В этом случае результат считается положительным. Если изменений в среде нет, то дают отрицательный результат на присутствие БГКП.

Пример определения колииндекса: профильтровано три объема воды по 100 см 3 . На первом и втором фильтрах выросло по три колонии, на третьем - девять колоний. Всего выросло пятнадцать колоний. Таким образом, колииндекс исследуемого образца воды равен: (1000 х 15):300 = 50. Колииндекс переводится в колититр следующим образом: 1000:50 = 20.

Контрольные вопросы

1. Какие Вы знаете показатели эпидемиологической безопасности питьевой воды?

2. Что такое общее микробное число, колититр и колииндекс?

3. Какие роды микроорганизмов входят в БГКП?

4. Какими методами определяют колиформные бактерии?

5. Каковы основные критерии, по которым устанавливают присутствие колиформных бактерий в питьевой воде?

Свидетельство и скидка на обучение каждому участнику

Микробиологический анализ воды:

питьевой и водоема

Выполнили анализ: Дятлова Екатерина, ученица 10 класса Русу Алин, ученица 8 класса
МОУ Шерловогрская средняя общеобразовательная школа № 47 Забайкальский край

пгт. Шерловая Гора

Заявленная тема исследования актуальна. Вода – среда обитания всех живых организмов. Чистота воды связана со здоровьем человека. Какими способами можно очистить и исследовать воду необходимо знать современному человеку. Мы, Русу Алина, ученица 8 класса, Дятлова Катя, ученица 10 класса, провели исследование питьевой воды и воды из водоема на предмет обнаружения микробов, применив 2 методики: метод мембранных фильтров, титрационный метод, с учетом материальной базы школы.. Соблюдались все правила, необходимые для проведения микробиологического анализа воды. Взяты пробы воды питьевой в школе и пробы воды из небольшого озерка в окрестности поселка Шерловая Гора. Летом в этом водоеме купаются, оно подпитывается грунтовыми водами. Использованы методы: метод мембранных фильтров, но посев на другую среду (желатин), титрационный метод с использованием среды – агар. Агар нам привезли из города, поэтому с работой были задержки и пришлось в качестве среды брать желатин. Термостата для инкубирования проб нет, подогревали на батарее, подложив картон для поддержания необходимой температуры. Есть оборудование для проведения микробиологического анализа воды, кроме термостата и камеры для подсчета клеток бактерий. В результате проведенного анализа было выяснено, что питьевая вода в школе соответствует стандартным нормам, в 1мл содержится не более 3 бактерий; вода из водоема загрязненная, купаться в ней опасно для здоровья: 98 КОЕ/мл., но крупный рогатый скот может ее пить. Кратко изложены достоинства обеих методик. Предпочтение отдано методике мембранных фильтров. Приготовлены микропрепараты с фильтров, воды с водоема и водопроводной воды и рассмотрены колонии микробов, произведен подсчет количества микроорганизмов визуально. Специального оборудования для подсчета концентрации микробов нет, но с методами прямого подсчета ознакомились. Результаты микробиологического анализа воды питьевой и поверхностных вод (водоем) изложены в журнале, протоколе, подготовлена презентация. Консультантом выступил заслуженный учитель РФ, преподававший 48 лет биологию в данной школе, Журавлева Валентина Ивановна.

Вода является естественной средой обитания микроорганизмов, не всех, но достаточно многих. Микроорганизмы способны осуществлять в воде все процессы своей жизнедеятельности, проводя при этом разложение различных органических соединений. Они способны жить, размножаться, участвовать в процессах круговорота углерода, азота, различных элементов. Количественный и качественный состав микробиоты разных природных вод различается и весьма разнообразен. В воде открытых водоемов обитают самые разные микроорганизмы: палочковидные бактерии, кокки, вибрионы, спириллы, спирохеты, различные фотосинтезирующие бактерии, грибы, вирусы, плазмиды, простейшие. Количественный и качественный состав микробиоты воды зависит от ее происхождения. Например, галофильные бактерии обитают в морской воде. Количество микроорганизмов регламентируется в основном содержанием в воде органических веществ. Многие микроорганизмы хорошо размножаются в воде, и их количество может достигать миллионов в одном миллилитре. Вода, просачиваясь через почву, подвергается своеобразной природной фильтрации, поэтому грунтовые воды значительно чище воды открытых водоемов. « Степень загрязнения воды характеризуется показателем сапробиости (от греч. sapros — гнилой). Различают три категории воды (зоны водоема) по степени микробного загрязнения:

• полисапробная — максимально загрязненная вода. Это вода, богатая органическими веществами и содержащая мало кислорода. Количество микроорганизмов в такой воде — несколько миллионов, часто встречаются кишечные палочки, много гнилостных бактерий;

• мезосапробная — среднезагрязненная вода. В такой воде активно протекают процессы разложения органических веществ и минерализации, сопровождающиеся интенсивным окислением, и нитрификации. Количество микроорганизмов в воде мезосапробной зоны значительно меньше, чем в полисапробной, — сотни тысяч в одном миллилитре;

Особую категорию составляет питьевая вода. Это вода, к которой предъявляются строгие санитарные требования. Жесткие требования направлены на эпидемиологическую безопасность воды. Дело в том, что вода играет большую роль в распространении многих инфекций, особенно пищевых. Возбудители брюшного тифа, холеры, полиомиелита, дизентерии, сальмонеллезов и многих других заболеваний способны длительное время находиться в воде в жизнеспособном состоянии. От больных людей и бактерионосителей опасные микроорганизмы попадают в сточные воды, далее (если были нарушены этапы очитки вод) — в окружающую среду, включая воды открытых водоемов, а оттуда могут (опять в случае нарушения санитарной обработки воды) попасть в питьевую воду. Отдельные микроорганизмы могут размножаться в воде: примером является холерный вибрион. Для этого микроорганизма наличие органических соединений и высокая температура являются крайне благоприятными. Многие патогены хорошо переносят низкие температуры, месяцами способны сохраняться во льду в жизнеспособном состоянии. Прямые методы выделения патогенных микроорганизмов из воды и идентификации их сложны и достаточно трудоемки. Часто используют косвенные методы, позволяющие произвести оценку санитарного состояния воды и получить количественную оценку степени фекального загрязнения воды. Количество микроорганизмов в воде в значительной степени различается в зависимости от источника или происхождения. Выделяют воды подземные и поверхностные.

Подземные воды . К ним относят воды артезианскую, ключевую и грунтовую. Состав микробиоты этой воды зависит прежде всего от того, на какой глубине расположен водоносный слой: чем дальше он от поверхности, тем меньше содержание в такой воде микроорганизмов. Естественно, играет роль и его защищенность от загрязнений. Артезианские воды находятся на большой глубине, и количество микроорганизмов в них крайне мало. Подземные воды обычных колодцев контаминированы очень по-разному: от абсолютно чистой воды, содержащей единичные клетки, до очень грязной, количество микроорганизмов в которой достигает 10 6 КОЕ/см 3 . Высокая контаминация такой колодезной воды связана с тем, что в колодцы просачиваются поверхностные загрязнения, содержащие большое количество бактерий (возможно, и патогенных), споры грибов и другие микроорганизмы. Близко расположенные к поверхности земли грунтовые воды отличаются обильной и разнообразной микробиотой.

Поверхностные воды . Это воды всех открытых водоемов: океанов, озер, рек, водохранилищ, прудов. Микробиота в них крайне различна, зависит от множества факторов: времени года, химического состава воды, целевого назначения водоема, климатических условий, заселенности прибрежных районов и др. В поверхностные источники воды попадает много микроорганизмов из окружающей среды. Особенно значительно это число, когда вода протекает через населенные пункты и в реку попадают сточные воды.

Питьевая вода . В качестве источников питьевой воды в системе водоснабжения используют воды подземные и воду открытых водоемов, специальным образом очищенную и подготовленную. Самое главное: вода должна быть безопасна в эпидемиологическом отношении. Разработаны и утверждены микробиологические критерии качества питьевой воды. Наличие в воде патогенных микроорганизмов проводят лаборатории, имеющие разрешение Роспотребнадзора.

Цель занятия. Ознакомить студентов с основными методами и показателями, необходимыми для санитарно-микробиологической оценки объектов внешней среды.

Оборудование и материалы. Прибор для подсчета колоний, колбы с пробами воды, бактериологические пробирки с 9 мл воды, пробирки с 10 мл расплавленного агара, мерные стериль­ные пипетки на 2 мл, стерильные чашки Петри, чашки Петри с МПА, чашки Петри с кровяным МПА, навески почвы, стериль­ная водопроводная вода в колбе — 270 мл, пробирки со средой Кесслера, Вильсона—Блера.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Для оценки санитарно-гигиенического состояния объектов окружающей среды проводят санитарно-бактериологические ис­следования, цель которых состоит в определении эпизоотологической и эпидемиологической безопасности. Показателем небла­гополучия служит выявление патогенных микроорганизмов. Од­нако прямое их обнаружение связано с большими трудностями, и прежде всего с низкой концентрацией данных микробов, кото­рые в основном не могут размножаться в воде, воздухе и почве. Поэтому в санитарно-микробиологической практике используют косвенные методы, направленные на определение микробной обсемененности объекта и обнаружение в нем так называемых санитарно-показательных бактерий. О бактериальной обсеме­ненности судят по микробному числу — общему коли­честву микроорганизмов, содержащихся в единице объема или массы (1 мл воды, 1 г почвы, 1 м 3 воздуха).

Содержание санитарно-показательных бактерий определяют по двум показателям: титру и индексу. Титром называют минимальный объем или массу, в которых выявляют данные бактерии, индексом — количество санитарно-показательных бактерий, содержащихся в соответствующем количестве среды.

К санитарно-показательным бактериям относят представи­телей облигатной микрофлоры организма человека и тепло­кровных животных, для которых среда обитания — кишечник или воздушно-дыхательные пути. Они характеризуются следую­щими свойствами: 1) постоянно выделяются с калом или ка­пельками слизи из воздушно-дыхательных путей; 2) не имеют других мест обитания; 3) способны сохраняться в окружающей среде то же время, что и патогенные бактерии, паразитирующие в кишечнике или воздушно-дыхательных путях; 4) не способны интенсивно размножаться вне организма хозяина и изменять свои свойства.

Перечисленные признаки присущи бактериям, признанным санитарно-показательными для различных объектов окружаю­щей среды.

Санитарно-показательные бактерии группы кишечных пало­чек принадлежат к различным родам семейства энтеробактерий.

Обнаружение кишечной палочки в разных объектах окружаю­щей среды считают наиболее достоверным признаком свежего фекального загрязнения. Наличие в этих же объектах бактерий родов Citrobacter и Enterobacter указывает на относительно давнее фекальное загрязнение.

Присутствие С. perfringens, С. sporogenes и других клостридий в почве свидетельствует о ее фекальном загрязнении, причем как свежем, так и давнем, поскольку эти бактерии образуют споры, что позволяет им длительно переживать в окружающей среде (в частности, в почве).

Обнаружение в объектах окружающей среды Streptococcus faecalis также свидетельствует об их фекальном загрязнении. Рез­кое увеличение количества этих бактерий в саморазогревающем­ся навозе и компостах может свидетельствовать о загрязнении почвы разлагающимися отбросами.

Гемолитические стрептококки, будучи облигатными обитате­лями носоглотки и зева, выделяются с капельками слизи ораль­но-капельным путем. Сроки выживания гемолитических стреп­тококков в окружающей среде практически не отличаются от сроков, характерных для большинства других возбудителей воз­душно-капельных инфекций. Обнаружение гемолитических стрептококков в воздухе помещений указывает на возможное его загрязнение микроорганизмами, содержащимися в зеве, носо­глотке, верхних дыхательных путях и вызывающими инфекции, передаваемые воздушно-капельным путем.

Staphylococcus aureus — также факультативный обитатель но­соглотки и зева. Его присутствие в воздухе помещений служит показателем орально-капельного загрязнения.

Одновременное обнаружение золотистого стафилококка и ге­молитических стрептококков свидетельствует о высокой степени загрязнения воздуха.

Санитарно-микробиологическое исследование воды. Вода — ес­тественная среда обитания микробов, которые в большом коли­честве поступают из почвы, воздуха, с отбросами, стоками. Осо­бенно много микроорганизмов в открытых водоемах и реках. Кроме сапрофитов в воде могут находиться возбудители инфек­ций животных и человека.

При контроле санитарного состояния воды исследованию подлежат: вода централизованного водоснабжения, колодцев, открытых водоемов (реки, озера), плавательных бассейнов, сточ­ные жидкости.

Отбор проб воды. Из открытых водоемов пробы воды отбира­ют с глубины 10. 15 см от поверхности и на расстоянии 10. 15 см от дна. Водопроводную воду набирают в стерильные флаконы объемом 0,5 л с притертой пробкой. Предварительно кран обжи­гают и спускают воду в течение 10. 15 мин. Хлорированную воду перед исследованием нейтрализуют тиосульфатом натрия из рас­чета 10 мл на 1л воды. Бактериологическое исследование проб воды следует проводить в течение двух часов после отбора или шести часов при температуре хранения 1. 5°С.

Определение микробного числа воды. Водопроводную воду засе­вают в количестве 1мл, воду открытых водоемов — по 1,0; 0,1; 0,01 мл. Все пробы вносят в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10. 12 мл расплавленного и охлажденного до 40. 45 °С питательного агара, который тщательно перемешивают с водой. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 1. 2сут. Воду из открытых водоемов засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых инкубируют при 37 ºС в течение суток, другую — 2 сут при 20 °С. Затем подсчитывают количество выросших на поверхности и в глубине колоний и вычисляют микробное число воды — количество микроорганизмов в 1 мл.

Определение коли-титра и коли-индекса воды. Минимальное количество воды в мл, в котором обнаруживают бактерии группы кишечных палочек (БГКП), называют коли-титром воды, количество БГКП, содержащихся в 1л исследуемой воды, называют кол и-и ндексом воды. Коли-титр и коли-индекс воды определяют титрационным (бродильным) ме­тодом или методом мембранных фильтров.

Титрационный метод. В глюкозо-пептонную среду (1%-я пептонная вода, 0,5%-й раствор хлорида натрия, 0,5%-й раствор глюкозы, индикатор Андреде и поплавок) проводят посевы различных объемов воды.

Метод мембранных фильтров. Определенный объем воды про­пускают под давлением через мембранный фильтр № 3, предва­рительно стерилизованный кипячением в дистиллированной воде. Водопроводную воду и воду артезианских скважин фильт­руют в объеме 333 мл. Чистую воду открытых водоемов фильтру­ют в объеме 100, 10, 1 и 0,1 мл, более загрязненную воду перед фильтрованием разводят стерильной водой. Фильтры накладыва­ют на агар Эндо в чашки Петри и после инкубации при 37 °С в течение суток подсчитывают количество выросших красных колоний. Из двух-трех колоний делают мазки, окрашивают их по Граму и ставят оксидазный тест. Грамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, принадлежат к БГКП. По существующим нормативам (ГОСТ 2874—82) питьевую воду считают качествен­ной, если ее коли-индекс не более 3, а микробное число — не бо­лее 100.


Общепринятым дополнительным показателем фекального загрязнения воды служит количество S.faecalis. Для определе­ния его титра цельную воду и ее 10-кратные разведения засева­ют в жидкую элективную среду (щелочная полимиксиновая сре­да). После инкубирования при 37 ºС в течение двух суток, а за­тем еще через сутки и двое суток делают высевы на плотные элективные среды. Фекальные стрептококки идентифицируют по морфологическим, культуральным и тинкториальным свой­ствам.

Есть данные о корреляции между содержанием в воде фекаль­ных кишечных палочек и фагами бактерий группы кишечных па­лочек. Поэтому определение данных фагов служит косвенным показателем возможного присутствия кишечных палочек в ис­следуемой пробе воды.

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха. Мик­рофлора воздуха зависит от микрофлоры почвы и воды. Воз­дух — неблагоприятная среда для обитания микроорганизмов из-за отсутствия питательных веществ, действия солнечных лучей, высушивания. Наряду с сапрофитами в воздухе могут находиться патогенные бактерии, споры грибов родов Aspergillus, Mucor и др.

Санитарную оценку воздуха осуществляют по двум показате­лям: 1) определение микробного числа воздуха; 2) определение количества санитарно-показательных бактерий — гемолитичес­ких стрептококков и стафилококков.

Количественные микробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), ас­пирации или фильтрации.

Седиментационный метод осаждения Коха. Чашки Петри с МПА оставляют открытыми на 5. 10 мин. Для определения са­нитарно-показательных бактерий берут чашки Петри с кровя­ным МПА и время экспозиции увеличивают до 40 мин. Чашки выдерживают при 37 °С и комнатной температуре 24 ч и подсчи­тывают выросшие колонии.

Микробное число воздуха (общее количество бактерий в 1 м3) определяют по формуле Омелянского

Х= а * 100 * 1000 * 5 / (b * 10 * T),

где X— количество микробов в 1 м 3 (1000 л) воздуха; а — количество выросших ко­лоний в чашках; b — площадь чашки; Т— время, в течение которого чашка была открыта; 5 — время по правилу Омелянского; 10 — объем воздуха в литрах. (Прави­ло Омелянского предусматривает, что на поверхности агара в чашке Петри площа­дью 100 см 3 за 5 мин из воздуха оседает такое количество микробов, которое нахо­дится в его 10 л.)

Прямое обнаружение патогенных микробов воздуха проводят только при специальных показаниях.


Аспирационный метод. Более точный количественный способ определения микробного числа воздуха, так как посев микроор­ганизмов из воздуха производят с помощью приборов. При использовании аппарата Кротова воздух с заданной скоростью за­сасывается через щель плексигласовой пластины и ударяется о поверхность питательной среды открытой чашки Петри, находя­щейся на вращающейся подставке, благодаря чему происходит равномерный посев бактерий из воздуха на поверхность МПА (при определении микробного числа) или кровяного МПА (при выделении гемолитических стафилококков и стрептококков). После инкубации в термостате в течение двух суток подсчитыва­ют количество выросших колоний и определяют микробное чис­ло воздуха. При исследовании воздуха могут быть использованы и другие приборы (Дьякова, Киктенко, ПАБ-1 — прибор аэро­зольный бактериологический и ПОВ-1 — прибор для отбора воз­духа). В практику входят ускоренные методы индикации микро­флоры воздуха с помощью мембранных фильтров, каскадных им-пакторов, фильтров Петрякова и др.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы. Анализ почвы включает в себя определение микробного числа, коли-тит-ра, перфрингенс-титра и титра термофильных бактерий. По эпи­демиологическим признакам проводят определение в почве па­тогенных микроорганизмов: сальмонелл, шигелл, возбудителей столбняка, ботулизма, злокачественного отека, сибирской язвы. Бактериологический анализ почвы нужен при выборе террито­рии под пастбище, ферму, хозяйственные постройки, детские сады, больницы и др.

В лаборатории почву измельчают, освобождают от камней, ос­колков стекол, корней растений, просеивают через сито, тща­тельно перемешивают и отвешивают 30 г. В колбу на 500 мл наливают 270 мл стерильной водопроводной воды и вносят в нее отвешенную пробу почвы, все интенсивно встряхивают 10 мин, не давая отстояться частицам суспензии, готовят серию десятикратных последовательных разведений. Для относительно чис­тых почв достаточно 4 степени разведения, для загрязненных — 6. 9 разведений. В штатив ставят нумерованные пробирки с 9 мл стерильной воды в каждой. В первую вносят 1 мл суспензии про­бы почвы, смешивают, затем 1 мл из первой пробирки вносят во вторую, смешивают, из нее — 1 мл в третью и т. д. В результате в пробирке № 1 получается разведение 1 : 100, № 2 — 1 : 1000 и т.д. Подготовленные таким образом пробы почвы исследуют.

Определение общего микробного числа. Из последних 3. 4 про­бирок с разведенной суспензией отдельными стерильными пи­петками вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри (каждое раз­ведение в отдельности). В каждую чашку добавляют еще по 10. 15 мл расплавленного и охлажденного до 45 ºС МПА. Равно­мерными осторожными круговыми движениями содержимое ча­шек перемешивают, оставляют на столе для уплотнения (затвердения) агара. С застывшей средой чашки перевертывают вверх дном, надписывают и помещают в термостат для культивирова­ния на 24. 48 ч при 37 °С. Выросшие колонии подсчитывают в каждой чашке, умножают на степень разведения, полученные числа суммируют и вычисляют среднеарифметическое число, что составит количество микробов, содержащихся в 1 г почвы.

Определение коли-титра, перфрингенс-титра и титра термо­фильных бактерий почвы. Для определения коли-титра почвы раз­личные разведения почвенной взвеси засевают по 1 мл в пробир­ки со средой Кесслера (на 1л дистиллированной воды — 10г пептона, 50 мл бычьей желчи — 2,5 г лактозы, 4 мл 1%-го водного раствора генцианвиолета) и инкубируют при 43 ºС в течение 48 ч. В дальнейшем исследования проводят по схеме, применяемой при определении коли-титра воды. Наибольшее разведение поч­венной суспензии, в котором отмечена ферментация лактозы (газообразование), соответствует коли-титру почвы. Для опреде­ления перфрингенс-титра почвы различные разведения почвен­ной суспензии по 1 мл засевают в пробирки со стерильным обез­жиренным молоком или железосульфитной средой Вильсона— Блера, приготовленной ex tempore. Посевы инкубируют при 43 °С в течение 24. 48 ч, после чего учитывают результаты по сверты­ванию молока или по образованию черных колоний С. perfringens в агаровом столбике среды Вильсона—Блера. Из колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют и вычисляют перфрингенс-титр, который соответствует наибольшему разведе­нию почвы, вызвавшему почернение и разрыв среды Вильсона— Блера в первые 12 ч роста.

Для определения титра термофильных бактерий разведения почвенной суспензии по 1 мл вносят в чашки Петри, заливают расплавленным и охлажденным агаром. Посевы инкубируют в течение суток при 60 ºС, а затем подсчитывают количество вы­росших колоний и пересчитывают на 1 г почвы.

Санитарно-микробиологическую оценку почвы проводят по комплексу показателей, из которых наиболее важный ление степени фекального загрязнения.


ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Определить микробное загрязнение воздуха.

2. Провести исследование воды с целью установления мик­робного числа и коли-титра.

3. Определить микробное число и перфрингенс-титр почвы.

1. Что такое санитарно-показательные микроорганизмы?

2. Как определяют коли-титр воды?

3. Как определяют микробное число почвы?

4. Как определяют перфрингенс-титр почвы?

5. Какие методы применяют для определения микробного числа воздуха?

6. Что такое санитарно-показательные микробы воздуха и как их определяют?

Одним из видов анализа воды является ее бактериологическое исследование. Бактериологический анализ предусмотрен для определенных видов воды.

Он регламентируется различными документами, одним из которых является ГОСТ 18963-73. При анализе используется специальное оборудование.

Что это такое и какие цели исследования?

Бактериологический анализ является одним из способов оценки того, в каком количестве и какие конкретно виды бактерий присутствуют в воде.


Анализ имеет следующие цели:

  • определение количества микроорганизмов, присутствующих в воде;
  • оценка этого количества;
  • выявление конкретных видов бактерий, находящихся в воде;
  • проверка воды на наличие опасных для человека микроорганизмов;
  • выбор оптимального варианта очистки воды.

Виды вод, для которых используют санитарно-бактериологический тест

Исследование на наличие микроорганизмов предусмотрено для следующих видов вод:

  • водопроводная;
  • из колодцев;
  • из закрытых водоемов (прудах, котлованах);
  • из рек, в которых предполагается купание людей;
  • артезианская (добытые из скважин);
  • грунтовые (взятые из подземных верхних слоев земли);
  • родниковая;
  • сточные.

Регламентирующие документы

Исследование воды на наличие микроорганизмов регламентируется ГОСТами и СанПиНами. Основным документом является ГОСТ 18963-73. В нем зафиксированы способы бактериологического анализа воды, которая используется для питья.

В этом документе прописаны:

  1. способы отбора проб воды для исследования;
  2. правила их хранения;
  3. правила перевозки в лаборатории.

Также в ГОСТе прописана применяемая при теста аппаратура. Указаны используемые реактивы вместе с питательными средами. Подробно прописана подготовка к исследованию, сама процедура анализа.

  • Применяется и ГОСТ 24849-2014. В этом стандарте прописаны методики бактериологического исследования воды в полевых условиях.
  • Некоторые положения касательно анализа воды на наличие микроорганизмов зафиксированы в ГОСТе Р 51232-98. Там прописаны способы бактериологического исследования воды для питьевых нужд.
  • В СанПиН 2.1.4 1074 01 зафиксированы требования касательно качества воды, идущей на питьевые нужды. В документе содержатся нормативы по бактериологическому составу питьевой воды, согласно которым она может считаться безопасной.

На наличие каких бактерий проводится тест?

В процессе анализа вода исследуется на две разновидности микроорганизмов:

  • Первая из них – колиформные. Это бактерии, которые принадлежат к разным видам кишечной палочки.
  • Вторая разновидность – термотолерантные колиформные микроорганизмы или фекальные бактерии, хорошо размножающиеся при температуре в 43-45 0 С.

Применяемое оборудование


При исследовании используется такое оборудования:

  • банки с широким горлышком;
  • стеклянные воронки;
  • конусовидные колбы;
  • колбы вместе с тубусом;
  • стеклянные флаконы;
  • лабораторная посуда;
  • пипетки;
  • цилиндры;
  • бактериологические пробирки;
  • спиртовки;
  • лабораторные стаканы;
  • покровные и предметные стекла;
  • бактериологические чаши;
  • пробирные поплавки;
  • электрический автоклав;
  • фильтровальные аппараты;
  • кристаллизаторы;
  • вакуумный насос;
  • лабораторные весы.

Для анализа также используется водоструйный насос. Применяется его лабораторный вариант, выполненный из стекла. Используется водяная баня. Обязательным элементом является биологический микроскоп.

Применяются также:

  1. осветители;
  2. металлические пеналы;
  3. сигнальные часы;
  4. сетчатые пластины;
  5. увеличительные лупы;
  6. pH-метры (для измерения кислотности);
  7. дистилляторы.

Дополнительно используются:

  • электрические термостаты, они предназначены для выращивания микроорганизмов при определенной температуре.
  • счетный прибор для измерения выращенных колоний бактерий и сушильные шкафы.

Обязательным элементом являются холодильники. Используются как электрические, так и газовые с температурным режимом от 4 0 С до 6 0 С. Могут применяться походные сумки-холодильники, если бактериологический анализ проводится в полевых условиях.

Забор и транспортировка

Для проведения исследования требуется правильно подготовить воду. Ее забор делается по схеме:


  1. Берется только стерильная бутылка.
  2. Водопроводный кран, откуда будет делаться забор воды, предварительно обжигается.
  3. Из крана на протяжении 7-10 минут должна сливаться вода. Только после этого ее можно набирать в стерильную емкость.
  4. Тара наполовину набирается водой, закрывается пробкой и перевозится в лабораторию. При этом вода при доставке к месту анализа не должна контактировать со стерильной пробкой.

Сам анализ проводится по следующему плану:

  1. Осуществляют подготовку лабораторной посуды и всех материалов. Вся посуда стерилизуется, промывается и тщательно сушится. Стерилизация происходит в сушильном шкафу. Температура внутри него должна быть порядка 160-165 0 С. Посуда обрабатывается сухим жаром на протяжении часа. Вместо сушильного шкафа может применяться автоклав. В нем температура ниже – порядка 126 0 С. Обработка длится полчаса.
  2. Простерилизованную посуду вынимают из шкафа только после того, когда он остынет до температурных значений меньше 60 0 С.
  3. Обработанную посуду помещают в лабораторные шкафы. Они должны плотно закрываться.
  4. Готовят стерильную воду. Сначала исследуемая вода разливается по флаконам, которые закрываются пробками. После этого флаконы с водой стерилизуются в автоклаве в течение 20 минут при температуре 120 0 С. Такая вода пригодна для использования в течение 2 недель.
  5. Готовят питательную среду. Ее компонентами может быть как мясной бульон, так и глюкоза, лактоза или фильтрованная желчь скота.
  6. Готовят химические реактивы для конкретного анализа.
  7. Подготовленную питательную среду ставят на водяную баню, после чего охлаждают до 45-50 0 С.
  8. Расставляют стерильные чаши с пометками.
  9. Берут несколько проб питательной среды и делают два посева в стерильные чаши.
  10. Колбы со взятой для анализа воды открывают, обжигают их горлышки и немного продувают их воздухом через пипетку. Она должна быть стерильной.
  11. Чистой палочкой делается забор воды. Она добавляется в стерильные чаши, которые закрываются пробкой.
  12. Взятая вода заливается остуженным питательным раствором. Чаша со смесью быстро перемешивается вращательными движениями. Далее чаша ставится на ровную поверхность. Смесь внутри нее должна застыть.
  13. Чаша с застывшим раствором переворачивается вверх дном и ставится в термостат. Там создается оптимальная среда для выращивания посевов (37 0 С). Чаша находится в термостате сутки.
  14. Чаша с выращенными колониями микроорганизмов кладется на затемненный фон вверх дном. При помощи лупы делается подсчет количества появившихся колоний бактерий. При подсчетах учитывается число микроорганизмов на 1 см 3 взятой для анализа воды.
  15. Результаты фиксируются в протоколе и регистрационном журнале. Дополнительно фиксируются особые условия, при которых проходил анализ.

Стоимость

Примерная цена процедуры для предприятий составляет 6-8 тысяч рублей. Физические лица могут заказать исследования примерно за 2 тысячи рублей.

Бактериологический анализ можно заказать только в специальных лабораторных центрах. У таких организаций обязательно должна быть лицензия (аттестат) и заключение о том, что они имеют все условия для измерений.

Очистка от обнаруженных бактерий


Очистка воды происходит в несколько этапов. При наличии в ней бактерий применяется хлорирование. Также она очищается путем добавления в нее ионов серебра.

Еще одним эффективным методом является угольная сорбция. В воду добавляется активированный уголь, который поглощает опасные примеси.

Также для очистки воды от бактерий применяется ее ультрафиолетовое обеззараживание при помощи ламп и озонирование, в ходе которого вода очищается осушенным воздухом.

Заключение

Бактериологический анализ воды – способ оценки количества и конкретного вида присутствующих в ней бактерий. Основная цель процедуры – оценка качества воды и проверка ее безопасности.

Чаще всего исследуется водопроводная и речная вода, а также вода из колодцев. Если исследование показало наличие бактерий в воде, то ее очищают методами хлорирования, озонирования, угольной сорбции, ультрафиолетового обеззараживания.

Читайте также: