На выход вторичных продуктов в культуре ткани растений влияет

Обновлено: 04.10.2024

Клеточная биотехнология базируется на использовании культуры клеток, тканей и протопластов. Для того чтобы манипулировать клетками, нужно выделить их из растения и создать такие условия, при которых они могли бы жить и размножаться вне растительного организма. Метод культивирования изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получил название культуры изолированных тканей и приобрёл особое значение в связи с возможностью его использования в биотехнологии.

Содержание

Введение ………………………………………………..…………………………….….3
1. Векторы генетической инженерии растений…………………….………….……. 8
2. Культура каллусных тканей и их морфогенетические особенности……….……. 8
3. Суспензионная культура………………………. ……………………….……..…. 12
4. Клональное размножение растений……………………………………….……..…14
5. Культивирование протопластов………………………………………………. …19
6. Перспективы получения лекарственных средств на основе клеток растений…. 21
Заключение……….………………………………………………………………. …. 26
Список литературы. …………………………………………………

Работа состоит из 1 файл

бт.doc

В качестве источников углерода используют глюкозу, сахарозу или их смеси. Сахароза не всегда может быть подходящим компонентом среды для культивирования протопластов. В некоторых случаях требуется добавление рибозы, ксилозы, фруктозы, маннозы или других сахаров. Кроме этого в состав питательных сред должны входить такие витамины, как тиамин, пиридоксин и никотиновая кислота. При небольшой плотности высева требуется добавление и других витаминов.

Маннит, сорбит и их комбинация могут быть использованы в качестве осмотических стабилизаторов.

В качестве источников органического азота применяют обычно гидролизат казеина, который представляет собой смесь аминокислот. Его добавляют в том случае, если в среде недостаточное количество неорганического азота, а его содержание уже увеличить нельзя.

Ауксины и цитокинины требуются для клеточного деления и дальнейшего развития растительных клеток. Обычно в качестве ауксинов используют 2,4-дихлорфеноксиуксус-ную кислоту и нафтилуксусную кислоту, в качестве цитокининов — кинетин, бензиладенин. Оптимальные концентрации варьируют, и их подбирают в каждом отдельном случае.

Большое внимание при культивировании протопластов уделяется соблюдению и других условий среды — так, рН среды — 5,4—5,8, температура — 22—28 °С. Иногда требуется слабое освещение. Жизнеспособность протопластов зависит от начальной плотности высева. Обычно их культивируют при плотности высева от 104 до 106 на 1 мл среды.

Можно изменять соотношения аммонийного и нитратного азота в зависимости от потребности в них клеток, увеличивать концентрацию СаСl₂ для стабилизации образующейся клеточной стенки. После того как образовались и начали делиться клетки, они могут быть помещены в условия культивирования, применяемые обычно для клеток растений.

Иногда для повышения числа делящихся протопластов в среду добавляют различное количество кондиционированной среды, на которой некоторое время росли клетки, или же используют так называемый кормящий слой, состоящий из облученных клеток. Клетки в кормящем слое не делятся, но остаются метаболически активными, т.е. продукты жизнедеятельности инактивированных клеток восполняют необходимые компоненты среды. Обычно эти методы применяются в том случае, если протопласты высевают на питательную среду с небольшой плотностью.

Единичные протопласты можно культивировать в небольших количествах среды в пластмассовых или стеклянных чашках Купрака, а также в микрокамерах. Такое культивирование необходимо для получения колоний из одной клетки и для наблюдения за ее дальнейшим развитием. В последующем при нанесении таких колоний на агаризованную среду определенного состава можно получить каллус, а затем и целое растение.

Как правило, при благоприятных условиях выделения и культивирования на третьи-четвертые сутки с момента нысева наблюдаются первые деления протопластов. В большинстве случаев затем образуются многоклеточные агрегаты, развивающиеся в дальнейшем в каллус, который способен регенерировать целое растение. Растения-регенеранты из протопластов получены в настоящее время для целого ряда сельскохозяйственных культур.

6. Перспективы получения лекарственных средств на основе клеток растений

В 60-х гг. XX в. была доказана способность клеток и тканей растений к росту, делению, органообразованию и вторичному метаболизму, т.е. возможность любой клетки образовывать полноценное растение, поскольку генетический и физиологический потенциал, необходимый для вторичных метаболитов, присутствует в каждой клетке.

В настоящее время разработано промышленное получение ряда ценных веществ из растительной биомассы методом in vitro. Хорошо налажен в Японии выпуск следующих лекарственных препаратов: шиконин (из воробейника аптечного), убихинон (из табака), дигоксин (из наперстянки шерстистой), диосгенин (диоскорея дельтовидная).

Промышленное производство лекарственных веществ на основе культур клетки гарантирует достаточный выход продукта. Это можно подтвердить путем сравнения процента выхода активного начала из биомассы цельного сырья, взятого в эквивалентном количестве.

Для выращивания культур необходимы высокопродуктивные клетки растения. Так, для культивирования родиолы розовой более перспективными являются клетки корневой системы.

Для обеспечения роста и синтеза продуктов вторичного метаболизма необходим подбор ингредиентов питательной сре-ды, который проводят и оценивают по двум направлениям:

•влияние среды на формирование биомассы;

•влияние состава среды на синтез вторичных продуктов.

Компоненты субстрата для выращивания культур клеток растений должны включать: основные неорганические питательные вещества, источники железа, органические добавки (витамины, регуляторы роста), источники углерода.

Существует несколько стандартных питательных сред, широко используемых при культивировании, но количество регуляторов роста в них варьирует в зависимости от вида растений. На выход продукта может влиять концентрация источника углерода и других компонентов среды. Так, в культуре клеток барвинка розового увеличение выхода алкалоидов было связано с повышением в среде концентрации сахарозы, а в культуре клеток моркови накопление антоциана стабилизировалось, когда в качестве лимитирующего фактора использовали фосфаты.

В качестве регуляторов роста и синтеза продуктов вторичного метаболизма используют ауксины, среди которых индолил-3-уксусная кислота, нафтилуксусная кислота, 2,4-дихлорфенок-сиуксусная кислота, а также цитокины. На синтез вторичных метаболитов влияют внесенные в питательную среду известные предшественники, которые могут стимулировать определенные ферментативные пути метаболизма. Введение фенилаланина в среду для культивирования клеток увеличивало выход диосгенина на 100 %. На степень накопления вторичных метаболитов влияют также свет, температура, рН, а при суспензионном культивировании — аэрация и перемешивание, состав питательной среды и концентрации ее компонентов.

Таким образом, создавая для каждой культуры клеток растений благоприятные условия на стадии роста и синтеза вторичных метаболитов, можно гарантировать получение любого продукта с метаболической активностью.

Для накопления промышленного сырья путем выращивания клеток и тканей растений используют каллусные и суспензионные культуры; последние получают из каллуса.

Преимущества получения ряда фармакологических веществ на основе культивирования растений заключаются в следующем:

1. независимость от климатических, сезонных и географических условий;

2. стабильность выпуска фарамацевтической продукции в течение года;

3. уменьшение площади почвы, на которой выращиваются лекарственные растения.

Культуры клеток растений могут синтезировать все классы соединений вторичного обмена (алкалоиды, терпеноиды, фенолы, гликозиды, бетаины). Синтез лекарственных веществ происходит либо во время эксконенциальной фазы, когда наиболее интенсивны метаболические процессы, либо в стационарной фазе развития популяции клеток. Суспензионные культуры — это процесс получения биомассы в течение нескольких десятков суток в биореакторах с постоянным перемешиванием и при соблюдении правил асептики.

В России разработана технология получения субстанций женьшеня, родиолы розовой, унгерии на основе каллусных культур. Данные препараты нашли применение в медицине, косметологии и пищевой промышленности.

Выращивание растительных клеток осуществляется в биореакторах различного объема (до 200 л) с системами перемешивания (турбинное, восходящими потоками воздуха, встряхивание).

В настоящее время для получения биомассы и продуктов пторичного метаболизма применяют периодическое и проточное культивирование.

Для регуляции процесса проточного культивирования используют хемостатный и турбидостатный методы, т.е. такие подходы, как и при использовании в качестве продуцентом клеток микроорганизмов. Однако для процесса ферментации применяют специализированные типы биореакторов С пневматическим перемешиванием. Наиболее разработаны периодические способы выращивания растительных культур.

Перспективна технология получения БАВ с помощью иммобилизованных клеток, обладающих более низкой скоростью роста и способностью к интенсивной выработке метаболитов. Одно из условий при иммобилизации клеток — выделение метаболита в питательную среду, из которой он может быть легко извлечен (например, клетки, продуцирующие алкалоиды). Преимущества иммобилизованных клеток по сравнению с суспензионными культурами:

•многократное использование биомассы;

•четкое отделение биомассы от продуктов метаболизма;

•увеличение продолжительности культивирования на стадии продуцирования;

•получение большого количества вторичных метаболитов.

Другим вариантом использования культур клеток растений в фармацевтической промышленности следует считать их применение для биотрансформации.

Биотрансформация — метод, использующий ферменты, локализованные в клетке растения, которые способны изменять функциональные группы добавленных извне химических соединений. Он применяется для повышения биологической активности данной конкретной химической структуры и осуществления серии специфических химических реакций за счет включения одного или нескольких последовательно связанных ферментов.

Производство серпентина на основе суспензионных культур частично дифференцированных клеток меристемы Catharatus roseus оказалось эффективным и экономически оправданным лишь после того, как были получены субклоны, способные накапливать за 10-суточный цикл выращивания до 25 г сухого вещества на 1 л суспензионной культуры.

Аналогичная ситуация имела место и при организации биотехнологического производства настойки женьшеня. Количественный выход биологической субстанции в пересчете на сухое вещество каллуса женьшеня было ниже, чем из женьшеня, полученного при плантационном выращивании, примерно в три-четыре раза.

ОСОБЕННОСТИ ВТОРИЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА В КУЛЬТУРАХ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК

м.н.с. В. Филиппова

Растения являются незаменимым источником получения очень многих практически важных веществ. При этом следует подчеркнуть, что промышленное получение некоторых соединений, например, сердечных гликозидов, флавоноидов, кумаринов, эфирных масел достигается только путем выделения их из растительного сырья. Между тем возможности получения так называемых " метаболитов интереса" в достаточном количестве зачастую ограничены. Это связано с сокращением ресурсов некоторых ценных дикорастущих растений, принадлежностью многих лекарственных растений к группам эндемов, редким и исчезающим видам. В связи с этим большой интерес в качестве источника биологически активных веществ представляют культуры растительных клеток.

История развития метода культуры тканей начинается на рубеже XIX-XX вв. с опытов немецких ученых Фехтинга, Рехингера и Хаберландта, которые пытались выращивать на растворах сахарозы изолированные из растений кусочки тканей, группы клеток, волоски. Не достигнув экспериментальных успехов, эти исследователи, однако, высказали ряд важных идей и гипотез, которые были подтверждены значительно позже. В 1947 г. Телл и Готре впервые показали способность синтеза вторичных соединений, а именно алкалоидов, в клеточной культуре белены черной. В нашей стране систематические исследования в этой области были начаты Р.Г. Бутенко в 1957 г. в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева АН СССР, которая получила клеточные культуры женьшеня и ряда других лекарственных растений [1]. До начала 70-х годов спектр соединений, образуемых клеточными культурами в количествах, характерных для целого растения, был очень ограничен. Это Nicotiana tabacum, в которой некоторые исследователи наблюдали синтез относительно больших количеств никотина (0.7 %), Dioscorea deltoidea, накапливающая до 1.6 % диосгенина [9], Ammi visnaga, содержащая в 20 раз больше виснагина в культуре ткани, чем в растении [8], и некоторые другие. Экспериментальные данные, накопившиеся к этому периоду, указывали, что биосинтез многих соединений в недифференцированных тканях сильно подавлен, а появление продуктов во многих случаях было связано с регенерацией корней, побегов и других морфологических структур, т.е. с процессом дифференциации ткани. С начала 70-х годов список фармакологически ценных вторичных продуктов биосинтеза, обнаруженных в культурах тканей, значительно расширился. В 80-е годы на основе метода культуры тканей возникли новые направления биотехнологии, важнейшим из которых была клеточная инженерия — генетическое конструирование новых форм.

Культуры растительных клеток могут синтезировать самые разнообразные по химической природе вещества. Среди них эфирные масла, фенольные соединения, алкалоиды, стероиды, терпеноиды и др. Но несмотря на то, что биомасса культивируемых клеток с начала 80-х годов используется в качестве источника экономически важных продуктов, ряд трудностей и нерешенных вопросов сдерживает широкомасштабное применение культивируемых клеток, обусловливает нерентабельность биотехнологических производств многих ценных видов растений. Содержание практически важных вторичных метаболитов в высших растениях определяется активностью их синтеза, эффективностью транспорта и депонирования в органах запаса растения. Все эти признаки определяются генетически, находятся под контролем развития организма и максимально реализуются в оптимальных внешних условиях.

Неотселектированные дедифференцированные клетки накапливают, как правило, незначительное, по сравнению с интактным растением, количество веществ специализированного обмена. Только благодаря правильно разработанной стратегии получения высокопроизводительных штаммов к настоящему времени получены культуры тканей, в которых содержание вторичных продуктов достаточно велико, чтобы служить лекарственным сырьем. Однако для многих культур неоднократные попытки различных исследователей определить условия накопления продуктов, характерных для родительских растений, были неудачными. Это касается, в частности, индукции морфинановых алкалоидов в культуре ткани Papaver somniferum, винбластина — в Catharanthus roseus, хинолиновых алкалоидов — в Cinchona ledgeriana, дигоксина — Digitalis lanata и др. Чаще всего в клеточных культурах при длительном культивировании снижается или совсем теряется способность клеток накапливать соединения вторичного метаболизма из-за возникновения малоактивных, но более жизнеспособных вариантов. Снижение биосинтетического потенциала в культуре in vitro происходит из-за подавления дифференциации клеток и их специализации, т.е. в результате потери способности к реализации генетической информации, относящейся ко вторичному обмену [3].

Важной характеристикой клеточной популяции является ее стабильность в отношении синтеза, транспорта и депонирования метаболитов " интереса". Стабильность может сохраняться в течение всего времени существования популяции. При этом сохраняются и активно работают гены синтеза, системы транспорта и депонирования. Возможен случай постепенного (в течение нескольких лет) увеличения числа клеток со сниженным синтезом метаболитов. И, наконец, в случае полной нестабильности клетки популяции очень быстро теряют свой биосинтетический потенциал. Вопрос о стабильности и нестабильности тесно связан с изучением биологии клеток разных популяций. В организме растения синтез метаболитов, их транспорт и отложение в запас на ходятся под строгим контролем развития. Часто эти события не только разведены во времени, но и происходят в разных органах растения. Клетка вне организма обычно не транспортирует метаболиты в соседние клетки или в питательную среду, хотя в ряде случаев это явление наблюдается (биосинтез алкалоидов в клеточных культурах мака). На выход вторичных продуктов в культурах растительных клеток влияют многие факторы, однако все способы регуляции вторичного метаболизма в культуре in vitro можно разделить на две группы: физиологическая и генетическая регуляции синтеза вторичных метаболитов.

Подбор физических и химических условий культивирования является наиболее простым и часто применяемым подходом для повышения продуктивности. В основе физиологического регулирования процессов вторичного синтеза лежит изучение влияния факторов культивирования на рост и метаболизм клеток. Большое внимание уделяется таким факторам культивирования, как регуляторы роста, минеральные вещества, витамины, сахара, свет, аэрация, температура, а также иммобилизация клеток и обработка элиситорами. Во многих случаях эти работы привели к успеху, однако они выполняются эмпирически и поэтому длительны и трудоемки [2, 4]. К тому же следует оговориться, что несмотря на эффективность повышения уровня биосинтеза физиологическими методами, добиться количественно значимых изменений в дедифференцированных клеточных культурах, сопоставимых с уровнем в интактном растении, лишь за некоторым исключением, не удается. Стимулирование же синтеза элиситорами носит, к сожалению, временный характер.

Более эффективной в этом плане является генетическая регуляция синтеза вторичного метаболизма в системе in vitro. С использованием экспериментального мутагенеза стало возможным получение довольно продуктивных штаммов. С помощью этого метода в ИФР РАН был получен мутантный штамм Dioscorea deltoidea DM-0.5 (мутаген — N- нитрозометилмочевина, доза — 0.5 ммоль/ч) — сверхпродуцент фуростаноловых гликозидов, высокая способность к синтезу — 6-8 % в сухой массе клеток — сохранялась в течение длительного времени (около 30 лет) [7]. Следует отметить, что метод индуцированного мутагенеза носит также эмпирический характер и не менее трудоемок, чем физиологические способы регуляции вторичного метаболизма. Ряд перспективных культур был получен в результате генетической т рансформации и других генно-инженерных манипуляций. Особенно следует отметить трансформанты, полученные с помощью плазмид агробактерий (Agrobacterium rhizogenes A. tumefaciens), в частности " бородчатых корней", продуктивность которых оказалась достаточно высокой. Поскольку одной из основных причин снижения уровня биосинтеза в культурах in vitro является дедифференциация ткани, то один из путей повышения синтеза вторичных соединений в клеточных культурах связан с дифференцировкой ткани и органогенезом. Повышение содержания вторичных соединений было отмечено в органогенных культурах видов Senecio, Lichroa ledgeriana.

Известно, что физиологическое действие условий in vitro приводит к генетической гетерогенности системы [5, 6]. Речь идет о так называемой сомаклональной изменчивости, которая возникает при длительном культивировании. На генетической изменчивости клеток в культуре in vitro основана селекция штаммов, обеспечивающая большой выход ценных продуктов вторичного метаболизма растительных клеток. При клонировании суспензионной культуры клеток паслена были выделены линии, накапливающие больше 3 % соланидина [10], получен штамм клеток руты душистой, содержащей в 20 раз больше алкалоида рутакридона по сравнению с растением. Биотехнологическое использование клеточных культур в качестве сырья в промышленных масштабах становится реальностью. В виде примеров можно привести производство шиконина из Lithospermum erythrorhison в Японии (фирма Toshiba) — ценного для косметики, пищевой промышленности и медицины растительного нафтохинонового пигмента. В России производство культуры ткани женьшеня ("Биоженьшень") осуществляется на биохимических заводах. Экстракт, получаемый из биомассы женьшеня, используется в качестве биологически активной добавки к кремам, лосьонам, а в пищевой промышленности — для приготовления тонизирующих напитков. Для получения ценного противоаритмического препарата аймалина на ХПХФО "Здоровье"(Харьков, Украина) организовано опытное производство биомассы культуры т каней Rauwolfia serpentina. Таким образом, возможности, открытые методом культуры тканей, позволили в настоящее время создать биотехнологическое производство принципиально новых видов сырья для получения необходимых соединений.

В лаборатории биохимии и биотехнологии растений нашего института также получены значительные результаты по получению культур растительных клеток — продуцентов экдистероидов. В начале 90-х годов с отрудниками нашей лаборатории Э.Н. Ануфриевой и Л.А. Ковлер были получены каллусные культуры Serratula coronata и Ajuga reptans — продуценты экдистероидов. Полученные штаммы различались по степени соответствия интактным растениям по количественному составу экдистероидов и соотношению индивидуальных компонентов. Если в клеточных культурах S. coronata наблюдали заметное снижение уровня биосинтеза по сравнению с интактными растениями (20-100 раз), то ряд каллусных культур A. reptans по суммарному содержанию экдистероидов не уступал дикорастущим растениям. Для обеих клеточных культур была отмечена тенденция к снижению уровня синтеза экдистероидов с увеличением продолжительности культивирования, однако были выявлены штаммы и со стабильным уровнем синтеза. Среди длительно культивируемых каллусных культур S. coronata и A. reptans были выявлены штаммы с относительно высоким содержанием 20-гидроксиэкдизона (экдистероида, обладающего высоким тонизирующим и ранозаживляющим действием), из которых в 1999 г. нами были получены суспензионные культуры. Методы глубинного культивирования клеток высших растений в последние годы привлекают все больший интерес, поскольку этот метод обладает рядом преимуществ перед поверхностным культивированием (каллусными культурами): обеспечение одинаковых условий для всех клеток популяции; увеличение скорости их роста и биосинтетического потенциала; возможность автоматизации процессов.

В настоящее время две высокопродуктивные линии суспензионных культур S. coronata и A. reptans приняты во Всероссийскую коллекцию клеточных культур высших растений (ИФР РАН, Москва), на основе которых возможно создание биотехнологического производства биологически активных экдистероидов.

История метода клеточных культур растений. Методики и подходы.

Работы по изолированию культур, когда зародыши вычленялись из семени и выращивались в искусственных условиях, принадлежат Блоцишевскому (1876), Брауну и Моррису (1892), Боннэ и Саксу (1893). В 1902 г. Г. Габерланд научился культивировать отдельные клетки в течение некоторого времени и выдвинул гипотезу о тотипотентности (свойство клетки реализовать генетическую информацию, обеспечивающую её дифференцировку и развитие до целого организма), которая впоследствии была подтверждена экспериментально.

1. 1834 -1900 гг. - создание и разработка клеточной теории.

2. 1900 –1922 гг. - сформулирована идея культуры тканей.

3. 1922 – 34 гг. - безуспешные поиски методов, обеспечивающих длительное культивирование тканей.

4. 1934 - 39 гг. - детальная разработка техники культуры растительных тканей.

Период 1940 - 1960 гг. значительно расширил список видов растений, выращиваемых in vitro. В 1960 - 1975 гг. положено начало методу получения изолированных протопластов и разработаны методы получения безвирусных растений из меристематических тканей (Р.Г. Бутенко, Ю.Ю. Глеба). Начались эксперименты по созданию установок для глубинного культивирования клеток. Начиная с 1976 г., разрабатывались методы электрослияния протопластов и селекции гибридных клеток, культивирования гаплоидных клеток и получения новых форм и сортов сельскохозяйственных растений, создание системы иммобилизованных клеток для получения различных химических соединений и их биотрансформации. Ведутся работы по переносу генов в растительные клетки и получению трансгенных растений.

Первичные и вторичные метаболиты, их характеристика.

Проблемы синтеза вторичных метаболитов.

Растения с давних времен использовали не только в качестве источника питания, но и как поставщиков широкого набора химических соединений, включая лекарственные препараты, инсектициды, пищевые добавки, отдушки и красители. Даже в настоящее время при успешном развитии микробиологических и химических способов производства растения еще остаются источником тех соединений, производство которых еще слишком сложно, или дорого. Чаще всего основной интерес представляют продукты вторичного метаболизма растений. К веществам вторичного синтеза относят: алколоиды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и др.

На выход вторичных продуктов в культурах растений клеток влияют многие факторы, однако все способы регуляции вторичного метаболизма в культуре in vitro можно разделить на две группы: физиологические и генетические регуляции синтеза вторичных метаболитов. Знание этих закономерностей позволяет регулировать процессы получения ценных веществ.

Питательные среды и особенности выращивания растительных клеточных культур.

В отличие от животной клетки, растительная клетка предъявляет менее жесткие требования к условиям культивирования. Существуют общие требования к выращиванию объектов in vitro. Это, прежде всего асептика, которая необходима и обязательна для культивирования, как отдельных клеток, так и каких-либо фрагментов ткани или органа растения (экспланта). Кроме того, для успешного культивирования клеток и тканей какой-либо культуры необходимо учитывать влияние физических факторов на рост и физиологические характеристики этой культуры на уровне фенотипа и генотипа.

Искусственные питательные среды, содержат ауксины: 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), a-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолил-масляную кислоту (ИМК), индолилуксусную кислоту (ИУК) в концентрации 0,5 - 10 мг/л, в зависимости от вида экспланта. Разработано много питательных сред, но большинство из них представляют модификации основных: Мурасиге-Скуга (МС), Уайта, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга (В5), Линсмайера-Скуга, Хеллера, Чапека и др. Выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях происходит независимо от принадлежности растений к той или иной таксономической группе.

Методы культивирования изолированных клеток и тканей для получения БАВ.

Культура каллусных тканей, или культура тканей. Суспензионная культура. Культивирование отдельных клеток.

Как правило, вторичные вещества получают из каллусной ткани, выращенные на твердой (агаразованной) или жидкой (суспензионная культура) питательной среде. Для производства биологически активных веществ (БАВ) используют каллусную ткань, которую получают твердофазной ферментацией и глубинным суспензионнным культивированием. Каллусная культура – это неорганизованная профилирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. Каллусная клетка имеет свой цикл развития и повторяет развитие любой клетки, включая деление, растяжение и дифференцировку, после чего начинается старение и отмирание клетки. Для того чтобы не произошло старения, первичный каллус через 4-6 недель переносят на свежую питательную среду. Эту операцию называют пассированием. При регулярном пассировании способность к делению может поддерживаться в течение десятков лет.

Фазы ростового цикла в суспензионной культуре.

Ростовая кривая (модельная) имеет S-образную форму Различают следующие фазы ростового цикла:

Латентная фаза (лаг-фаза). В этот период клетки не размножаются, отсутствует их видимый рост, но происходит активный процесс поглощения воды и питательных веществ.
Экспоненциальная (логарифмическая фаза роста). Ограниченный период в ростовом цикле, когда происходит увеличение количества клеток за счет их интенсивного деления.
Линейная фаза. Очень короткая фаза ростового цикла. Удельная скорость роста культуры в этой фазе практически постоянна.
Фаза замедленного роста (ранняя стационарная фаза). В этот период средний размер клеток продолжает возрастать, отмечается гетерогенность клеточной популяции и начало синтеза вторичных веществ.
Стационарная фаза. Культуральная среда истощается по наличию основных компонентов, необходимо проводить субкультивирование суспензионной культуры на свежую среду.
Фаза деградации клеток. Метаболизм прекращается, так как энергетические запасы клеток оказываются исчерпанными. При промышленном синтезе, еще до наступления фазы отмирания, ферментацию останавливают.

Промышленное выращивание клеточных культур и преимущества их использования.

Из сравнения каллусных и суспензионных культур следует, что выход продуктов вторичного метаболизма выше в каллусных культурах, но управление процессом культивирования легче осуществлять при работе с суспензионными культурами. Культуральные системы, функционирующие непрерывно, разделяют на полупроточные и проточные. При полупроточном режиме выращивания через определенные интервалы времени производится отбор части суспензии и разбавление оставшейся суспензии свежей средой. Проточный режим культивирования позволяет осуществлять непрерывное снабжение культуральной системы, свежей средой с удалением равного объема клеточной суспензии.

Преимущества использования клеточных культур заключаются в следующем:

ü Решается проблема дефицита исходного сырья, особенно ценных исчезающих видов растений, не поддающихся плантационному культивированию;

ü Возможно получение фитомассы, полностью свободной от гербицидов, пестицидов, тяжелых металлов и др.;

ü Имеется возможность получения новых веществ, не синтезируемых соответствующим целевым растением;

ü Возможно управление биосинтезом целевых продуктов за счет условий культивирования, состава питательной среды и другими способами;

ü Имеется возможность индустриализации и удешевления производства некоторых БАВ, синтез которых пока не разработан или очень дорог.

Иммобилизация клеток и тканей растений, получение вторичных метаболитов на их основе. Преимущества иммобилизованных растительных клеток перед традиционными способами культивирования. Система культура с плоской основой.

Система колончатой культуры

Новым подходом, направленным на увеличение выхода вторичных метаболитов, является иммобилизация клеток и тканей растений. Клетки помещают в определенные носители: альгинат кальция, агарозные шарики, трехмерные сетчатые структуры из нейлона и т.д. Такие биологические системы более устойчивы к механическим повреждениям, при этом фаза роста клеток совпадает с фазой образования продукта; клетки легко переносятся в новую среду или иные условия культивирования. Основные условия иммобилизации - выделение метаболитов в питательную среду и свободное их извлечение.

Методы иммобилизации клеток делят на 4 категории:

Иммобилизация клеток или субклеточных органелл в инертном субстрате (Catharanthus roseus L., Digitalis lanata L.).
Адсорбция клеток на инертном субстрате. Метод применялся в экспериментах с животными клетками, а также клетками Saccharomyces uvarum, S. cerevisiae, Candida tropicalis, E. coli.
Адсорбция клеток на инертном субстрате с помощью биологических макромолекул (таких, как лектин). Применяется редко, есть сведения об экспериментах с различными линиями клеток человека, эритроцитами крови барана.
Ковалентное связывание с другим инертным носителем, типа КМЦ (натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы). В основном проводились эксперименты по иммобилизации клеток животных и микроорганизмов.

Клетки, иммобилизованные на плоской основе, имеют более высокий уровень синтеза вторичных метаболитов, однако горизонтальная конструкция при промышленном культивировании создает неудобства при работе и требует большей площади, что устраняется в системе колончатой культуры.

Биотрансформация. Биотрансформация стероидных

гликозидов на примере Digitalis lanata.

Культура протопластов. Микроклональное размножение.

Под воздействием электрического поля или с помощью полиэтиленгликоля протопласты могут сливаться друг с другом с образование двух видов новых клеток:

ü Гомокарионы (гомокариоциды), состоящие из клеток одного родителя.

ü Гетерокарионы (гетерокариоциды), состоящие из клеток обоих родителей.

Микроклональное размножение - метод, позволяющий от одной меристемы получить (регенерировать) достаточно большое количество новых растений, в том числе и в культуре in vitro.

Современное состояние и достижения в области биотехнологии лекарственных средств

на основе культур растительных клеток и тканей.

Россия занимает первое место в мире по промышленному производству культур клеток. В настоящее время получено более 30 видов различных изолированных клеточных культур лекарственных растений, продуцирующих БАВ либо на уровне соответствующего интактного растения, либо в большем количестве. В настоящее время в клинической практике используются лекарственные средства, полученные на основе каллусных и суспензионных культур клеток растений: шиконин (кожные заболевания), дигоксин (сердечно-сосудистые заболевания), берберин (кишечные расстройства), диосгенин (противозачаточное средство), панаксозиды (адаптогены, укрепляющие иммунитет).

Трансгенные растения. Методы получения. Трансгенные растения в фармакологии.

Трансгенными называются растения, в которых успешно функционируют гены (или ген), пересаженные из растений или животных других видов. Основным направлением применения трансгеноза для генетической модификации культурных растений является повышение их устойчивости к неблагоприятным воздействиям окружающей среды, в частности вирусам и гербицидам. Чужеродные гены, находящиеся в составе векторных плазмид, вводят в протопласты одним из стандартных способов с использованием эндоцитоза, стимулированного полиэтиленгликолем, электропорации, микроинъекций или бомбардировки микрочастицами, нагруженными векторной ДНК.

Растения дают человечеству десятки тысяч природных продуктов, многие из которых представляют большую ценность для фармакологии и промышленности. Часто такими продуцентами важных лекарственных веществ являются уникальные тропические и эндемические растения, недоступные для их агротехнического производства в умеренных климатических зонах большинства развитых стран мира. Выделение из таких растений генов, определяющих направленный синтез специфических органических соединений, и их перенос в подобранные соответствующие растения превращают их в новые продуценты важных биологически активных веществ (Перенос гена гиосциамин-6-b-гидроксилазы из белены (Hyoscyamus niger L.) в растения красавки (Atropa belladonna L.) превратил продуцент атропина в продуцент скополамина).

Cавушкин А. И., Сидорова Н. А., Прокопюк С. М. Особенности биотехнологии растительных тканей, органов и клеток in vitro при получении фармакологически ценных метаболитов // Journal of Biomedical Technologies. 2015. № 1. С. 23–28.

Методические рекомендации

Введение

Биоинженерные подходы к созданию продуцентов биологически активных веществ (БАВ) из растительных организмов разрабатываются уже приблизительно с середины прошлого века, и на сегодняшний день они претерпели значительные изменения, благодаря развитию различных направлений биологии: геномики, эпигеномики, интерферомики, протеомики, метаболомики, транскриптомики и др. Огромный объём данных, получаемых методами этих разделов науки, очень важен для системной биологии, изучающей сложные биологические системы. К таким системам можно отнести и суспензионные культуры растительных клеток, и культуры каллусных тканей, а также структуру взаимодействий между отдельными клетками в этих культурах. Для оптимизации процессов накопления вторичных метаболитов в таких сложных многокомпонентных системах разрабатываются технологические подходы, основанные на сумме экспериментальных данных, получаемых с помощью вышеупомянутых научных дисциплин. При этом, часто приходится сталкиваться с множеством трудностей как технологического, так и методологического характера. Так, например, секвенирование de novo геномов высших растений является сложной задачей, так как многие растения являются полиплоидами и их геномы содержат значительную долю повторяющихся последовательностей. Также, у высших растений имеются так называемые аллополиплоидные формы, содержащие близкие, но не идентичные геномы, что также усложняет задачу и увеличивает стоимость анализа структуры генома. С другой стороны, данный метод геномики, позволяющий определить весь набор нуклеотидных последовательностей неизвестного генома, предоставляет возможность произвести скрининг генов, вовлечённых в пути биосинтеза продуктов обмена веществ лекарственных растений и, далее, с помощью генноинженерных методов активировать их работу для получения биологически активного вещества необходимого качества и количества.

Одним из перспективных продуцентов БАВ растительного происхождения считают маклюру оранжевую (Maclura pomifera (Raf.) Schneid.). Из соплодий маклюры в официальной медицине многих стран изготавливают лекарства для улучшения сердечной деятельности, антибиотики, составы для лечения поверхностных ран. К основным соединениям маклюры, обладающим биологической активностью, в настоящее время относят два наиболее изученных изофлавона (изомерные соединения флавоноидов) – осайин и помиферин, способные укреплять стенки капилляров. Также большое значение имеют стероидоподобные вещества, найденные в плодах маклюры – лупеол и ситостерол, обладающие противовоспалительными и простатопротекторными свойствами. Исследование этих и других БАВ маклюры на различных объектах в условиях in vitro и in vivo показало, что они обладают антимикробным, антиоксидантным, кардиопротекторным, противоопухолевым действием. Выделяемые из плодов этого растения соединения обладают также иммуномодулирующим действием.

В лаборатории доклинических исследований, клеточной патологии и биорегуляции Института высоких биомедицинских технологий ПетрГУ разрабатываются новые подходы к культивированию клеток и тканей растений продуцентов БАВ. В период с 2014-2015 г.г. в рамках Программы стратегического развития ПетрГУ проведена серия экспериментов по апробации методов получения каллусной культуры Maclura pomifera (Raf.) Schneid. – продуцента широкого спектра физиологически активных веществ, таких как флавоноиды, тритерпеноиды, стероиды, аминокислоты и витамины.

Материалы и методы

Для введения опытного растения в каллусную культуру готовили питательную среду Мурасиге-Скуга согласно прописи (Murashige, 1969) c добавлением витаминов десятикратной концентрации и стимуляторов роста (ауксины и цитокинины). Для получения первичного каллуса готовили несколько сред с различным соотношением регуляторов роста. В качестве ауксинов использовали 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) и 3-индолилуксусную кислоту (ИУК) в диапазоне концентраций 0.5-1 мг/л и 1-5 мг/л, соответственно. Концентрация цитокининов (бензиламинопурин) составляла от 10 -5 до 10 -7 моль/л. Источником эксплантов служили зрелые плоды маклюры. Сначала их отмывали водой с детергентом от загрязнений, обрабатывали спиртом, после чего стерилизовали поверхность плодов раствором гипохлорита кальция в 2–5%-ной концентрации с последующим промыванием стерильной дистиллированной водой. После этого плоды разрезали в условиях ламинар-бокса на несколько частей, из которых в дальнейшем извлекали ткани мезокарпия размером, в среднем, 5 мм. После этого экспланты помещали на подготовленные питательные среды в чашки Петри, которые располагали под лампами дневного света. Развитие каллуса наблюдалось через 1-2.5 недели после введения в культуру. Первичный каллус начинал формироваться с краёв эксплантов в средах с повышенным содержанием ИУК и без определённой локализации – в вариантах с высокой концентрацией 2,4-Д. Экспланты на всех типах питательных сред образовывали каллус серовато-белого цвета рыхлой консистенции.

Результаты

Таблица. Развитие каллуса у эксплантов Maclura pomifera в зависимости от концентрации фитогормонов в питательной среде

Концентрация фитогормонов	7 суток (мм)	13 суток (мм)	18 суток (мм)
ИУК (0.5 мг/л)	5.6	6.2	7.2
ИУК (1.0 мг/л)	5.5	6.7	7.8
2,4-Д (1.0 мг/л)	5.8	6.8	8.1
2,4-Д (5.0 мг/л)	6.1	7.2	10.3

Заключение

Можно предположить, что вариабельность эксплантов Maclura pomifera (Raf.) Schneid по способности к калусообразованию связана с изменениями направленности метаболических процессов в ходе каллусогенеза. Растения обладают метаболическими путями биосинтеза десятков тысяч вторичных продуктов. Набор вторичных метаболитов растений очень разнообразен. Если количество первичных метаболитов, синтезируемых в ключевых процессах первичного метаболизма (фотосинтез, дыхание, углеводородный, липидный и азотный обмен), достигает нескольких сотен, то, по приблизительным оценкам, количество метаболитов, образующихся в процессах вторичного метаболизма, достигает 200 000 (терпены, поликетиды, фенолы, алкалоиды, цианогенные гликозиды, небелковые аминокислоты) (Fett-Neto, 2010; Gupta, 2015). В отличие от первичных метаболитов, присутствующих во всех растительных клетках, вторичные метаболиты могут быть специфичны для одного или нескольких видов растений (Борисова, 2014). Кроме этого, вещества вторичного метаболизма не имеют собственных путей синтеза и для своего образования используют основные метаболические пути растений. Их биосинтез происходит на ответвлениях метаболических путей белков, углеводов, липидов, где функционирует широкий спектр ферментов, обусловливающих способность растений синтезировать разнообразные соединения (Борисова, 2014; Воинов, 2015). Одним из биотехнологических подходов к изменению метаболизма растений и, в конечном счёте, к увеличению выхода вторичных метаболитов, являющихся во многих случаях конечным целевым продуктом в цикле производства лекарственных препаратов, является контроль экспрессии генов, вовлечённых в данный процесс, на уровне основных регуляторных факторов транскрипции, которые являются привлекательными объектами для инжиниринга вторичных метаболических путей (Kayser, 2007; Воинов, 2015). Эти подходы, основанные на знаниях, накапливающихся в области метаболомики и транскриптомики, служат основой для разработки инструментов метаболической инженерии, дают возможность проектировать и создавать новые метаболические пути в растительных организмах, получать продукты лекарственного назначения с заданными свойствами, которые невозможно получить традиционными способами. Инжиниринг метаболических путей растений направлен на получение в трансгенной клетке новых биохимических реакций путем введения чужеродных генов или модификацией генов клетки-хозяина (Wu, 2008). Иногда такими продуцентами важных лекарственных соединений являются уникальные тропические и эндемические растения, недоступные для их агротехнического производства в умеренных климатических зонах большинства развитых стран мира. Выделение из таких растений генов, определяющих направленный синтез специфических органических соединений, и их перенос в подобранные соответствующим образом растения превращает их в новые продуценты важных биологически активных веществ.

Библиография

1. Arora R. Medicinal Plant Biotechnology. Wallingford: CAB International; 2010.

2. Fett-Neto AG (Ed.) Plant Secondary Metabolism Engineering: Methods and Applications. Methods in Molecular Biology 2010, 643.

3. Gupta VK, Tuohy MG, Lohani M, O'Donovan A (eds.). Biotechnology of Bioactive Compounds: Sources and applications. Chichester: John Wiley & Sons, Ltd; 2015.

4. Kayser O, Quax WJ (eds.). Medicinal Plant Biotechnology. From Basic Research to Industrial Applications. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA; 2007.

5. Murashige T, Tucker DPH. Growth factor requirements of Citrus tissue culture. Proc First Int Citrus Symp 1969, 3:1155-1161.

6. Wu S, Chappell J. Metabolic engineering of natural products in plants: tools of the trade and challenges for the future. Curr Opin Biotechnol 2008,19:145-152.

7. Борисова Г.Г., Ермошин А.А., Малева М.Г., Чукина Н.В. Основы биохимии вторичного обмена растений: учебно-методическое пособие. Екатеринбург: Изд-во Уральского университета, 2014. 128 с.

10. Булгаков В.П., Федореев С.А., Журавлев Ю.Н. Биотехнология – здоровью человека: научные достижения и первые шаги инноваций на Дальнем Востоке // Вестник ДВО РАН. – 2004. – №3. – С.93-99.

11. Дейнеко Е.В. Генетически модифицированные растения – продуценты рекомбинантных белков медицинского назначения // Вестник Томского государственного университета. Биология. – 2012. – №2(18). – С. 41-51.

Читайте также: