Питательные среды предназначенные для первичного посева и транспортировки исследуемого материала

Обновлено: 05.10.2024

Бактериологический (культуральный) метод исследования заключается в выявлении патогенных микроорганизмов и определении их чувствительности к антибиотикам. Процесс выявления микроорганизмов состоит из нескольких этапов:

1. Посев материала на питательные среды.
2. Получение чистых культур микроорганизмов.
3. Идентификация микроорганизмов.
4. Определение чувствительности к антибиотикам, антимикотиков.

Первый и второй этапы бактериологического исследования одинаковы и для классического, и для автоматического бактериологического методов.

Первый этап

Биологический материал высевают на питательные среды. Для каждого вида биологического материала используется определенный набор питательных сред. Это связано с тем, что в разных видах биологического материала находятся различные виды микроорганизмов и необходимо, чтобы выросли максимально все. Используются питательные среды общего назначения - на них растет подавляющее большинство микроорганизмов - кровяной агар, шоколадный агар; дифференциальные среды - позволяют отличать разные виды микроорганизмов - среда Эндо для энтеробактерий, селективные среды - растут только отдельные виды бактерий - энтерококагар для выявления энтерококков, маннитол-солевой агар для обнаружения стафилококков.

Посев делают таким образом, чтобы получить отдельные изолированные колонии.

Посевы помещают в термостат, как правило, на 24 ч при 37С. Некоторые посевы инкубируют при 28С, а некоторые в течение 48 часов. Посевы для выявления грибов рода Candida до 5 суток, мицелиальных грибов - до 30 суток.

Второй этап

Просматривают посевы на питательных средах. По внешнему виду колоний (размер, цвет, форма), определёнными быстрыми тестами и микроскопией определяют возможный вид микроорганизмов и их значение в конкретном случае. Избранные колонии отсеивают на универсальные питательные среды для накопления чистой культуры микроорганизмов. В случае роста колоний только одного вида можно проводить идентификацию и определение чувствительности без этапа накопления чистой культуры.

Третий этап

В зависимости от вида микроорганизма проводят его идентификацию (определение биохимических и антигенных свойств) с помощью фиксированного набора субстратов и сывороток. Субстратами являются углеводы, аминокислоты и другие сложные соединения. По результатам устанавливают род и вид микроорганизма.

Для установления вида некоторых микроорганизмов может потребоваться серологическая идентификация.

Все среды для идентификации и определения чувствительности к антибиотикам готовятся и стерилизуются отдельно. Такая процедура очень трудоемкая, то есть требует много ручного труда и времени, дополнительного оборудования. Таким образом у данного метода низкий уровень стандартизации.

Для идентификации некоторых требовательных клинически значимых видов микроорганизмов необходимы сложные и дорогие субстраты, которые в рутинной практике трудно готовить и использовать. Из-за этого спектр микроорганизмов, которые можно было бы идентифицировать, сужается по сравнению с возможностями автоматического анализатора.

Четвертый этап

Определение чувствительности к антибиотикам проводится с учетом результатов идентификации и вида биологического материала.

При использовании классического бактериологического метода, определение чувствительности к антибиотикам происходит диско-диффузным методом. Этот метод базируется на изучении зон задержки роста микроорганизма вокруг бумажного диска, который пропитан антибиотиком. В зависимости от зон задержки роста определяют устойчивые, умеренно-стойкие и чувствительные штаммы микроорганизмов к тому или иному антибиотику. Данный метод является наиболее распространенным для изучения чувствительности, а также дешевым и простым в исполнении. Однако он также плохо поддается стандартизации, поскольку требует много ручного труда.

Кроме того, согласно рекомендациям международных организаций, которые занимаются совершенствованием существующих методик и разработкой новых (EUCAST - Европейский комитет по определению чувствительности к антибиотикам, CLSI - Институт клинических лабораторных стандартов), чувствительность к некоторым антибиотикам НЕЛЬЗЯ определять диско-диффузным методом, поскольку не определены критерии оценки полученных результатов.

1. колистином - кишечная палочка, клебсиелла и другие энтробактерии, синегнойная палочка, ацинетобактер;
2. бета-лактамы (пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы), гликопептиды (ванкомицин, тейкопланин), даптомицином, фосфомицин – стафилококки;
3. даптомицином - стрептококки групп А, В, С и G;
4. меропенем - пневмококки при менингитах;
5. бета-лактамы (пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы) – пневмококки.

Кроме того существуют микроорганизмы, чувствительность которых к антибиотикам вообще нельзя определять диско-диффузным методом: Neisseria gonorrhoea, Neisseria meningitidis, все анаэробные микроорганизмы, Helicobacter pylori, Candida spp., Aspergilus spp. и другие мицелиальные грибы.

В настоящее время проведения микробиологических исследований является важной и актуальной деятельностью в биологии и медицине, так как они позволяют с высокой степенью точности и достоверности подтвердить или опровергнуть факт присутствия в организме человека возбудителей инфекционных заболеваний. Классический бактериологический метод исследования решает задачи выделения чистой культуры возбудителя с его последующей идентификацией. Благодаря микробиологическим методам исследования можно установить возбудителей тех или иных инфекционных заболеваний и подобрать рациональное лечение этого заболевания.

Преимущества автоматического метода

1. Скорость получения результата. Результат наших исследований является максимально быстрым. Уже на 3 сутки Вы получаете название микроорганизма, который был обнаружен в исследуемом образце, а также его чувствительность к антибиотикам. (!) Срок исследований в автоматическом методе продлен до 5 суток за счет длительного роста грибов рода Candida.

2. Точность. Автоматический анализатор дает возможность быстро и очень точно определить какой именно из 400 микроорганизмов есть в биоматериале.

3. Большой спектр антибиотиков к которым определяется чувствительность позволяет врачу назначить наиболее рациональную антибиотикотерапию с учетом характера заболевания и особенностей пациента. К тому же определение чувствительности таким методом является максимально быстрым и точным по сравнению с классическим.

Важно! В результате микробиологического исследования проведенного автоматическим методом антибиотикочувствительность издается с показателем МИК * (минимальная ингибирующая концентрация)

Наилучший источник углерода - углеводы. Моносахариды, особенно гексозы, широко используются микроорганизмами. Широко потребляемый микроорганизмами углевод - это глюкоза. Хороший источник углерода для грибков - это манитт.

Азот(синтез аминокислот). В качестве его источника используется грибы и некоторые бактерии используют нитраты (они сначала восстанавливаются микроорг., а после этого участвуют в процессах биосинтеза. Также источник азота - это соли аммония.

Фосфор(синтез ДНК, РНК, АТФ и др.) - его источник это фосфаты.

натуральные среды — готовят из продуктов животного и растительного происхождения (мясо, асцит, костная мука, кормовые дрожжи, сгустки крови и др.)

синтетические среды — готовят из определённых химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворённых в дважды дистиллированной воде.

По степени готовности:
готовые питательные среды (в чашках Петри, во флаконах)
сухие смеси

По консистенции (степени плотности):
жидкие (бульоны)
полужидкие
плотные
Плотные и полужидкие среды отличаются от жидких наличием желирующего агента (агар-агар, реже желатин). Кроме того, в качестве плотных сред применяют коагулировавшие яичные или сывороточные белки, картофель, среды с силикагелем. Некоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество — при их росте среда разжижается.

По составу:
простые: мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), питательный желатин,
сложные — многокомпонентные среды, которые могут содержать аминокислоты, витамины, микроэлементы и другие вещества.

Назначение: а) основные (общеупотребительные) среды служат для культивирования большинства патогенных микробов. Это вышеупомянутые МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода;

б) специальные среды служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых средах. Например, для культивирования стрептококка к средам прибавляют сахар, для пневмо- и менингококков - сыворотку крови, для возбудителя коклюша - кровь;

в) элективные (избирательные) среды служат для выделения определенного вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов. Так, соли желчных кислот, подавляя рост кишечной палочки, делают среду элективной для возбудителя брюшного тифа. Среды становятся элективными при добавлении к ним определенных антибиотиков, солей, изменении рН.

Жидкие элективные среды называют средами накопления. Примером такой среды служит пептонная вода с рН 8,0. При таком рН на ней активно размножается холерный вибрион, а другие микроорганизмы не растут;

г) дифференциально-диагностические среды позволяют отличить (дифференцировать) один вид микробов от другого по ферментативной активности, например среды Гисса с углеводами и индикатором. При росте микроорганизмов, расщепляющих углеводы, изменяется цвет среды;

Свидетельство и скидка на обучение каждому участнику

Питательные среды. Требования. Классификация, разлив, стерилизация.

1.Питательные среды.

2.Классификация.

3.Требования к питательным средам.

Для культивирования микроорганизмов (выращивание в искусственных условиях in vitro) необходимы особые субстраты - питательные среды. На средах микроорганизмы осуществляют все жизненные процессы (питаются, дышат, размножаются и т. д.), поэтому их еще называют средами для культивирования.

1.Питательные среды

Питательные среды являются основой микробиологической работы, и их качество нередко определяет результаты всего исследования. Среды должны создавать оптимальные (наилучшие) условия для жизнедеятельности микробов.

Питательная среда — вещество или смесь веществ, применяемая для культивирования макро- и микроорганизмов. Питательные среды служат основой бактериологических работ, нередко определяя своим качеством результаты исследования. Они необходимы для выделения из исследуемого материала чистых культур возбудителя и изучения их свойств ( культуральных, биохимических, подвижности и др.).

2.Классификация питательных сред

1.По консистенции ( степени плотности): o жидкие o полужидкие o плотные

Плотные и полужидкие среды готовят из жидких , к которым прибавляют уплотнители или клеевые вещества Чаще используют агар-агар или желатин. Агар-агар (по-малайски – желе) - полисахарид, продукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80 - 86°С, застудневает при 36 - 40°С.

Применение агаровых сред благодаря их способности сохранять плотность при температуре 37°С дало возможность выращивать патогенные микробы при оптимальной для большинства из них температуре на плотных средах. Желатин - вещество белковой природы животного происхождения. В теплой воде при температуре 32 - 34°С он набухает и растворяется, а при более низкой температуре превращается в студень. Однако при рН ниже 6,3 и выше 7,0 плотность желатина уменьшается, и он плохо застывает. Некоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество - при их росте среда разжижается. Кроме того, в качестве плотных сред применяют свёрнутую сыворотку крови, свёрнутые яйца, картофель, среды с селикагелем.

2.По назначению:

основные (общие) - служат для культивирования большинства патогенных микробов и являются основой для приготовления специальных сред. МПБ, МПА, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода. специальные - служат для выделения и выращивания того или иного вида микроорганизмов, не растущих на простых средах. Среди специальных выделяют: элективные (избирательные) - служат для выделения определённого вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов, это достигается путём добавления факторов элективности – различных веществ : определённых антибиотиков, солей, изменения pH.

Жидкие элективные среды называют средами накопления (обогащения) , используются для облегчения выделения чистой культуры возбудителя в том случае, когда возбудителя заведомо мало в материале.

элективно – диффреренциальные – содержат элективный фактор и компаненты, позволяющие определить какой-либо дифференциальный (отличительный) признак выделенной культуры. Например: ЖСА, где повышенная концентрация соли - это элективный фактов, а желток куриного яйца позволяет определить наличие фермента лецитиназы – дифференциальный признак патогенного стафилококка.  дифференциально-диагностические - позволяют отличить один вид микробов от другого по ферментативной активности.

По своему назначению дифференциально-диагностические питательные среды подразделяются следующим образом:

Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин, свернутую кровяную сыворотку и т. д. ·

Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами. ·

Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов. ·

Среды для определения редуцирующей способности микробов.

В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральный красный, метиленовый синий, лакмусовую настойку, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой краситель и розоловую кислоту. Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначенных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сывороточного белка.  консервирующие - предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала.

3.По происхождению.

Натуральные (естественные) среды - готовят из продуктов животного и растительного происхождения (мясо, костная и рыбная мука, кормовые дрожжи, сгустки крови и др.)  синтетические среды - готовят из определённых химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворённых в дважды дистиллированной воде.

Сухие питательные среды . Приготовление питательных сред — один из наиболее ответственных и трудных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим промышленность выпускает стандартные, консервированные, сухие питательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов.

Их преимущества: 1. стандартность.

2. простота приготовления – рецепт на упаковке и приготовление не занимает много времени, указан режим стерилизации.

Навеску, указанную на этикетке, всыпают в стеклянную колбу или бутыль с холодной дистиллированной водой. Смесь следует хорошо размешать до полного смачивания порошка водой. Затем в водяной бане или лучше в текучепаровом аппарате смесь нагревают до кипения, периодически помешивая. Кипятят до тех пор, пока порошок окончательно не растворится. Растворение на голом огне возможно, но требует большого внимания, чтобы не допустить пригорания среды. Перед разливкой следует среду хорошо перемешать. Сухие среды выпускаются основные, элективные и дифференциальные.

3. сбалансированность всех ингредиентов среды.

4. соблюдены рН и изотоничность.

5. экономичность – их делают из заменителей мяса – гидролизатов.

Сухие питательные среды следует хранить герметически закрытыми и по возможности не на свету, так как препараты гигроскопичны и светочувствительны. Увлажнение, комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о понижении качества препарата. Сухие препараты, не содержащие глюкозы, даже при комковании могут не терять своих качеств, однако их пригодность следует проверить. При наличии же в сухой среде глюкозы комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о порче.

3.Требования к питательным средам. 1. Содержать необходимые для питания микроорганизма вещества - быть питательными, т.е. содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. В состав сред, применяемых для выращивания бактерий должны входить:

А. необходимые для построения белков цитоплазмы элементы: азот, углерод, водород, кислород – органогены.

Б. минеральные соли - неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу натрий, магний, железо.

В. микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др.

1. факторы роста, которые по своей роли соответствуют витаминам для животных. Источником факторов роста являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др.

2. иметь оптимальную концентрацию водородных ионов - pH, т.к. только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества. Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (pH 7,2-7,4).

3. Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили pH, среды должны обладать буферностью, т.е. содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена.

4. быть изотоничными для микробной клетки, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальная среда, соответствующая физиологической концентрации NaCl.

5. плотные среды должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию, так как микробы питаются по законам диффузии и осмоса. Потребность в Н2 и О2 бактерии удовлетворяют за счет поступающей в клетку воды.

6. обладать определённым окислительно - восстановительным потенциалом, т.е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH2. Например, анаэробы размножаются при RH2 не выше 5, а аэробы - при RH2 не ниже 10.

7. быть по возможности унифицированными, т.е. содержать постоянное количество отдельных ингредиентов.

8. желательно, чтобы среды были прозрачными - удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами.

9. быть стерильными, т.к. посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды

Этапы приготовления питательных сред .

1. варка: среды варят используя сухие среды или продукты животного и растительного происхождения на газовой плите.

2. установление pH: ориентировочно производят с помощью индикаторной бумаги, для точного определения пользуются потенциометром или компаратором. При стерилизации pH снижается на 0,2, поэтому сначала готовят более щелочной раствор.

3. осветление производят, если при варке среды мутнеют или темнеют. Для этого используют белок куриного яйца или сыворотку крови.

4. фильтрация жидких и расплавленных желатиновых сред производят через влажный бумажный или матерчатый фильтры. Фильтрация агаровых сред затруднена - они быстро застывают. Обычно их фильтруют через ватно-марлевый фильтр, можно использовать воронку с подогревом.

5. разливают среды не более чем на ¾ емкости, т.к. при стерилизации могут намокнуть пробки и среды утратят стерильность.

6. стерилизация: режим стерилизации зависит от состава среды и указан в её рецепте.

для контроля стерильности среды ставят на 2 суток в термостат, после чего их просматривают, если не проросли, то их используют в работе.  химический контроль - окончательное устанавление pH, содержание общего и амминого азота, пептона, хлоридов.  для биологического контроля (определение ростковых свойств) несколько образцов среды засевают специально подобранными культурами, и по их росту судят о питательных свойствах среды.

Микробиологическое исследование — это выделение чистых культур микроорганизмов, культивирование и изучение их свойств. Чистыми называют культуры, состоящие из микроорганизмов одного вида. Они нужны при диагностике инфекционных болезней, для определения видовой и типовой принадлежности микробов, в исследовательской работе, для получения продуктов жизнедеятельности микробов (токсинов, антибиотиков, вакцин и т. п.).

Для культивирования микроорганизмов (выращивание в искусственных условиях in vitro) необходимы особые субстраты — питательные среды. На средах микроорганизмы осуществляют все жизненные процессы (питаются, дышат, размножаются и т. д.), поэтому их еще называют - средами для культивирования.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Требования, предъявляемые к средам

Среды должны соответствовать следующим требованиям:

1) быть питательными, т. е. содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. Ими являются источники органогенов и минеральных (неорганических) веществ, включая микроэлементы. Минеральные вещества не только входят в структуру клетки и активизируют ферменты, но и определяют физико-химические свойства сред (осмотическое давление, рН и др.). При культивировании ряда микроорганизмов в среды вносят факторы роста — витамины, некоторые аминокислоты, которые клетка не может синтезировать;

2) иметь оптимальную концентрацию водородных ионов — рН, так как только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества.

Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (рН 7,2—7,4). Исключение составляют холерный вибрион — его оптимум находится в щелочной зоне (рН 8,5—9,0) и возбудитель туберкулеза, нуждающийся в слабокислой реакции (рН 6,2—6,8).

Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили рН, среды должны обладать буферностью, т.е. содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена;

3) быть изотоничными для микробной клетки; т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов
оптимальна среда, соответствующая 0,5% раствору натрия, хлорида;

4) быть стерильными, так как посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды (состав, рН и др.);

5) плотные среды должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию;

6) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, т. е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH2. Этот потенциал показывает насыщение среды кислородом. Для одних микроорганизмов нужен высокий потенциал, для других — низкий. Например, анаэробы размножаются при RH₂ не выше 5, а аэробы — при RH₂ не ниже 10. Окислительно-восстановительный потенциал большинства сред удовлетворяет требованиям к нему аэробов и факультативных анаэробов;

7) быть по возможности унифицированным, т. е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов. Так, среды для культивирования большинства патогенных бактерий должны содержать 0,8—1,2 г/л аминного азота NH₂, т. е. суммарного азота аминогрупп аминокислот и низших полипептидов; 2,5_:—3,0 г/л общего азота N; 0,5% хлоридов в пересчете на натрия хлорид; 1% пептона.

Желательно, чтобы среды были прозрачными — удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами.

Классификация сред

Потребность в питательных веществах и свойствах среды у разных видов микроорганизмов неодинакова. Это исключает возможность создания универсальной среды. Кроме того, на выбор той или иной среды влияют цели исследования.

В настоящее время предложено огромное количество сред, в основу классификации которых положены следующие признаки.

1. Исходные компоненты. По исходным компонентам различают натуральные и синтетические среды. Натуральные среды готовят из продуктов животного и растительного происхождения. В настоящее время разработаны среды, в которых ценные пищевые продукты (мясо и др.) заменены непищевыми: костной и рыбной мукой, кормовыми дрожжами, сгустками крови и др. Несмотря на то что состав питательных сред из натуральных продуктов очень сложен и меняется в зависимости от исходного сырья, эти среды нашли широкое применение. Синтетические среды готовят из определенных химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворенных в дважды дистиллированной воде. Важное преимущество этих сред в том, что состав их постоянен (известно, сколько и какие вещества в них входят), поэтому эти среды легко воспроизводимы.

2. Консистенция (степень плотности). Среды бывают жидкие, плотные и полужидкие. Плотные и полу жидкие среды готовят из жидких, к которым для получения среды нужной консистенции прибавляют обычно агар-агар или желатин.

Рис.38

Колонии бактерий на плотной питательной среде .

Рис.39

Жидкие питательные среды Полужидкие питательные среды.

Агар-агар — полисахарид, получаемый из определенных сортов морских водорослей. Он не является для микроорганизмов питательным веществом и служит только для уплотнения среды. В воде агар плавится при 80—100°С, застывает при 40—45 °С.

Желатин — белок животного происхождения. При 25— 30 °С желатиновые среды плавятся, поэтому культуры на них обычно выращивают при комнатной температуре. Плотность этих сред при рН ниже 6,0 и выше 7,0 уменьшается, и они плохо застывают. Некоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество— при их росте среда разжижается.

Кроме того, в качестве плотных сред применяют свернутую сыворотку крови, свернутые яйца, картофель, среды с селикагелем.

3. Состав. Среды делят на простые и сложные. К первым относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), бульон и агар Хоттингера, питательный желатин и пептонную воду. Сложные среды готовят, прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества, необходимые для размножения того или иного микроорганизма.

а) основные (общеупотребительные) среды служат для культивирования большинства патогенных: микробов. Это вышеупомянутые МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода;

б) специальные среды служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых, средах. Например, для культивирования стрептококка к средам прибавляют сахар, для пневмо- и менингококков — сыворотку крови, для возбудителя коклюша—кровь;

д) консервирующие среды предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала; в них предотвращается отмирание патогенных микроорганизмов и подавляется развитие сапрофитов. Пример такой среды — глицериновая смесь, используемая для сбора испражнений при исследованиях, проводимых с целью обнаружения ряда кишечных бактерий.

Рецепты приготовления некоторых сред приведены в конце следующего раздела и во второй части учебника;

Приготовление сред

Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла, или окислов железа, которые могут попасть в среду при варке ее в ржавых кастрюлях. Лучше всего пользоваться стеклянной, эмалированной или алюминиевой посудой. Большие количества среды (десятки и сотни литров) готовят в специальных варочных котлах или реактора. Перед употреблением посуду необходимо тщательно вымыть, прополоскать и высушить.

Этапы приготовления сред:

2) установление оптимальной величины рН;

Установление рН сред ориентировочно производят с помощью индикаторных бумажек. Для точного определения рН пользуются потенциометром, применяя стеклянные электроды в соответствии с инструкцией или компаратором (аппарат Михаэлиса), состоящим из штатива с гнездами для пробирок и набора.

При стерилизации рН сред снижается на 0,2, поэтому для получения среды с рН 7,2—7,4 ее сначала готовят с рН 7,4 — 7,6.

Осветление сред производят, если при варке они мутнеют или темнеют. Для осветления в среду, подогретую до 50 °С, вливают белок куриного яйца, взбитый с двойным количеством воды, перемешивают и кипятят. Свертываясь, белок увлекает в осадок взвешенные в среде частицы. Таким же способом можно вместо яичного белка использовать сыворотку крови (20—30 мл на 1 л среды).

Фильтрацию жидких и расплавленных желатиновых сред производят через влажный бумажный или через матерчатые фильтры. Фильтрация агаровых сред затруднена—они быстро застывают. Обычно их фильтруют через ватно-марлевый фильтр (в воронку помещают марлевую салфетку и на нее пышный комок ваты). Можно пользоваться бумажными или матерчатыми фильтрами, если проводить фильтрацию в горячем автоклаве или в воронках с подогревом.

Фильтрацию агаровых сред можно заменить отстаиванием. Среду наливают в высокий цилиндрический сосуд и расплавляют в автоклаве. При медленном остывании среды в выключенном приборе взвешенные в ней частицы оседают на дно.

Посуду со средой обычно закрывают ватно-марлевыми пробками, поверх которых надевают бумажные колпачки. Важно, чтобы при разливе среда не смачивала края посуды, иначе к ним могут прилипнуть пробки. К каждому сосуду обязательно прикрепляют этикетку с названием среды и датой ее приготовления.

Стерилизация. Режим стерилизации зависит от состава среды и указан в ее рецепте. Примерная схема режима стерилизации сред приведена в таблице

Режим стерилизации сред

Таблица №7

Среды	Режим стерилизации
аппарат	температура, давление	.время
Простые	Автоклав	120 °С (1 атм.)	20 мин
Сложные: 1) с углеводами,молоком, желатином	Автоклав с незакрытой крышкой или аппарат Коха	100 °С (текучий пар)	30—60 мин 3 дня подряд (дробная стерилизация)
2) белковые (сывороточные или яичные) с уплотнением	Свертыватель Коха (возможны два режима)	80—85 °С	1 ч 3 дня подряд
95 °С	1 ч однократно
3) белковые жидкие	Водяная баня или инактиватор	58 °С	1 ч 3—Ч дня подряд

Жидкие среды с углеводами, белками или витаминами лучше стерилизовать с помощью бактериальных фильтров.

Контроль готовых сред:

а) для контроля стерильности среды ставят в термостат на 2 сут. после чего просматривают. Если на средах не появятся признаки роста, их считают стерильными и передают для химического контроля по нескольку образцов каждой серии;

б) химический контроль: окончательно устанавливают рН, содержание общего и аминного азота, пептона, хлоридов (их количество должно соответствовать указанному в рецепте). Химический контроль сред производят в химической лаборатории в) для биологического контроля несколько образцов среды засевают специально подобранными культурами микроорганизмов, и по их росту судят о питательных (ростовых) свойствах среды. К готовой среде прилагают этикетку и паспорт, в котором указывают название и состав среды, результаты контроля и др.

Хранят среды при комнатной температуре в шкафах, желательно специально для них предназначенных. Некоторые среды, например, среды с кровью и витаминами, хранят в холодильнике.

Читайте также: