Плазмокоагулазную активность стафилококков определяют путем посева

Обновлено: 19.09.2024

Микроскопия золотистого стафилококка. Выявление скоплений грамположительных кокков и полиморфно-нуклеар-ных лейкоцитов при исследовании окрашенных мазков клинического материала может служить основанием для предварительного диагноза. Следует помнить, что результаты микроскопии нельзя считать достаточными для выдачи окончательного заключения.

Выделение золотистого стафилококка

Посев золотистого стафилококка проводят на простые питательные среды, обычно на тио-гликолевую среду и КА. Если существует риск контаминации образца, применяют дифференциально-диагностические среды. Наиболее часто используют молочно-солевой (или молочно-жел-точно-солевой) агар и солевой агар с маннитом, на них рост контаминирующей микрофлоры угнетает высокая концентрация NaCl. Кроме того, на молочно-солевом агаре (МСА) хорошо проявляется способность к пигментообразованию и разложению лецитина (лецитовителазная активность). В последнее время широкое распространение в качестве дифференциально-диагностической среды нашёл агар с колистином и налидиксовой кислотой.

Стафилококки хорошо растут на бульоне, сначала вызывая его равномерное помутнение, а затем образуя рыхлый хлопьевидный осадок. Они дают весьма характерный рост в желатине; через 24-28 ч (наряду с обильным ростом по ходу укола микробиологической иглы) наблюдают начальное разжижение среды, а на 4-5-е сутки образуется открытая вниз воронка, заполненная разжиженной средой.

Для внутривидовой дифференцировки золотистого стафилококка ( S. aureus ) применяют коагулазный тест (на наличие свёртывающего фактора), положительный у 95% изолятов (рис. 12-3). Существует ещё несколько дифференцирующих признаков.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической лабораторной диагностике инфекционных заболеваний. Способ предусматривает внесение 12-часовой культуры стафилококка в плазму, разведенную изотоническим раствором хлорида натрия. Полученную микробную взвесь инкубируют при температуре 37°С в течение 5 часов. Регистрируют электрическое сопротивление микробной взвеси с 3-го до 5-го часа инкубирования. Причем при показателях сопротивления раствора 64-84 кОм делают заключение о патогенности стафилококка по наличию плазмокоагулирующей активности. Изобретение позволяет сократить сроки проведения исследований и повысить точность анализа.

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологической лабораторной диагностике инфекционных заболеваний.

Плазмокоагулирующая активность является одним из основных признаков патогенности стафилококков (Staphylococcus aureus). До настоящего времени в периодической и патентной литературе не описано объективных методов регистрации плазмокоагулирующей активности бактерий, позволяющих с помощью приборов зарегистрировать коагуляцию плазмы микроорганизмами.

Одним из существенных недостатков прототипа является субъективное определение изменения вязкости раствора в опытной пробирке по сравнению с контрольными. Окончательный учет наличия плазмокоагулирующей активности бактерий проводят через 18 часов, и в течение этого времени сотрудник лаборатории периодически (через каждые 10-20 мин) просматривает пробирки с посевами исследуемых культур для выявления плазмокоагулирующей активности бактерий. Если сотрудник лаборатории вовремя не просмотрел пробирки (в момент коагуляции плазмы), то процесс идет в обратном направлении, то есть из желеобразного состояния раствор приобретает жидкую консистенцию. В данном случае лаборатория может дать ложноотрицательный результат лабораторного исследования на наличие фермента плазмокоагулазы.

Задачей настоящего изобретения является разработка нового, объективного, экономичного экспресс-способа определения плазмокоагулирующей активности стафилококков.

Технический результат - простой, не требующий больших материальных затрат определения патогенных стафилококков по плазмокоагулирующей активности, позволяющий сократить сроки проведения исследований, повысить точность проведения лабораторного анализа и создающий возможность автоматизации в процессе регистрации плазмокоагулирующей активности стафилококка, основанный на определении показателей электрического сопротивления микробной взвеси в растворе плазмы. Использован известный способ определения электрического сопротивления растворов по новому назначению, а именно для выявления патогенных стафилококков по плазмокоагулирующей активности.

Технический результат достигается тем, что способ определения патогенных стафилококков по плазмокоагулирующей активности предусматривает внесение 12-часовой культуры стафилококка в плазму, разведенную изотоническим раствором хлорида натрия, инкубирование микробной взвеси при температуре 37°С в течение 5 часов, регистрацию электрического сопротивления микробной взвеси с 3-го до 5-го часа инкубирования, причем при показателях сопротивления раствора 64-84 кОм делают заключение о патогенности стафилококка по наличию плазмокоагулирующей активности.

Сущность изобретения достигается тем, что использован объективный способ регистрации плазмокоагулирующей активности бактерий по показателям электрического сопротивления раствора, позволяющий автоматизировать процесс выявления патогенных штаммов стафилококков (S.aureus) по плазмокоагулирующей активности, в результате этого освобождается от работы сотрудник лаборатории, регистрирующий плазмокоагулирующую активность бактерий, экономится расход питательных сред и создается возможность объективно с высокой точностью за 5 часов проводить значительно большее количество лабораторных анализов по определению плазмокоагулирующей активности микробных взвесей.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Используют 12-ти часовую культуру стафилококка. Микробную взвесь в количестве 0,1 мл, содержащую 10 7 КОЕ/мл, вносят в пробирку с 0,3 мл плазмы, разбавленной 1:5 изотоническим раствором хлорида натрия. В пробирки с микробной взвесью вводят стальные электроды, соединенные с пишущим устройством, регистрирующим электрическое сопротивление раствора в пределе 2000 кОм. Микробную взвесь инкубируют при 37°С в течение 5 часов. При показаниях электрического сопротивления раствора от 64 до 84 кОм за период с 3-го до 5-го часа инкубирования микробной взвеси делают заключение о патогенности стафилококка по наличию плазмокоагулирующей активности.

Предложенный способ определения патогенных стафилококков (S. aureus) по плазмокоагулирующей активности (по сравнению с прототипом) позволяет экономить расход питательных сред, сокращает время проведения лабораторных исследований, дает объективные результаты исследований и создает возможность автоматизировать процесс определения плазмокоагулирующей активности микробной взвеси.

Примеры конкретного выполнения предлагаемого способа

Предложенный способ определения патогенных стафилококков по плазмокоагулирующей активности не требует больших материальных затрат, легко воспроизводим, сокращает сроки проведения исследований, создает возможность автоматизировать процесс выявления патогенных стафилококков по плазмокоагулирующей активности и дает объективные данные лабораторных исследований, позволяющих выявлять патогенные штаммы стафилококков по плазмокоагулирующую активности с точностью 100%.

Способ определения патогенных стафилококков по плазмокоагулирующей активности, предусматривающий внесение 12-часовой культуры стафилококка в плазму, разведенную изотоническим раствором хлорида натрия, инкубирование микробной взвеси при температуре 37°С в течение 5 ч, регистрацию электрического сопротивления микробной взвеси с 3-го до 5-го часа инкубирования, причем при показателях сопротивления раствора 64-84 кОм делают заключение о патогенности стафилококка по наличию плазмокоагулирующей активности.

Их определение имеет особое диагностическое значение. Для правильного представления об этиологической роли стафилококков требуется выделить его из исследуемого материала и детально изучить несколько (иногда до 50) колоний, так как многие патогенные штаммы не образуют золотистый пигмент и не вызывают гемолиз на кровяном агаре при обычных условиях. С этой целью чистые культуры стафилококков проверяют по их способности ферментировать манит, коагулировать цитрированную плазму, выделять фибринолизин и лецитиназу, ДНК-азу, обладать скрытой (потенциальной) гемолитической способностью. Для более полной характеристики патогенных штаммов определяют у них способность выделять дермонекротоксин, токсин общего действия и энтеротоксин. Отдельные биохимические свойства, соответственно, учитывают как факторы патогенности.

Чистую культуру засевают в молоко, среды с углеводами, МПЖ. Стафилококки обладают протеолитическими свойствами:в столбике желатина после засева уколом через 36-48 ч наряду с обильным ростом по линии укола наблюдается начальное разжижение среды, которое затем увеличивается, и к 4-5 суткам образуется воронка, наполненная жидкостью. Также медленно разжижается свернутая кровяная сыворотка; молоко свертывается, затем образовавшийся сгусток казеина пептонизируется.

Из углеводов ферментируют лактозу, глюкозу, глицерин, сахарозу, мальтозу, маннит. К другим биохимическим свойствам стафилококков следует отнести продуцирование H₂S, аммиака, фермента коагулазы - бактериальная протеиназа, свертывающая плазму крови животных. Её наличие служит одним из наиболее важных и постоянных критериев патогенности стафилококков. Индол не образуют.

Ферментация маннита

Рассматривается как свойство патогенных видов стафилококков. Её определяют путем посева на МПБ, содержащий 0,5% маннита, индикатор Андрэдэ и газовые поплавки. После 1-2 суточной инкубации при 37°С среда с патогенным штаммом микроба краснеет; в газовых поплавках иногда скапливаются пузырьки газа. Это свойство хорошо выявляется на полужидкой среде с теми же компонентами.

Плазмокоагулазную активность

Определяют в специальной реакции – плазмокоагуляции (РПК). Для постановки её необходимы молодые культуры стафилококков; для контроля – заведомо коагулирующий и некоагулирующий штаммы микробов, нативная или сухая цитратная плазма кролика.

Кровь берут из сердца кролика массой 1,5-2 кг, зафиксированного в спинном положении, в объеме 8 мл иглой, надетой на шприц, промытый 5%-м раствором цитрата натрия. Её осторожно сливают в пробирку с 2 мл 5% -го раствора цитрата натрия и осторожно перемешивают. Кролику же вводят подкожно 8 мл стерильного физиологического раствора. Пробирку с кровью выдерживают при 4°С до осаждения эритроцитов. Для ускорения процесса цитратную кровь можно центрифугировать при оборотах 1500-2000 мин -1 . Надосадочная жидкость – это и есть плазма. Срок её годности при хранении в холодильнике составляет 4-5 суток.

Перед постановкой РПК отсасывают необходимое количество плазмы, разводят её физиологическим раствором 1:5, разливают в пробирки по 0,5 мл и вносят в них по 0,5 мл бульонной культуры. При исследовании культур, выращенных на плотной среде, плазму разводят 1:20, разливают в пробирки по 1 мл и диспергируют в ней 1 петлю агаровой культуры стафилококка. В обоих случаях пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С. Учитывают результат через 1,2,3 и 24 часа. Наличие плотного или желеобразного сгустка указывает на положительный результат реакции. Для признания штамма патогенным срок наступления реакции не имеет значения.

Обычно культуры, активно продуцирующие коагулазу, дают положительную реакцию уже через 2—3 ч, а если они обладают и выраженной фибринолитической активностью, то первоначально образовавшиеся сгустки могут подвергнуться расплавлению к концу суток. Слабокоагулирующие штаммы могут давать положительную реакцию в поздние сроки — к концу суток. Опыты, давшие сомнительный результат, необходимо повторить.

Некоторые исследователи, получив отрицательный или сомнительный результат, оставляют пробирки на столе. Этого делать нельзя, так как свертывание плазмы в более поздние сроки может носить не специфический характер и его не следует принимать во внимание.

Стафилококки, дающие положительную коагулазную пробу, должны рассматриваться как потенциально патогенные, независимо от наличия или отсутствия у них гемолитических свойств и характера пигмента, их относят к виду St. aureusи в дальнейшем подвергают фаготипизации и проверке на чувствительность к антибиотикам.

Сегодня мы поговорим не столько о коагулазонегативных стафилококках, сколько о катетер-ассоциированных инфекциях кровотока (КАИК), используя упомянутых стафилококков как повод к разговору.

Автор: Трубачева Е.С., врач – клинический фармаколог

Но сначала обсудим микробиологическую составляющую вопроса.

Почему коагулазонегативные? Одним из ключевых признаков патогенности всех стафилококков является способность или наоборот неспособность коагулировать плазму крови. В зависимости от этой способности они относятся к коагулазоположительным:

и коагулазоотрицательным (коагулазонегативным или КНС):

Среди коагулазонегативных клиническое значение имеют S. saprophyticus, который может быть причиной циститов у женщин и негонококковых уретритов у мужчин) и S. epidermidis, который станет предметом более подробного рассмотрения.

S. epidermidis

Как видно из названия, этот микроорганизм является нормальным жителем кожных покровов здорового человека и в обычных ситуациях никаких проблем не доставляет. Более того, он может не менее спокойно обитать на поверхности ран и также не доставлять никаких хлопот. Но существует одно состояние, при котором этот, практически безопасный, зверек создает намного более серьезные проблемы, чем его опасный собрат S. aureus, и все это благодаря своим уникальным свойствам. У эпидермального стафилококка есть всего один, но какой, способ навредить пациенту – он имеет в своем арсенале специальные адгезины, в том числе капсульные, которые помогают ему прикрепляться к пластиковым поверхностям, а так же к фибрину и фибронектину, которые выпадают на все, что мы ставим в пациента, – шунты, катетеры, водители ритма и т. д. и т. п., на что сверху прикрепляется эпидермальный стафилококк и начинает создавать биопленку, в составе которой он фактически полностью защищен от действий всех возможных бактерицидных факторов.

Что такое биопленка? В одной из статей цикла мы уже упоминали о том, что это высокоорганизованное сообщество бактерий, в котором они ведут достаточно бурную в т. ч. социальную жизнь, а не просто тихо сидят, укрывшись экзополимер-полисахаридным матриксом. В процессе формирования биопленки выделяют следующие этапы:

Стадия адгезии.
Стадия необратимого связывания с поверхностью.
Стадия созревания.
Стадия распространения.

Эта стадийность характерна для всех пленкообразующих микроорганизмов, а не только для S. epidermidis. Матрикс, скрепляющий пленку, чаще всего занимает до 85% ее объема и состоит из белков, полисахаридов, липидов и нуклеиновых кислот. Благодаря объему и свойствам матрикса, микробные клетки почти на 100% защищены от любого внешнего воздействия, до тех пор, пока находятся внутри пленки. Доступными они становятся лишь в стадии распространения, когда отшнуровываются и попадают, например, в системный кровоток. Классическим примером такой отшнуровки служит отрыв вегетации (которая и является по сути биопленкой) от сердечного клапана.

Наглядно процесс пленкообразования можно посмотреть на этом видео.

Таким образом, благодаря всему вышеперечисленному, S. epidermidis в частности и почти все коагулазонегативные стафилококки в общем, оказываются основными возбудителями катетер-ассоциированных инфекций кровотока (КАИК) и инфекций имплантов.

Итак, мы подобрались к основной заявленной теме нашей сегодняшней беседы – катетер-ассоциированным инфекциям, которыми считаются инфекции кровотока, развившиеся не ранее, чем через 48 часов после установки центрального катетера, при отсутствии других очевидных источников инфекции.

Как развивается КАИК?

Вариант первый – бактерии колонизируют наружную часть катетера, а затем мигрируют по ней к внутрисосудистому концу катетера
Вариант второй – бактерии колонизируют коннектор с последующей миграцией по внутренней поверхности катетера

Кто, помимо КНС может вызывать КАИК?

S.aureus
Грам-отрицательные бактерии, например, E.coli
Стрептококки и энтерококки
Анаэробы, чаще всего при постановке имплантов аорты

Клинические аспекты проявления КАИК

Диагностические аспекты или что необходимо делать, чтобы не просмотреть КАИК:

Ежедневный осмотр места установки катетеров на предмет локальной воспалительной реакции
Мониторинг общего состояния пациента
При наличии подозрения на развитие КАИК – забор крови (не через подозрительный катетер!) на микробиологический анализ, а также удаление и посев самого подозрительного катетера. Но необходимо помнить, что рутинно выполнять эти действия нецелесообразно и откровенно дорого
Для микробиологической диагностики должны использоваться только стандартные методики

Терапевтические аспекты

Самым основным в лечении КАИК является недопущение развития этого состояния, а потому сразу же сошлемся на несколько нормативных документов, два из которых обязательны к исполнению на территории Российской Федерации:

Профилактика катетер-ассоциированных инфекций кровотока и уход за центральным венозным катетером (ЦВК)

Венозный доступ

ESCMID guideline for the diagnosis and treatment of biofilm infections

Мы же кратко пробежимся по основным пунктам профилактики развития КАИК:

Необходимо правильно выбирать тип катетера для длительной катетеризации:

длительность менее 5 дней – периферический катетер
от 5 до 10 дней – ЦВК в яремную вену
от 5 до 28 дней – ЦВК в подключичную вену
более 28 дней – туннелированный катетер

Строжайшее выполнение правил асептики и антисептике при мытье рук перед манипуляцией, согласно Федеральным клиническим рекомендациям – Гигиена рук медицинского персонала.

Гигиена рук медицинского персонала. Общие положения (по утвержденным клиническим рекомендациям).

Гигиена рук медицинского персонала. Показания и способы гигиены рук (по утвержденным клиническим рекомендациям).

Гигиена рук медицинского персонала. Техника гигиены рук (по утвержденным клиническим рекомендациям).

Гигиена рук медицинского персонала. Использование перчаток (по утвержденным клиническим рекомендациям).

При установке катетеров использовать только стерильные перчатки, а в качестве антисептиков для обработки места установки катетера – спиртосодержащие растворы.
Замену катетеров, установленных в экстренных ситуациях, а значит, с нарушениями правил асептики и антисептики, не позднее, чем через 48 часов от их установки.
Марлевые повязки менять каждые 2 дня, прозрачные – каждые 7 дней.
Свести количество манипуляций с самим катетером к минимуму, ибо каждый контакт повышает риск развития КАИК.
Максимально быстро удалять все неиспользуемые катетеры.

Что делать, если несмотря на все усилия произошел эпизод КАИК?

Читайте также: