Подготовка посевного материала в производстве антибиотиков

Обновлено: 07.07.2024

ГЛАВА 9. ПРОИЗВОДСТВО ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

9.1 Общие представления о промышленном производстве лекарственных препаратов

Промышленное производство лекарственных препаратов включает широкое использование машин, аппаратов, поточных механизированных и автоматизированных линий. Оно предусматривает массовый, серийный выпуск препаратов по стандартным прописям, рассчитанным на среднего потребителя.

Укрупненное фармацевтическое производство состоит из комплекса специализированных цехов. Цех — основное производственное подразделение, специализированное для выполнения однородных процессов (дробильный, экстракционный, фасовочный и т. д.) или для выпуска однотипной продукции (таблеточный, ампульный, аэрозольный и др.). Каждый цех имеет несколько участков, где осуществляются однотипные

операции, составляющие технологический процесс. Например, таблеточный цех имеет участки смешивания ингредиентов, гранулирования, сушки гранулята, прессования и др.

Работа промышленных предприятий характеризуется строгой регламентацией и планированием производства. Производственный процесс проводится в определенных стандартных условиях, предусмотренных точными инструкциями, объединенными в одни сводный документ — регламент. Регламент представляет собой совокупность правил, определяющих порядок деятельности фармацевтического предприятия по выпуску готовой продукции. В нем дается характеристика исходных продуктов, полуфабрикатов и готового продукта, указаны последовательность стадий технологического процесса, режим обработки материалов по стадиям, аппаратурная схема, методы анализа, правила по технике безопасности, производственной гигиене и другие условия производства. Регламент является законом производства, отступление от него недопустимо. За соблюдением регламента следит отдел технического контроля.

В фармацевтическом производстве технологические процессы подразделяются на химические, связанные с химическим синтезом лекарственных веществ и физические. К последним относятся механические, связанные с обработкой твердых материалов (измельчение, просеивание, смешивание, дозирование, прессование), гидромеханические (перемешивание жидкостей, эмульгирование, фильтрование), тепловые (испарение, конденсация, плавление), массообменные (растворение, кристаллизация, сушка, экстракция, ректификация). Все эти процессы требуют соответствующего аппаратурного оформления, т. е. выполняются с использованием специальных машин и аппаратов.

Основным исходным материалом для изготовления лекарственных препаратов являются активные фармацевтические субстанции, которые могут быть получены путем химического или биологического синтеза, а также путем переработки лекарственного растительного сырья или тканей и органов животных.

Лекарственные препараты имеют определенную лекарственную форму, т. е. удобное для применения состояние. Существуют твердые (порошки, таблетки, гранулы), жидкие (растворы, суспензии, эмульсии) и мягкие (мази, суппозитории) лекарственные формы. Этапы химического синтеза определенного лекарственного вещества могут включать процессы смешивания ингредиентов реакции, их термической обработки, экстракционного или хроматографического разделения продуктов реакции, упаривания, кристаллизации, сушки и т. п.

Основные этапы микробиологического синтеза антибиотиков, ферментов, органических кислот и т. п. показаны на схеме (рис. 59).

Рис. 59. Этапы получения продуктов микробиологического синтеза.

Из лекарственного растительного сырья готовят сборы, порошки, настойки, экстракты, а также получают максимально очищенные экстракционные препараты или препараты индивидуальных веществ.

Из животного сырья получают гормоны, ферменты и препараты неспецифического действия. Они могут представлять собой высушенные, обезжиренные и измельченные ткани или экстракты (максимально очищенные или препараты индивидуальных веществ).

В основу гомеопатической фармации положен принцип потенцирования (динамизации) — особая технология приготовления гомеопатических лекарств. Сущность этого принципа состоит в том, что процесс включает в себя поэтапное снижение концентрации исходного гомеопатического вещества в носителе (растворе или порошке) в 10 или 100 раз на каждом этапе путем интенсивного встряхивания, растирания и перемешивания. В результате получают препараты, в которых содержание исходной субстанции снижено до ничтожных значений.

Для современной фармацевтической промышленности характерно непрерывное совершенствование и комплексное применение новых технологических подходов, основанных на понимании механизма действия и фармакологического эффекта лекарственного вещества и направленных к общей цели — созданию более эффективных и безопасных медицинских препаратов.

Современное фармацевтическое производство требует от персонала понимания смысла и значения каждой ступени технологического процесса и строгого контроля выполнения требований регламента. В связи с этим центральное место в общем направлении развития фармацевтической технологии наряду с химией и биотехнологией принадлежит микробиологии, научный поиск и развитие этих направлений определяют успех развития всей отрасли.

Существенная часть требований к качеству фармацевтической продукции и к условиям производства контролируется микробиологом: стерильность, микробная контаминация сырья и нестерильных лекарственных средств, соблюдение правил производственной гигиены, предусмотренных GМР. Эти требования должны быть хорошо известны всем участникам производственного процесса и неукоснительно соблюдаться с сознанием важности тщательного выполнения каждого из них.

С появлением фармацевтических препаратов, получаемых с использованием методов генетической инженерии, более 80% стерильных лекарственных форм готовят асептично, поскольку эти вещества лабильны и не могут быть простерилизованы в готовом виде. Лекарственные препараты, приготовленные с использованием асептичной технологии, превосходят по своему качеству препараты, производимые ранее.

Техникой работы в асептичных условиях должны владеть не только микробиологи, но и химики, а также весь персонал, от которого зависит выпуск микробиологически безопасной продукции.

9.2 Производство антибиотиков

Получение препаратов антибиотиков - сложный и многоступенчатый процесс. Он слагается из комплекса последовательных исследований, которые можно свести в основном к следующим этапам:

1) изыскание микроорганизмов-антагонистов в природе и выделение их в чистую культуру;

2) изучение спектра действия и определение антибиотической активности выделенных культур антагонистов;

3) подбор условий культивирования продуцентов антибиотиков;

4) первичная идентификация антибиотика на ранних этапах изучения;

5) выделение и химическая очистка активно действующего начала из культуральной жидкости и клеток, а также сравнение полученного антибиотика по биологическим и химическим показателям с уже известными препаратами для выявления новых свойств полученных веществ;

6) изучение механизма действия и испытание токсических и лечебных качеств антибиотиков на животных;

7) разработка технологии получения антибиотика в лаборатории и внедрение ее в промышленное производство;

8) получение из исходных штаммов новых генотипов микроорганизмов, обладающих повышенной активностью, путем мутаций и рекомбинаций методами генетической и клеточной инженерии (рис. 60).

Для получения новых антибиотиков помимо изыскания новых или генетически измененных продуцентов используют следующие методические подходы:

1) получение из исходного антибиотика препарата с новыми свойствами путем химической или биохимической модификации его молекулы;

2) направленный биосинтез путем биохимической модификации структуры, полученной химическим методом;

3) химический синтез с использованием природных структур в качестве шаблонов;

4) мутасинтез. Этот метод включает следующие этапы:

а) получение мутантов — идиотрофов, требующих для образования антибиотика определенный фрагмент его молекулы (предшественник);

б) получение химическими методами аналога этого предшественника (мутасинтона);

в) культивирование идиотрофа на среде, содержащей мутасинтон. При этом идиотроф включает мутасинтон в молекулу продуцируемого им антибиотика. В результате получаются новые (мутасинтетические) структуры.

5) Получение гибридных антибиотиков, т. е. веществ, продуцируемых генетическими гибридами; гибридный антибиотик может содержать структуры двух различных метаболитов. От антибиотиков, получаемых перечисленными выше методами, они отличаются тем, что представляют собой продукт комбинации генов.

Основные этапы получения гибридных антибиотиков:

а) выбор продуцента, образующего известный антибиотик;

б) изыскание нового микроорганизма для гибридизации;

в) исследование биохимических путей синтеза антибиотика, интермедиатов и ферментов;

г) определение генов, контролирующих образование ферментов биосинтеза и его регуляторов;

д) получение рекомбинантной ДНК, содержащей комбинацию генов, благоприятную для процесса биосинтеза;

е) клонирование новой генетической структуры в культуре реципиента;

ж) химическое, микробиологическое и фармакологическое исследование нового антибиотика.

Природные антибиотики получают путем культивирования микроорганизма — продуцента с использованием методов биотехнологии. По объему выпускаемых антибиотиков антибиотическая промышленность является самым крупным биотехнологическим производством.

Цель любой биотехнологии — на базе понимания физиологических и генетических свойств продуцента

получить максимальный выход конечного продукта. Необходимые для этого биотехнологические манипуляции реализуются в соответствующей аппаратуре (рис. 60).

Рис. 60. Аппаратно-технологическая схема периодического культивирования микроорганизмов в стерильных условиях: 1 — реактор для приготовления питательной среды; 2 — насос; 3 — нагреватель среды — стерилизационная колонка; 4 — выдерживатель; 5 — охладитель среды; 6 — индивидуальный фильтр воздуха; 7 — посевной ферментатор; 8 — рабочий ферментатор; 9 — мерник. вода; . пар; воздух

Управление процессами метаболизма продуцента может осуществляться следующими способами:

1) изменением состава питательной среды;

2) изменением условий внешней среды (температура, рН, аэрация);

3) конструкцией биореактора (ферментера);

4) регламентированием введения дополнительного субстрата;

5) фиксацией физиологического состояния культуры применением метода непрерывного культивирования;

6) использованием генетически модифицированных штаммов продуцента.

Реализация этих способов требует специальных инженерно-технологических подходов, обеспечивающих биохимическую регуляцию биосинтеза при сохранении свойств популяции продуцента (отсутствие повреждений клеток, автолиза, инфекции и др.).

Ферментация антибиотиков (рис. 61), как правило, аэробный процесс, требующий подачи воздуха в ферментационную среду и перемешивания.

Рис. 61. Ферментатор. 1 — мешалка одноярусная; 2 — отражательная перегородка; 3 — рубашка; 4 — привод мешалки; 5 — крышка; 6 — труба для подачи воздуха (барботер); 7 — корпус.

В антибиотической промышленности преимущественно применяют биореакторы объемом от 30 до 200 м 3 с механической мешалкой, снабженные системой автоматического контроля и управления процессом ферментации. Температуру ферментации (обычно 24-26°С) обеспечивает система охлаждения. После ферментации биомассу отделяют, антибиотик выделяют из фильтрата (для некоторых антибиотиков — из клеток продуцента) путем экстракции, ионообмена, ультрафильтрации, осаждения и кристаллизации. Процесс подготовки посевного материала, ферментации и многие из дальнейших операций проводят в асептических условиях.

Культура продуцента. Исходный штамм микроорганизма, продуцирующего антибиотик или другие БАВ, выделяют из природных источников (почва, растительные субстраты и др.) специальными методами скрининга; природный (дикий) штамм обладает низкой активностью, поэтому требуется длительная генетико-селекционная работа, обычно с применением мутагенов для повышения его активности. Полученный производственный штамм хранится в состоянии анабиоза (например, при низкой температуре в лиофилизированном состоянии). Такая культура может быть возвращена в активное состояние путем посева на соответствующую питательную среду и использована для приготовления посевного материала.

Приготовление посевного материала. Культуру с поверхности скошенного агара асептично переносят в колбу с посевной средой. При работе с грибами и актиномицетами используют споровый посевной материал (500-5000 спор на 1 л среды). Колбы инкубируют в термостате на качалке. Материал из колб переносят в инокулятор объемом 0,5-1 м 3 (0,1% посевного материала от объема среды) и выращивают 1-4 суток. Далее посевной материал асептично переносят в посевной ферментатор объемом 5-20 м 3 (1012% инокулята от объема питательной среды, время культивирования от 1 суток.). Постоянно отбирают пробы для микробиологического и биохимического анализов. Посевной материал для главной ферментации готовят в количестве 5-10% от объема питательной среды. Ступенчатая подготовка посевного материала позволяет получить его в количестве, необходимом для обеспечения быстрого и продуктивного роста в биореакторе, и поддерживает культуру в фазе логарифмического роста.

Питательная среда конструируется, таким образом, чтобы обеспечить быстрый рост микроорганизма в начальной стадии и максимальный выход продукта в конце ферментации. Среду стерилизуют паром под давлением при 120-140°С непосредственно в ферментаторе или в специальной установке непрерывной стерилизации.

Ферментация. Схема промышленного периодического процесса показана на рис. 61. Ферментер и систему трубопроводов перед заполнением средой моют, проверяют на герметичность и стерилизуют острым паром. Для обеспечения стерильности часто применяют предварительную обработку ферментера химическими дезинфицирующими веществами.

Количество стерильной охлажденной питательной среды в ферментере не должно превышать 70% от его объема. Через линию посевного материала с помощью стерильного воздуха в ферментатор вводят посевной материал. Температура и рН питательной среды до подачи посевного материала должны быть доведены до оптимальных значений для данной культуры.

Ферментацию проводят при аэрации (аэробный процесс) путем подачи стерильного воздуха или без подачи воздуха (анаэробный процесс) и перемешивании, которое способствует растворению кислорода в жидкой среде и полному контакту клеток с питательными веществами. Для предотвращения попадания нестерильного атмосферного воздуха в аппарат давление воздуха над поверхностью жидкости повышают до 20-30 кПа (0,2-0,3 кгс/см 3 ). При необходимости вводят химические пеногасители.

Во время ферментации автоматически регулируются температура и рН среды, по специальной программе вводятся добавочные компоненты питательной среды. Систематически берут контрольные пробы жидкости из ферментатора, в которых определяют необходимые физико-химические показатели, активность и отсутствие посторонних микроорганизмов.

Ферментацию прекращают, когда в среде накапливается максимальное количество полезного продукта. По окончании ферментации культуральную жидкость охлаждают до 10-25°С и перекачивают в резервуары, из которых она подается на дальнейшую обработку.

Способы выделения и очистки антибиотиков индивидуальны и определяются его физико-химическими характеристиками. Например, пенициллин выделяют из культуральной жидкости экстракционным методом (бутилацетатная экстракция), стрептомицин и тетрациклин — методом ионообменной хроматографии.

Биологическая библиотека - материалы для студентов, учителей, учеников и их родителей.

Наш сайт не претендует на авторство размещенных материалов. Мы только конвертируем в удобный формат материалы, которые находятся в открытом доступе и присланные нашими посетителями.

Если вы являетесь обладателем авторского права на любой размещенный у нас материал и намерены удалить его или получить ссылки на место коммерческого размещения материалов, обратитесь для согласования к администратору сайта.

Разрешается копировать материалы с обязательной гипертекстовой ссылкой на сайт, будьте благодарными мы затратили много усилий чтобы привести информацию в удобный вид.

Пути создание высокоактивных штаммов продуцентов антибиотиков с помощью
рДНК-биотехнологии. технология рДНК: с ее помощью можно создавать новые антибиотики с уникальной структурой.
Схема промышленного биотехнологического производства антибиотиков
Процесс промышленного производства антибиотиков включает следующие стадии:
1) подготовка
питательно среды: применяют твердые питательные среды – агаризованные или сыпучие субстраты (пшено, ячмень, пшеничные отруби и т.п.) и жидкие
питательные среды.
2) Подготовка посевного материала (продуценты-мутанты колба на качалке первый инокулятор (10 л) второй инокулятор (100–500 л) ферментер).
3)Ферментация: методы поверхностного и глубинного культивирования. В ходе ферментации культура непрерывно аэрируется стерильным подогретым воздухом.Процесс ферментации осуществляется в строго стерильной глубинной аэробной периодической культуре, носит выраженный двухфазный характер.
4) Выделение антибиотиков .Если антибиотик находится в клетках, на первом этапе обработки биомассу выделяют из культуральной жидкости (фильтрацией или центрифугированием); после разрушения клеток антибиотик экстрагируют и переводят в растворимую фазу. Затем данный раствор и культуральные среды (если антибиотик выделяется из клеток в среду) подвергают разным методам экстракции, разделения, очистки и концентрирования для получения готового продукта. Цель всех процедур постферментационной стадии – получение стерильных препаратов высокой степени чистоты.
5) Очистка антибиотиков . включает в себя: осаждение, сорбцию, сушку. Помимо традиционных экстракционных и сорбционных методов исп. мембранные технологии. При обезвоживании препаратов антибиотиков используют лиофильную или распылительную сушку. Затем препарат фасуют в стерильные флаконы с соблюдением условий, гарантирующих стерильность.
6) Получение готового продукта : при выделении, очистке и получении ЛФ также соблюдаются максимально возможные предосторожности против контаминации.Биологический контроль-степень стерильности препарата.
При фармакологическом контроле-испытания препарата на токсичность, пирогенность,

токсикогенность и др., оценивают антимикробный спектр препарата, действие на лейкоциты крови, устанавливают максимально переносимую дозу антибиотика, дозы, вызывающие полную и 50 % гибель экспериментальных животных. Готовая форма лекарственного препарата антибиотического вещества поступает к потребителю с указанием биологической активности и даты выпуска.
145.Условия синтеза антибиотиков. Питательные среды. Частные биотехнологии
антибиотиков. Схема производства пенициллина. Схема производства
цефалоспорина. Схема биотехнологического получения стрептомицина
Условия синтеза антибиотиков:
Стерильность. Отсутствие посторонней микрофлоры .Для обеспечения стерильности процесса вся аппаратура и коммуникации герметизируются, стерилизуются и держаться под давлением. Питательная среда и воздух для аэрации также стерилизуются. Засев ферментера, отбор проб на анализ проводится в асептических условиях.
Питательная среда. в питательной среде должны присутствовать источники азота, углерода, фосфора, предшественники антибиотиков и витамины.
К источникам азота относятся: аминокислоты, аммонийные соли и нитраты; к источникам углерода – глюкоза и лактоза; также в питательной среде должны присутствовать сера, магний, марганец, железо, цинк, кобальт. Кроме того, при производстве антибиотиков в состав питательной среды должны входить соевая мука, кукурузный экстракт и жмых масленичных культур.
рН. Для бактерий рH питательной среды составляет 7, для грибов – 4,5–5, для актиномицетов – 6,7–7,5. Для большинства известных антибиотиков оптимальная величина рН близка к нейтральной
Температура: для биосинтеза пенициллина грибом рода пеницилиум оптимальной температурой является 25–26 С, в то время как при образовании антибиотиков актиномицетами 27–29 С.
Перемешивание и аэрация:т.к. продуценты антибиотиков являются аэробами д.б. хорошая аэрация. Назначение аэрации и перемешивания – снабжение культуры кислородом, они способствуют поддержанию мицелия во взвешенном состоянии и выравниванию концентрации питательных веществ и продуктов обмена в культуральной жидкости.
Вспенивание. . Аэрация и перемешивание среды вызывают образование слоя пены на поверхности жидкости, что ухудшает условия развития продуцента., в состав среды вводят пеногасители (растительные и животные жиры, минеральные масла, ПАВ).
Частные биотехнологии антибиотиков .Схема производства пенициллина
Пенициллины относятся к β-лактамным антибиотикам.Все пенициллины имеют одинаковое строение основной группы, представленной тиазолидиновым кольцом, соединенным с β-лактамным кольцом, и имеющим аминогруппы – 6-аминопенициланновая кислота (6-АПК).Для производства пенициллина применяют специально отобранные расы плесневых грибов-суперпродуцентов рода Penicillum crysogenum. применяют биореакторы с механическим перемешиванием. Питательная среда
содержит: кукурузный экстракт (2–3 %), глюкозу (2 %) лактозу (1 %), сульфат аммония, фосфаты (0,5–1 %), производные фенилуксусной кислоты (0,3– 0,6 %), гидрол. В качестве углеводов часто используют сахарозу или смесь лактозы с глюкозой (1:1). Глюкоза может снижать биосинтез антибиотика; на средах, содержащих лактозу или сахарозу, биосинтез

антибиотика протекает активнее. В качестве источников серы -натрия сульфат и натрия тиосульфат. Избыток ионов меди не влияет на рост гриба, но подавляет биосинтез пенициллина. Эффект торможения биосинтеза снимается добавлением в среду ионов железа. Penicillum crysogenum в качестве источника фосфора может использовать не только фосфаты, но и фитаты. Для стабилизации рН добавляют мел. добавляют в качестве пеногасителя.
После стерилизации и охлаждения питательная среды засевается проросшими спорами гриба, аэрируется путем пропускания через нее воздуха и перемешивается с помощью мешалки. Температура в период первой фазы – 30 ºС, во вторую фазу – 20 ºС, рН роста гриба – ниже 7,0, потребление углеводов должно быть медленным, что достигается использованием лактозы, либо дробным внесением глюкозы. Подготовка посевного
материала: сначала размножаются споры на пшене во флаконах при 24–25 ºС в течении 4–
5 сут. Полученным споровым материалом засевают инокуляторы, затем посевные аппараты (12–18 ч). В процессе ферментации необходимо соблюдение строгой асептики.
После окончания процесса ферментации мицелий гриба отделяют вакуум-фильтрованием или центрифугирование. Осадок на фильтре (мицелий гриба) промывают водой для максимального выхода пенициллина. Из культуральной жидкости антибиотик, где он находится в виде кислоты, выделяют экстракцией неполярными органическими растворителями (аминоацетатом, хлороформом, бутилацетатом и др.). Очистку антибиотика проводят путем замены растворителей. Экстрагированный пенициллин в виде кислоты переводят в водный раствор в виде соли, добавляя щелочь. Повторяя эти операции, пенициллин концентрируют и очищают. Большинство пенициллинов производят в виде натриевых и калиевых солей.В сухой кристаллической форме пенициллиновые соли стабильны в течение длительного времени при температуре 4 °С. Растворы быстро теряют активность (в течение 24 ч при температуре 20 °С), их готовят непосредственно перед введением.
Схема производства цефалоспорина
Из гриба Cephalosporinum acremonium - цефалоспорин С. Его полусинтетические производные получили название цефалоспорины. К ним относятся цефалотин, цефалексин, цефаклор, цефотаксим, цефуроксим, цефоперазон, цефепим, цефтриаксон и др. По химическому строению цефалоспорин относится к β-лактамным соединениям, но β- лактамное кольцо конденсировано не с пяти, а с шестичленным гетероциклом.В процессе развития Cephalosporinum acremonium наряду с цефалоспорином С синтезируется и пенициллин N. Его образование идет тем же путем, что и образование изопенициллина N в процессе биосинтеза бензилпенициллина через ряд стадий из изопенициллина N образуется цефалоспорин С.
Продуцент целоспоринов может расти на средах, содержащих соевую муку, сухие дрожжи, жмыхи. Кроме того, в питательную среду добавляют аммонийные соли и фосфор, который способствует усвоению углеводов; цинк, марганец, магний, железо, мел.
Посевной материал сначала готовят в качалочных колбах, затем переносят в инокулятор, в посевной аппарат большего объема, а после в ферментер (70 ч).
Процесс ферментации осуществляется глубинным способом, в условиях постоянной аэрации и непрерывного перемешивания, при температуре 26–28 °С, в течение 7–8 сут.
Процесс культивирования осуществляют в асептических условиях.
Постферментационная стадия, связанная с выделением и очисткой цефалоспоринов, осуществляется по той же схеме, что и в случае пенициллинов.
Схема биотехнологического получения стрептомицина
Стрептомицин принадлежит к группе аминогликозидных антибиотиков Стрептомицина сульфат обладает широким спектром антимикробного действия. активен в отношении микобактерий туберкулеза и большинства Гр- и некоторых Гр+ м/о; менее активен в

отношении стрептококков, пневмококков; не действует на анаэробы, риккетсии и вирусы.
Действует бактерицидно.Для производства применяют штамм актиномицета Streptomyces
griseus, образующего воздушный мицелий и спор.
В качестве основы питательных сред -гидролизаты растительных и животных белков.
Основными компонентами питат. сред, - являются: соевая мука, гидрол и аммонийные соли.
Для стабилизации признаков, связанных с антибиотикообразованием, при хранении и поддержании штамма в среды добавляют антимутагены (пуриновые нуклеотиды, ионы марганца, L-метионины, гистидин, полиамины, кофеин и др.).
Среду стерилизуют при 120 ºС, охлаждают и засевают посевным материалом. При развитии продуцента различают 2 стадии. 1-происходит быстрый рост и развитие микроорганизма с энергичным использованием основных компонентов субстрата, максимальное потребление кислорода. стрептомицин синтезируется в незначительном количестве. Через 28 ч масса мицелия прекращает увеличиваться, начинается вторая
стадия, связанная с образованием стрептомицина. Хар. медленным потреблением оставшихся в среде питательных веществ, замедлением роста актиномицета, снижением потребления кислорода, автолизом мицелия, максимальным образованием стрептомицина.
Максимальное накопление стрептомицина наблюдается, когда автолитические процессы начинают преобладать над процессами роста. Культивирование проводится при 27 – 29 ºС и сопровождается аэрацией, рН 7,5 – 8,0 и перемешиванием.В культуральной жидкости находятся минеральные вещества, белки, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, полисахариды, жиры, стрептомицин и др. С целью извлечения стрептомицина из культуры продуцента культуральную жидкость вместе с биомассой обрабатывают минеральной кислотой. При этом весь антибиотик переходит в раствор. Мицелий отделяют фильтрованием или центрифугированием. Свободную от мицелия культуральную жидкость обрабатывают щавелевой кислотой. При этом достигается удаление белков и органических оснований, ионов металлов (кальция, магния, железа). Далее ведется выделение стрептомицина в чистом виде. Для выделения культуральной жидкости в чистом виде используются методы адсорбции на активированном угле и метод ионообменной
хроматографии.В асептических условиях соль стрептомицина растворяют в воде, пропускают через бактериальный фильтр для удаления микроорганизмов, лиофильно высушивают, измельчают в порошок и фасуют.
146. Пути получения новых антибиотиков. Усовершенствование производства
антибиотиков. Биотехнологическое получение интерферонов
Пути получения новых антибиотиков
Новые антибиотики можно получить путем генно-инженерных манипуляций с генами, участвующими в биосинтезе известных антибиотиков. Один из первых экспериментов, в ходе, которого получен новый антибиотик, состоял в объединении в одном микроорганизме двух немного различающихся путей биосинтеза антибиотика.
Одна из плазмид Streptomyces, pIJ2303, несущая фрагмент хромосомной ДНК
Streptomyces coelicolor длиной 32,5 т.п.н., содержит все гены ферментов, ответственных за биосинтез из ацетата антибиотика актинородина, представителя семейства изохроманхиноновых антибиотиков. Целую плазмиду и различные субклоны, несущие

агентами – интерфероногенами, которыми могут быть вирусы, бактерии и продукты их метаболизма, а также другие антигены и митогены.
1.Обладает антивирусным действием.2. Интерферон вызывает ингибирование клеточного роста (используется как противоопухолевое средство3. Интерферон оказывает стимулирующее влияние на фагоцитоз, 4. Интерферон обладает антимикробной активностью5.
Оказывает радиозащитное действие6.
Интерферон является иммуномодулятором – т. е. регулирует иммунологические реакции, стимулирует иммунную систему организма.В зависимости от происхождения ИНФ разделяют на несколько видов.
Различают α-, β-, γ-интерфероны. Расшифровка структурных генов позволила получить рекомбинантный интерферон. По химическому составу α-ИНФ является белком, а β, γ- интерфероны – гликопротеины.
Биотехнология производства IFN
Этапы на примере получения α-IFN
1. Суспензию лейкоцитарных клеток, выделенных из крови доноров, обрабатывают вирусом, оказывающим индуцирующий эффект на биосинтез IFN (н-р, вирусом Сендай).2.
Из лейкоцитов получают и-РНК, которая программирует биосинтез интерферона, при этом концентрация и-РНК в индуцированных лейкоцитах не более 0,1%.3. С помощью фермента обратной транскриптитазы (ревертазы) на полипептидной основе и-РНК синтезируют комплементарную ей одноцепочечную копию ДНК.4. Эукариотический ген в условии in vitro перестраивают, удаляя рестриктазой ту часть нуклеотидов, которая кодирует ненужную информацию.5. Созданный ген переносят в плазмиду, где он совмещается с бактериальным промотором, а затем вводится в бактериальную клетку-хозяин.
Таким образом создан штамм-продуцент E. coli, синтезирующий IFN в высоких концентрациях.
В 1л полученной бактериальной суспензии содержится около 5 мг α-IFN, что в 5тыс. раз больше того количества, которое можно получить из 1л донорской крови.
Существуют другие способы получения интерферона:1. На основе сконструированных рекомбинантных ДНК, экспрессируемых в клетках E. coli (α, β, α-IFN).2. Возможен синтез химическим путем β и α- интерферона3. Повышение биосинтеза IFN возможно при введении в эукариотическую дрожжевую клетку вектора, на основе которого сконструирована рекомбинантная молекула ДНК с ионами β и α- интерферонов4.
Производство IFN с применением моноклональных антител к соответствующему IFN.

В современных условиях наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов-продуцентов антибиотиков признан метод глубинного культивирования. Метод состоит в том, что микроорганизм развивается в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно подается стерильный воздух, и среда перемешивается.

Существует четыре основных модификации глубинного способа выращивания микроорганизмов.

1. Периодическое культивирование. При этом способе весь процесс развития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментаторе, после чего ферментатор освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежей питательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, и процесс возобновляется.

2. Отъемный метод. Культивирование микроорганизмов осуществляется в ферментаторах с периодическим отбором части объема культуральной жидкости в ферментаторе и доводится свежей питательной средой до исходного уровня.

3. Батарейный способ. Микроорганизмы развиваются в ряду последовательно соединенных ферментаторов. Культуральная жидкость на определенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментатора во второй, затем из второго в третий и т. д. Освобожденный ферментатор немедленно заполняется свежей питательной средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания микроорганизмов емкости используются более рационально.

4. Непрерывное культивирование. В основе метода лежит принцип непрерывного протока питательной среды, что позволяет поддерживать развитие микроорганизма на определенной стадии его роста. Стадия развития микроорганизма определяется тем, что в этот период происходит максимальный биосинтез антибиотика или другого биологически активного соединения. Установлено, что в условиях непрерывного процесса биосинтеза некоторых антибиотиков можно получить хорошие результаты, если процесс вести в две стадии. В первом аппарате батареи поддерживают высокую скорость потока, обеспечивающую большую скорость роста продуцента антибиотика, с тем, чтобы получить высокоактивную биомассу, а во втором аппарате - обеспечивают низкую скорость потока и соответственно небольшую скорость роста. Процесс непрерывного культивирования - перспективное направление современной биотехнологии.

Стерилизация питательных сред Для каждого продуцента антибиотика разрабатывается оптимальная питательная среда.

Среда должна соответствовать определенным требованиям:
а) обеспечивать максимальный выход антибиотика;
б) состоять из относительно дешевых компонентов;
в) иметь хорошую фильтрующую способность;
г) обеспечивать применение наиболее экономичных приемов выделения и очистки антибиотиков.

Стерилизация питательных сред в промышленных условиях осуществляется двумя методами: периодическим и непрерывным.

Периодический метод стерилизации применяется при использовании небольших объемов среды и состоит в том, что среда нагревается до температуры 120-130 С непосредственно в ферментаторах или в специальных котлах-стерилизаторах, выдерживается при этой температуре в течение 30-60 минут (в зависимости от объема среды и ее состава), после чего охлаждается до 27-30 С.

За время, затрачиваемое на нагрев среды до температуры, необходимой для стерилизации, и ее охлаждение, уничтожается значительное число микроорганизмов. Эффект стерилизации и сохранение термолабильных веществ достигаются в том случае, если стерилизацию проводят при более высокой температуре и за более короткое время.
Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять при использовании больших объемов среды.

Приготовленная среда из специального сосуда с помощью насоса подается в стерилизационную колонну, через которую пропускают острый пар (давление пара около 50 5 Па). Пар подают сверху по внутренней трубе, имеющей щелевидные прорези, благодаря чему он поступает в среду, быстро ее нагревая. Среда в колонну подается снизу и движется по спирали вокруг внутренней трубы.

Среда, нагретая в колонне до необходимой для стерилизации температуры (~130 С), поступает в специальный аппарат, где она выдерживается определенное время при температуре 125-130 С. Время выдержки зависит от состава среды и длится 5-10 минут. Отсюда стерильная среда поступает в змеевиковый холодильник, охлаждается до 30-35 С (на выходе) и поступает в ферментатор.

Непрерывный метод стерилизации имеет ряд преимуществ: возможность автоматического регулирования процесса, быстрый и равномерный нагрев среды, обеспечение более полной стерильности среды и др.

Подготовка посевного материала Подготовка посевного материала - одна из ответственейших операций в цикле биотехнологического способа получения антибиотиков. От количества и качества посевного материала зависит как развитие культуры в ферментаторе, так и биосинтез антибиотика. Продуцент обычно выращивают на богатых по составу натуральных средах, способных обеспечить наивысшую физиологическую активность микроорганизмов. Подготовка посевного материала - процесс многоступенчатый (рис.5.5).

Рис. 4.5. Схема многоступенчатого приготовления посевного материала А - выращивание во флаконах, Б - в колбах на качалках: 1 - законсервированный исходный материал; 2 - споровая генерация на косом агаре в пробирке; 3 - II споровая генерация на твердой среде в сосуде; 3 а и 3б - I и III генерации на жидкой среде в колбе; 4 - ферментатор предварительного инокулирования; 5 - ферментатор инокулирования; 6 - основной ферментатор

Микроорганизм предварительно выращивают на агаризованной среде в пробирке (1, 2), затем из пробирки делают высев в колбы с жидкой питательной средой и проводят две генерации при глубинном выращивании на качалках в течение двух-трех суток для каждой генерации (3а и 3б). Из второй генерации культуры в колбе делают посев в небольшой (10 л) инокулятор 4, после чего хорошо развившуюся культуру переносят в более крупный инокулятор 5 (100-500 л), откуда и делают посев в основной ферментатор 6. Для посева в основной ферментатор используют от 5 до 10 % посевного материала (инокулята).

Развитие продуцента антибиотика в ферментаторах Развитие микроорганизма в ферментаторах проходит при строгом контроле всех его стадий и очень точном выполнении регламента условий развития. Большое внимание уделяют поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотности среды (рН), степени аэрации и скорости работы мешалки. В процессе развития организма осуществляют биологический контроль, учитывают потребление организмом основных питательных компонентов субстрата (источника углерода, азота, фосфора), внимательно следят за образованием антибиотика. В последнее время все чаще биологический контроль проводят с помощью ЭВМ.

Большое внимание при развитии продуцента в ферментаторах обращают на процесс пеногашения. При продувании воздуха через культуру микроорганизма образуется обильная пена, которая существенно нарушает процесс развития продуцента антибиотика в ферментаторе. Появление большого количества пены обусловлено белковыми веществами, находящимися в среде, и ее высокой вязкостью, что связано с обильным накоплением биомассы.

Для борьбы с пеной в ферментаторах используют поверхностно-активные вещества: растительные масла (соевое, подсолнечное), животный жир (лярд, кашалотовый жир), а иногда минеральные масла (вазелиновое, парафиновое), спирты и высшие жирные кислоты. Нередко в качестве пеногасителей используют специально синтезированные вещества (силиконы, диазобутананкарбамил и др.).

Многие вещества (масла, жиры, спирты и др.), используемые в качестве пеногасителей, потребляются продуцентами антибиотиков как дополнительные источники углеродного питания. При этом часто наблюдается повышение выхода антибиотика. Однако внесение пеногасителя может снижать скорость растворения кислорода, что, в свою очередь, отрицательно сказывается на развитии микроорганизма и его биосинтетической активности.

Иногда используются механические способы пеногашения (отсасывание пены через специальные трубы, разрушение пузырьков пены сильными струями жидкости, пара или газа).

Общая схема производства антибиотиков до стадии выделения и химической очистки представлена на рис. 4.6.

Рис. 4.6. Схема производства антибиотиков: I - приготовление посевного материала; II - инокуляторы для наращивания посевного материала; III - стерилизатор среды для большого ферментатора; IV - установка для биосинтеза антибиотика; а - стерилизация среды в колбах; б - охлаждение и посев культуры продуцента в колбу; в - рост культуры в покое; г - рост культуры в качалке; д - инокулятор со стерильной средой; е - инокулятор со средой, засеянной культурой продуцента; ж - фильтры и компрессор; з - резервуар со сжатым воздухом; и - нагрев воздуха; к - ферментатор; л - рубашка для охлаждения ферментатора

Предварительная обработка культуральной жидкости, выделение и химическая очистка антибиотиков
В процессе развития микроорганизмов образуемые им антибиотики в большинстве случаев почти полностью выделяются из клеток в окружающую среду. Однако в ряде случаев в культуральную жидкость попадает лишь часть антибиотика, а другая часть сохраняется внутри клеток.

У ряда продуцентов антибиотик почти полностью содержится в клетках организма. В зависимости от того, где антибиотическое вещество сосредоточено, применяют соответствующие методы его извлечения. Так, если антибиотик находится в культуральной жидкости, его выделяют методами экстракции, используя для этого растворители, не смешивающиеся с жидкой фазой, осаждают в виде нерастворимого соединения или сорбируют ионообменными смолами.

Если антибиотик содержится в культуральной жидкости и в клетках продуцента, то сначала антибиотик переводят в фазу, из которой наиболее целесообразно его изолировать. Например, антибиотик, содержащийся в культуральной жидкости, и клетки с антибиотическим веществом переводят в осадок, из которого антибиотик экстрагируют.

Отделение нативного раствора от биомассы и взвешенных частиц проводят методами фильтрации или центрифугирования.

Цель химической очистки - извлечение антибиотика из нативной жидкости или из клеток продуцента, его концентрация и освобождение (собственно, очистка) от сопутствующих примесей и в конечном счете получение высокоочищенного препарата, пригодного для соответствующего применения.

В ряде случаев антибиотические вещества под влиянием жестких внешних факторов (повышенной температуры, высокой кислотности или щелочности и др.) теряют свои свойства, инактивируются. Поэтому при их выделении и очистке необходимо соблюдать максимум осторожности.

Основные методы очистки антибиотиков следующие: экстракция, ионообменная сорбция и осаждение.

В современных условиях наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов–продуцентов антибиотиков признан методглубинного культивирования. Метод состоит в том, что микроорганизмразвивается в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно подается стерильный воздух, и среда перемешивается.

Существует четыре основных модификации глубинного способавыращивания микроорганизмов.

1. Периодическое культивирование. При этом способе весь процессразвития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментаторе, после чего ферментатор освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежейпитательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, ипроцесс возобновляется.

3. Батарейный способ. Микроорганизмы развиваются в ряду последовательно соединенных ферментаторов. Культуральная жидкость наопределенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментатора во второй, затем из второго в третий и т. д. Освобожденный ферментатор немедленно заполняется свежей питательной средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания микроорганизмов емкости используются более рационально.

активного соединения. Установлено, что в условиях непрерывного процесса биосинтеза некоторых антибиотиков можно получить хорошиерезультаты, если процесс вести в две стадии. В первом аппарате батареиподдерживают высокую скорость потока, обеспечивающую большуюскорость роста продуцента антибиотика, с тем, чтобы получить высокоактивную биомассу, а во втором аппарате – обеспечивают низкую скорость потока и соответственно небольшую скорость роста. Процесс непрерывного культивирования – перспективное направление современной биотехнологии.

Стерилизация питательных сред

Для каждого продуцента антибиотика разрабатывается оптимальная питательная среда. Среда должна соответствовать определеннымтребованиям:

а) обеспечивать максимальный выход антибиотика;

б) состоять из относительно дешевых компонентов;

в) иметь хорошую фильтрующую способность;

г) обеспечивать применение наиболее экономичных приемов выделения и очистки антибиотиков.

Периодический метод стерилизации применяется при использовании небольших объемов среды и состоит в том, что среда нагревается дотемпературы 120–130 о С непосредственно в ферментаторах или в специальных котлах–стерилизаторах, выдерживается при этой температуре втечение 30–60 минут (в зависимости от объема среды и ее состава), после чего охлаждается до 27–30 о С.За время, затрачиваемое на нагрев среды до температуры, необходимой для стерилизации, и ее охлаждение, уничтожается значительноечисло микроорганизмов. Эффект стерилизации и сохранение термолабильных веществ достигаются в том случае, если стерилизацию проводят при более высокой температуре и за более короткое время.

Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять прииспользовании больших объемов среды. Приготовленная среда из специального сосуда с помощью насоса подается в стерилизационную колонну, через которую пропускают острый пар (давление пара около 505Па). Пар подают сверху по внутренней трубе, имеющей щелевидныепрорези, благодаря чему он поступает в среду, быстро ее нагревая. Среда в колонну подается снизу и движется по спирали вокруг внутреннейтрубы.Среда, нагретая в колонне до необходимой для стерилизации температуры (~130 оС), поступает в специальный аппарат, где она выдерживается определенное время при температуре 125–130 оС. Время выдержки зависит от состава среды и длится 5–10 минут. Отсюда стерильнаясреда поступает в змеевиковый холодильник, охлаждается до 30–35 оС(на выходе) и поступает в ферментатор.

Подготовка посевного материала

Подготовкапосевного материала – одна из ответственейших операций в цикле биотехнологического способа получения антибиотиков. Отколичества и качества посевного материала зависит как развитие культуры в ферментаторе, так и биосинтез антибиотика. Продуцент обычновыращивают на богатых по составу натуральных средах, способныхобеспечить наивысшую физиологическую активность микроорганизмов.

Подготовка посевного материала – процесс многоступенчатый (рис.1).

Рис. 1. Схема многоступенчатого приготовления посевного материала

А – выращивание во флаконах, Б – в колбах на качалках:1 – законсервированный исходный материал; 2 – споровая генерация на косом агарев пробирке; 3 – II споровая генерация на твердой среде в сосуде; 3а и 3б – I и III генерации на жидкой среде в колбе; 4 – ферментатор предварительного инокулирования; 5 – ферментатор инокулирования; 6 – основной ферментатор

Микроорганизм предварительно выращивают на агаризованнойсреде в пробирке (1, 2), затем из пробирки делают высев в колбы с жидкой питательной средой и проводят две генерации при глубинном выращивании на качалках в течение двух–трех суток для каждой генерации(3а и 3б). Из второй генерации культуры в колбе делают посев в небольшой (10 л) инокулятор 4, после чего хорошо развившуюся культурупереносят в более крупный инокулятор 5 (100–500 л), откуда и делаютпосев в основной ферментатор 6. Для посева в основной ферментаториспользуют от 5 до 10 % посевного материала (инокулята).

Развитие продуцента антибиотика в ферментаторах

Развитие микроорганизма в ферментаторах проходит при строгомконтроле всех его стадий и очень точном выполнении регламента условий развития. Большое внимание уделяют поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотности среды (рН), степениаэрации и скорости работы мешалки. В процессе развития организма осуществляют биологический контроль, учитывают потребление организмом основных питательных компонентов субстрата (источника углерода, азота, фосфора), внимательно следят за образованием антибиотика. В последнее время все чаще биологический контроль проводят с помощью ЭВМ.

Условия ферментации.

Рис.1.

- в среде не должно быть глюкозы (нельзя использовать легко усвояемыеисточники углеводов), используют трудно усвояемые источники углеводов –например, крахмал.

- в качестве источника аммонийного азота используют соевую муку;

- должна быть небольшая концентрация фосфора.

Предшественники β-лактамных антибиотиков.β-лактамные антибиотики синтезируются из аминокислот L-цистеин, L -валин, L -аминоадипиновая кислота, из которых синтезируется LLD-трипептид (L –валин превращается в D-валин). Из линейного LLD-трипептидаобразуется лактамное кольцо, затем образуется пятичленное серосодержащеекольцо и т.д. Антибиотики не являются продуктом матричного синтеза.

Аминогликозиды синтезируются из глюкозы.

синтеза в клетке, и антибиотик никак не воздействует на свой продуцент (неингибирует и не активирует другие процессы). К тому же мембраныпродуцента непроницаемы для вышедшего продуцента, тем самым создаваяусловия одностороннего движения антибиотика только во внешнюю среду.

Появление большого количества пены обусловлено белковыми веществами, находящимися в среде, и ее высокой вязкостью, что связано собильным накоплением биомассы.Для борьбы с пеной в ферментаторах используют поверхностноактивные вещества: растительные масла (соевое, подсолнечное), животный жир (лярд, кашалотовый жир), а иногда минеральные масла (вазелиновое, парафиновое), спирты и высшие жирные кислоты. Нередко вкачестве пеногасителей используют специально синтезированные вещества (силиконы, диазобутананкарбамил и др.).

Многие вещества (масла, жиры, спирты и др.), используемые в качестве пеногасителей, потребляются продуцентами антибиотиков какдополнительные источники углеродного питания. При этом часто наблюдается повышение выхода антибиотика. Однако внесение пеногасителя может снижать скорость растворения кислорода, что, в свою очередь, отрицательно сказывается на развитии микроорганизма и его биосинтетической активности.

Иногда используются механические способы пеногашения (отсасывание пены через специальные трубы, разрушение пузырьков пенысильными струями жидкости, пара или газа).

Общая схема производства антибиотиков до стадии выделения ихимической очистки представлена на рис. 2.

Читайте также: