Посев биологического материала методом диффузии в агар с применением стандартных дисков

Обновлено: 05.10.2024

Это качественный метод. Методики этого типа основаны на диффузии антибиотика из центральной диффузной зоны, чаще с бумажного диска, в среду, приготовленную на агаре, с посевом растущих микроорганизмов. Концентрация антибактериального препарата постепенно падает на пути от середины диска к периферии. Зона подавления роста микроорганизмов регистрируется в конце периода роста. Её можно сравнить с зонами, полученными при посеве "чувствительных" эталонных микроорганизмов, выращиваемых в аналогичных условиях.

Для образования зоны подавления роста бактерий требуется, чтобы в среде была создана критическая концентрация антибиотика, которая была бы достаточна, чтобы сдерживать рост на более низком уровне, чем критическая плотность клеток, при которой можно определить рост визуально. Когда концентрация антибиотика в среде падает ниже критической точки, происходит размножение клеток и образуется зона роста. При определении в одинаковых условиях существует тесная связь между критической концентрацией и МПК для каждой линии микроорганизмов.

Скорость диффузии определяется главным образом размерами, полярностью, растворимостью в липидах и способностью к хелатообразованию молекулы антибиотика, а также температурой инкубирования, градиентом концентрации, толщиной слоя, рН, ионной силой и другими характеристиками питательной среды. Скорость роста зависит от вида микроорганизма, температуры инкубирования культуры, атмосферы, в которой происходит рост, рН, начальной концентрации инокула, характера питательной среды, наличия антагонистов антибиотика и т. д.

Инокуляция

Количество инокулята существенным образом влияет на время, необходимое для достижения критической плотности бактерий, особенно для тех микроорганизмов, у которых механизм резистентности зависит от масштаба популяции. Посевы могут быть осуществлены путем заливки раствора с микроорганизмами на поверхность питательной среды (метод Эрикксона) либо путем инокуляции тампоном (метод Кирби- Бауэра), либо путем наслаивания на агар (метод Кирби-Бауэра, модификация Barry). В качестве инокулята в большинстве случаев используют сливной или полусливной рост посева микроорганизмов [1,8,29,30,34].

Принцип данного метода заключается в диффузии антибиотиков из бумажного диска, помещенного на твердую агаровую среду, засеянную испытуемой культурой. Наличие зоны задержки микробного роста вокруг диска и ее размер служат показателями чувствительности данного микроорганизма к противомикробному средству. Отсутствие зоны задержки роста вокруг диска свидетельствует об устойчивости микроорганизма к испытуемому препарату. Диски с антибиотическим препаратом изготовляют из фильтровальной бумаги диаметром 6 мм. В каждом диске создается стандартное количество противомикробного средства, соответствующее требованиям ВОЗ. Диски находятся во флаконе, на этикетке которого указано точное количество антибиотического препарата в одном диске. Флаконы с дисками хранят при температуре от 4 до 20 °С. Когда флаконы с дисками вынимают из холодильника, их, прежде чес открыть, выдерживают в течение часа при комнатной температуре, чтобы предотвратить конденсацию водяных паров. После вскрытия флакона диски с большинством антибиотиков можно использовать в течение 30 дней, а с препаратами пенициллиновой группы – в течение 7 дней.

Расплавленный питательный агар разливают по 20 мл в стерильные чашки Петри. Готовые чашки могут храниться при температуре не выше 6°С в течение 7 суток. Непосредственно перед посевом чашки Петри подсушивают в течение 45-60 мин в термостате при 37°С с приоткрытыми крышками.

В качестве посевного материала используют суточную бульонную культуру или смыв с суточной агаровой культуры. Бактериальную миллиардную взвесь в объеме 1 мл наносят на агар и равномерно распределяют по всей поверхности питательной среды покачиванием чашки. Затем чашку наклоняют для стока избытка жидкости, которую удаляют пипеткой.

Перед нанесением дисков чашки Петри подсушивают с приоткрытыми крышками при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Диски с различными антибиотиками стерильным пинцетом плотно накладывают на поверхность засеянной среды. В каждую чашку помещают не более шести дисков на расстоянии примерно 2 см друг от друга и от края чашки, чтобы исключить возможность наложения зон торможения роста от разных дисков. Чашки с дисками инкубируют в течение 18 часов при температуре 37 °С в перевернутом положении, чтобы предотвратить размывание газона конденсационной жидкостью.

Измерение диаметров зон задержки роста проводят с точностью до 1 мм с помощью линейки. Отсутствие зоны задержки роста вокруг диска указывает на устойчивость испытуемого возбудителя к данному антибиотику. При зоне лизиса диаметром до 10 мм штамм расценивается как малочувствительный. Зоны диаметром > 10 мм указывают на чувствительность штамма к данной концентрации противомикробного препарата. По таблице 2 можно количественно оценить степень чувствительности микроорганизма к антибактериальным препаратам в зависимости от диаметра зоны задержки роста и значения МПК.

Таблица 2 – коррелятивная связь диаметра зон задержки роста микроорганизмов с МПК антибиотиков

Антибиотик, содержащийся в диске Содержание антибиотика в диске, мкг Диаметр зон задержки роста, мм МПК, мкг/мл
Устойчивые штаммы Умеренно устойчивые штаммы Чувстви-тельные штаммы Чувстви-тельные штаммы Устойчи-вые штаммы
Ампициллин ≤ 20 21-28 ≥ 29
Пенициллин для гр(-) бактерий для гр(+)бактерий ≤ 20 ≤ 9 21-28 10-13 ≥ 29 ≥ 14 ≤ 0,1 ≤ 5-15 ≥ 1.5 ≥ 32
Гентамицин ≤ 13 - ≥ 14 ≤ 6 ≥ 6
Доксициклин ≤ 12 13-19 ≥ 20 ≤ 4 ≥ 12
Канамицин ≤ 14 15-18 ≥ 19 ≤ 6-10 ≥ 25
Левомицетин ≤ 12 13-19 ≥ 20 ≤ 12,5 ≥ 25
Линкомицин ≤ 19 20-23 ≥ 24 ≤ 2 ≥ 8
Метициллин ≤ 13 14-17 ≥ 18 ≤ 6 ≥ 25
Неомицин ≤ 13 14-17 ≥ 18 ≤ 10 ≥ 25
Олеандомицин ≤ 12 13-17 ≥ 18 ≤ 5 ≥ 10
Оксациллин ≤ 19 20-23 ≥ 24 ≤ 6 ≥ 32
Полимиксин ≤ 8 9-12 ≥ 13 ≤ 10 ≥ 50
Ристомицин ≤ 14 15-17 ≥ 17 ≤ 10 ≥ 25
Рифампицин ≤ 9 10-12 ≥ 13 ≤ 15 ≥ 25
Стрептомицин ≤ 13 14-16 ≥ 17 ≤ 10 ≥ 25
Тетрациклин ≤ 15 16-19 ≥ 20 ≤ 5 ≥ 10
Эритромицин ≤ 14 15-18 ≥ 19 ≤ 2 ≥ 8

По рекомендации ВОЗ при определении диаметра задержки роста не учитывают очень маленькие колонии, выявляемые при определенных условиях освещения в пределах зоны торможения роста. В случае образования зон задержки роста с не резко очерченными краями измеряют диаметр только четко выраженной зоны, не принимая во внимание едва заметные колонии.

Метод серийных разведений в плотных средах для определения чувствительности к антибиотикам ( антибактериальным средствам ). Диффузионные методы. Метод дисков.

Диффузионные методы. Метод дисков.

Диффузионные методы менее точны, чем методы разведений, но более просты в исполнении и позволяют определять чувствительность к нескольким ЛС одновременно. Поэтому их чаще применяют на практике. Исходный метод. Чашки Петри заполняют питательной средой, соответствующей пищевым потребностям возбудителя, слоем в 4-5 мм.

Метод серийных разведений в плотных средах для определения чувствительности к антибиотикам ( антибактериальным средствам )

После застывания агар подсушивают в термостате при 37 "С в течение 20 мин. Посев тест-культуры можно осуществлять внесением в полуостывший агар, но чаще микробную взвесь наслаивают на агар. После равномерного распределения по поверхности излишки взвеси удаляют, а чашки подсушивают в термостате. В агаре пробивают лунки и в каждую вносят по 0,1 мл раствора исследуемых препаратов, после чего инкубируют 18 ч при 37 °С (срок инкубации может варьировать в зависимости от скорости роста микроорганизма). Активность учитывают, измеряя диаметр зоны подавления роста для каждого препарата.

Метод дисков. В настоящее время вместо классического (исходного) метода повсеместно применяют модификацию, предложенную Кирби и Бауэром и признанную стандартным тестом. После посева тест-культуры на агар наносят диски из фильтровальной бумаги, пропитанные различными антимикробными препаратами (используют коммерческие образцы, содержащие известные концентрации). После инкубации при 37 "С в течение времени, необходимого для роста выделенного возбудителя, проводят определение диаметра зоны торможения роста. Размеры зон, полученные в опыте, сравнивают с величинами зон задержки роста, указанными в инструкциях, прилагаемых к дискам, после чего выделенные микроорганизмы относят к чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ
К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ

Дата введения: с момента утверждения

1. РАЗРАБОТАНЫ: Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии (Н.А.Семина, С.В.Сидоренко); Государственным научным центром по антибиотикам (С.П.Резван, С.А.Грудинина); Научно-исследовательским институтом антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии (Л.С.Страчунский, О.У.Стецюк, Р.С.Козлов, М.В.Эйдельштейн); Кафедрой микробиологии и химиотерапии Российской медицинской академии последипломного образования (Е.А.Ведьмина, Л.Г.Столярова, И.В.Власова); Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (З.С.Середа).

2. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 4 марта 2004 г.

3. ВВЕДЕНЫ ВЗАМЕН "Методических указаний по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков", утв. Заместителем Главного государственного санитарного врача СССР В.Е.Ковшило 10 марта 1983 г. N 2675-83.

1. Область применения

1.1. В настоящих методических указаниях изложены стандартные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (методы серийных разведений и диско-диффузионный метод).

1.2. Методические указания предназначены для применения в микробиологических лабораториях учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы и здравоохранения.

2. Общие сведения

Определение чувствительности микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека к антибактериальным препаратам (АБП) - приобретает все более важное значение в связи с появлением и широким распространением антибиотико-резистентности у бактерий. Стандартные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП (диско-диффузионный и серийных разведений) были разработаны во второй половине 60-х - начале 70-х годов XX века и с тех пор с методической точки зрения не претерпели принципиальных изменений.

Однако внедрение в клиническую практику значительного количества новых АБП и появление новых механизмов антибиотико-резистентности у микроорганизмов потребовало более строгой стандартизации процедуры тестирования, разработки новых подходов к интерпретации результатов, внедрения современной системы внутреннего контроля качества на каждом этапе исследования.

В настоящих методических указаниях систематизированы современные подходы к определению чувствительности бактериальных возбудителей инфекционных заболеваний человека, учитывающие рекомендации Европейского комитета по определению чувствительности к антибиотикам, а также Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам США.

Исследования чувствительности микроорганизмов к АБП осуществляются для решения следующих задач:

- обоснование целенаправленной индивидуальной антибактериальной терапии для лечения конкретной инфекционной болезни отдельным пациентам;

- обоснование эмпирической терапии отдельных нозологических форм инфекционных болезней в пределах лечебных учреждений или географических регионов;

- осуществление наблюдения за распространением антибиотико-резистентности в отдельных учреждениях или географических регионах;

- исследование новых химических соединений на наличие антибактериальной активности.

3. Показания для исследования чувствительности микроорганизмов
к антибактериальным препаратам

В ходе повседневной деятельности в бактериологических лабораториях из различных биологических материалов и объектов внешней среды выделяют множество бактерий, относящихся к различным таксономическим группам. Однако определение чувствительности выделенных микроорганизмов к АБП показано далеко не во всех случаях. Определение показаний для исследования чувствительности микроорганизмов к АБП является обязанностью врача-бактериолога.

Определять чувствительность к АБП представителей нормальной микрофлоры человека, при их выделении из естественных мест обитания, бактерий, выделенных из объектов внешней среды, за исключением случаев проведения специальных исследований, нецелесообразно.

Обязательному исследованию на чувствительность к АБП подлежат все микроорганизмы, выделенные из первично стерильных жидкостей, органов и тканей человека. В остальных случаях оценке чувствительности должна предшествовать оценка клинической значимости выделенного микроорганизма.

Определение чувствительности выделенного штамма микроорганизма показано, если уровень его устойчивости к АБП не может быть предсказан на основании данных идентификации или вероятной таксономической принадлежности микроорганизма. Практически важной задачей является выявление приобретенной резистентности к АБП у природно-чувствительных к ним микроорганизмов. Подтверждение природной чувствительности или резистентности микроорганизма к АБП не является целью практических исследований.

Исследованию по оценке антибиотикочувствительности подлежат чистые культуры микроорганизмов или материал изолированных колоний с плотных питательных сред после первичного посева образца клинического материала, в последнем случае параллельно необходимо провести идентификацию культуры.

При обнаружении на плотных питательных средах после первичного посева смешанной культуры исследовать антибиотикочувствительность до идентификации и оценки этиологической значимости отдельных микроорганизмов нецелесообразно.

Прямое определение чувствительности с использованием клинического материала (без выделения чистой культуры) возможно только в исключительных случаях при условии подтверждения однородности культуры и высокой степени обсемененности при окраске по Граму, причем исследование следует повторить после выделения чистой культуры микроорганизма.

Следует уделять особое внимание определению чувствительности микроорганизмов, относящихся к таксономическим группам, для которых характерна высокая частота распространения приобретенной резистентности.

У микроорганизмов, проявляющих универсальную чувствительность к каким-либо АБП, т.е. когда случаев резистентности не описано (например, Streptococcus pyogenes - все штаммы чувствительны к пенициллину), проводить определение чувствительности к этим препаратам в повседневной практике нецелесообразно.

Факты выявления резистентности у микроорганизмов, для которых этот феномен ранее не был описан в научной литературе, следует оценивать с крайней осторожностью и рекомендуется обращаться за консультациями в лаборатории, занимающиеся изучением антибиотико-резистентности.

Не следует в практических целях исследовать микроорганизмы, для которых методы определения чувствительности в настоящее время не стандартизованы и отсутствуют критерии интерпретации результатов. Результаты, полученные в данном случае, не могут служить основанием для назначения антибактериального препарата, если соответствующая нозологическая форма не приведена в утвержденной инструкции по его применению.

4. Методы определения чувствительности микроорганизмов
к антибактериальным препаратам

4.1. Общая характеристика методов

Современные стандартизованные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП подразделяют на методы серийных разведений и диффузионные.

Методы серийных разведений основаны на прямом определении основного количественного показателя, характеризующего микробиологическую активность АБП - величины его минимальной подавляющей концентрации (МПК).

МПК - минимальная концентрация, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма в бульонной культуре или на плотной среде.

Для определения МПК заданные концентрации АБП вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма и после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.

В зависимости от характера используемой питательной среды различают методы серийных разведений в агаре или в бульоне. В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют методы серийных макро- и микроразведений.

Разновидностью метода серийных разведений является также метод, основанный на использовании только двух концентраций АБП, соответствующих пограничным значениям МПК (см. ниже). Этот принцип исследования широко используется в автоматизированных системах для определения чувствительности микроорганизмов.

Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диффузии АБП из носителя в плотную питательную среду и подавлении роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация АБП превосходит МПК.

В настоящее время существуют две основные модификации диффузионного метода: диско-диффузионный и Е-тест.

В диско-диффузионном методе в качестве носителя АБП используют бумажный диск. Образование зоны подавления роста происходит в результате диффузии АБП из носителя в питательную среду. В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК. Однако диско-диффузионный метод позволяет лишь косвенно судить о величине МПК, а результатом исследования является отнесение микроорганизма к одной из категорий чувствительности (чувствительный, промежуточный или резистентный).

Е-тест представляет собой узкую полоску полимера (0,5х6,0 см), на которую нанесен градиент концентраций АБП (от минимальных до максимальных). Подавление роста микроорганизма вокруг полоски Е-теста происходит только в той зоне, где концентрация АБП, диффундирующего из носителя, выше МПК, при этом образуется каплевидная зона ингибиции. Значения концентрации АБП в каждом участке носителя типографским способом нанесены на наружной (обращенной к исследователю) поверхности Е-теста. Величину МПК учитывают в том месте, где граница зоны подавления роста вплотную подходит к носителю. Детальные инструкции по определению чувствительности с использованием Е-тестов прилагаются изготовителем к набору реактивов.

4.1.1. Основные этапы проведения тестирования

Оценка антибиотикочувствительности, независимо от конкретного метода, предполагает последовательное выполнение нескольких этапов:

- приготовление питательных сред;

- приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулюма);

- учет и интерпретация результатов, формулировка рекомендаций по лечению.

Диффузионные методы включают также этап наложения дисков или полосок Е-теста на плотную питательную среду.

4.1.2. Приготовление питательных сред для определения чувствительности

Для оценки чувствительности используют специально предназначенные для этой цели среды, разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке и по своим характеристикам удовлетворяющие требованиям, приведенным в разделе 5. Внутрилабораторный контроль качества среды проводят при использовании всех сред, разрешенных к применению в Российской Федерации в установленном порядке.

Вид питательной среды для оценки чувствительности определяют выбранным методом проведения исследования (агар или бульон), а также видом тестируемого микроорганизма.

Агар разливают по чашкам слоем толщиной 4 мм (на чашку диаметром 100 мм требуется 25 мл агара, на чашку диаметром 90 мм - 20 мл). Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах в холодильнике при 4-8 °С в течение 5 суток.

4.1.3. Приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулюма)

Общим и принципиально важным для всех методов тестирования является стандартизация суспензии исследуемого микроорганизма, ее концентрация должна составлять 1,5·10 КОЕ/мл. Практически наиболее приемлемым методом оценки концентрации бактериальной суспензии является измерение ее оптической плотности. Оптическая плотность бактериальной суспензии с концентрацией 1,5·10 КОЕ/мл при визуальном контроле соответствует стандарту мутности 0,5 по МакФарланду. Контроль оптической плотности суспензии можно также осуществлять спектрофотометрически (денситометрически). Существуют коммерчески доступные стандарты мутности и спектрофотометры. Бактериальную суспензию можно готовить либо из бульонной, либо из агаровой культуры.

Приготовление инокулюма из агаровой культуры

Для приготовления инокулюма используют чистую суточную культуру микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах. Отбирают несколько однотипных, четко изолированных колоний, выросших на неселективных плотных питательных средах. Петлей переносят незначительное количество материала с верхушек колоний в пробирку со стерильным физиологическим раствором или питательным бульоном, доводя плотность инокулюма точно до 0,5 по стандарту МакФарланда. Инокулюм следует использовать в течение 15 мин после приготовления.

Приготовление инокулюма из бульонной культуры

При определении чувствительности быстро растущих бактерий с обычными питательными потребностями для приготовления инокулюма также можно использовать 5-6-часовую бульонную культуру микроорганизма. Для этого отбирают несколько однотипных изолированных колоний, петлей переносят незначительное количество материала в пробирку с 4,0-5,0 мл жидкой неселективной питательной средой. Инкубируют при 35 °С. Через 5-6 ч инкубации плотность микробной суспензии приблизительно соответствует необходимой, и ее точно доводят до 0,5 по МакФарланду путем добавления стерильного бульона или физиологического раствора.

Стандарт МакФарланда может быть либо приобретен, либо приготовлен в лаборатории.

4.1.4. Приготовление стандарта 0,5 по МакФарланду

К 0,5 мл раствора ВаСl в концентрации 0,048 моль/л (1,175% раствор ВаСl·2HO) медленно при тщательном перемешивании добавить 99,5 мл раствора HSO в концентрации 0,18 моль/л (1%) до получения гомогенной суспензии.

Полученную суспензию необходимо разлить по 4-6 мл в пробирки с герметично закрывающимися крышками. Пробирки должны быть такого же диаметра, как и используемые для приготовления бактериальной суспензии.

Хранить пробирки с суспензией необходимо в темноте при комнатной температуре.

Перед использованием пробирки необходимо тщательно встряхивать и оценивать однородность суспензии. При появлении видимых частиц пробирки изымаются из употребления.

Стандарт мутности необходимо обновлять или проверять его оптическую плотность ежемесячно.

4.2. Методы серийных разведений

4.2.1. Приготовление растворов АБП для методов серийных разведений

Общим и крайне важным этапом для всех методов серийных разведений является приготовление растворов АБП. Различают "основные" растворы АБП (пригодные для хранения) и "рабочие" - те, которые необходимо использовать "ех tempore" для приготовления питательных сред.

Для приготовления основных растворов АБП необходимо использовать субстанции АБП с известной активностью, лекарственные формы не пригодны. Для взвешивания субстанций необходимо использовать электронные лабораторные весы с точностью до 4 знака, для измерения объемов - калиброванные дозаторы и пипетки.

На поверхность среды наносят 1 мл исследуемой культуры, покачивают пробирку для распределения культуры по поверхности, а излишки жидкости отсасывают пипеткой. Засеянные чашки подсушивают при комнатной температуре, затем стерильным пинцетом на поверхность среды кладут диски, пропитанные различными антибиотиками. Диски должны находиться на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 2-2,5 см от края чашки. Каждая чашка может служить для одновременного испытания штамма к действию 5-8 антибиотиков. Засеянные чашки на 18 часов помещают в термостат при 37°С.

Антибиотик диффундирует в агар, формируя вокруг диска зону задержки роста чувствительных к нему бактерий. Наибольшая концентрация антибиотика отмечается в месте расположения диска; по направлению к периферии содержание его снижается.

Измерение зоны задержки роста производят с помощью циркуля или миллиметровой линейки. Измеряемый диаметр зоны должен проходить через центр диска.

При зоне задержки роста диаметром до 10 мм штамм расценивается как малочувствительный, зона задержки роста более 10 мм свидетельствует о чувствительности штамма к исследуемому материалу.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений.

Сущность данного метода - выявление роста исследуемой микробной культуры в ряду пробирок с питательной средой, содержащей разные концентрации антибиотиков. Метод серийных разведений позволяет определить минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост, изучаемого микроорганизма.

Из порошка антибиотика (желательно стандарта) делают навеску и растворяют стерильной дистиллированной водой из такого расчета, чтобы в 1 мл раствора содержалось 2000 мкг/Ед. Из полученного основного раствора готовят все последующие разведения антибиотиков, диапазон серии разведений определяется установленными критериями чувствительности микроба.

Для разделения антибиотиков служат стандартные питательные среды (мясопептонный бульон, бульон на переваре Хоттингера, рН 7,2—7,4), обеспечивающие оптимальные условия роста исследуемого вида и не содержащие веществ, подавляющих действие антибиотиков.

В приготовленные разведения антибиотика вносят бульонные культуры микроорганизмов в логарифмической или ранней стационарной фазе роста. Для большинства патогенных микроорганизмов этот период соответствует 16—18 ч; для некоторых видов, рост которых замедлен,—48 ч. Вместо бульонных культур допускается использование агаровых культур, которые разводят бульоном и стандартизируют. Бульонную культуру или взвесь агаровой культуры исследуемых бактерий в бульоне добавляют в объеме 1 мл к каждому разведению антибиотика. При этом концентрация антибиотика в пробирке становится в 2 раза ниже. Все ряды пробирок включают по одной контрольной пробирке, содержащей 1 мл бульона без антибиотика и 1 мл культуры каждого испытываемого штамма.

Штатив с пробирками помещают в термостат при 37°С на 16—20 ч. Учитывают полученные результаты, отмечая последнюю пробирку с отчетливо видимой задержкой микробного роста. Количество антибиотика в этой пробирке представляет собой минимальную ингибирующую концентрацию для испытываемого штамма, определяющую степень чувствительности его к данному антибиотику.

Читайте также: