Посев чистой культуры для фаготипирования производят

Обновлено: 05.10.2024

в) изучение биохимической активности бактерий:посев выделенной чистой культуры на среды Гисса (для определения сахаролитической активности), желатини МПБ с индикаторными бумажками на индол, аммиакисероводород(для выявления протеолитической активности).Инкубация при 37 о С в течение 24 часов.

Примечание 1: изучение биохимических свойств проводят только при работе с чистой культурой бактерий. При этом определяют свойства каждого выделенного микроорганизма в отдельности. Если при микроскопии мазка из материала со скошенного МПА обнаруживается смесь бактерий, то процедуру выделения чистой культуры бактерий необходимо повторить.

Примечание 2: для адекватной оценки биохимической активности бактерий необходимо исследовать не менее 15-20 тестов!

Таблица 7.Ферментативные свойства бактерий

Предполагаемый возбудитель	САХАРОЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА	ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
Лактоза	Глюкоза	Мальтоза	Маннит	Сахароза	Индол	Сероводород

г) изучение антигенных свойств выделенных бактерий (будет проводиться в разделе:”ИНФЕКЦИЯ И ИММУНИТЕТ”).

Б. Определение чувствительности бактерий к антибиотикамметодом дисков. Инкубация при37 о С в течение 24ч.

В. Внутривидовая идентификация выделенной чистой культуры бактерий(эпидемиологическое маркирование). Проводится часто с целью определения источника инфекции. С этой целью применяют фаготипирование, рестрикционный анализ, определение плазмидного профиля бактерий и др. исследования.

ЭТАП. Учет результатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: на основании изучения морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств бактерий, выделенных из исследуемого материала, можно сделать вывод об их принадлежности к виду __________________________ и виду ____________________________________.

Таблица 8.Определение количества бактерий в исследуемом материале (метод серийных разведений)

Разведение материала	10 -	10 -	10 -
Засеваемый объем, мл	0,1	0,1	0,1
Результат (количество колоний):
Расчет:
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: количество бактерий в исследуемом материале _________________ КОЕ/мл

Таблица 9.Схема определения микробного числа воды

Разведение воды	1:10	1:100	1:1000
Засеваемый объем, мл
МПА, в мл
Результат (количество колоний):
Расчет:
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: микробное число исследуемой воды _________________КОЕ/мл

Таблица 10. Схема микробиологического исследования воздуха

Метод исследования	Место отбора проб воздуха	Время экспозиции	Объем исследуемой пробы воздуха	Описание колоний
Седиментационный (по Коху). Посев на МПА	· аудитория	5 минут	10 л
·	5 минут	10 л
Аспирационный (аппарат Кротова или ПУ-2). Посев на МПА, кровяной агар	аудитория	Устанавлива-ется автоматически	100 л
Расчет: количество бактерий (определено методом Коха) - количество бактерий (определено аспирационным методом) - количество грибов (по Коху или методом аспирации) -
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: микробное число исследуемого воздуха _________________КОЕ/м 3 , где количество бактерий - ________КОЕ/м 3 ; количество грибов - _____ КОЕ/м 3 , что соответствует (не соответствует) установленным нормативам.

Рисунок 1. Культуральные свойства бактерий. Характер роста бактерий на жидких питательных средах

Пленка на поверхности (аэробы)

Придонный рост (микроаэрофилы)

Диффузный рост (факультативные анаэробы)

Рисунок 2. Культуральные свойства бактерий. Пигменты бактерий

Staphylococcus aureus

S. epidermidis

Micrococcus luteus

Pseudomonas aeruginosa

Serratia marcescens

Рисунок 3. Рост бактерий на среде Эндо

Лактозопозитивные бактерии

Лактозонегативные бактерии

Рисунок 4. Культивирование анаэробов (метод Фортнера)

Аэробы

Анаэробы

_Мазок зубного налета

_____________________

Таблица 12. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений

Ингредиенты	контроль
МПБ, в мл	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Пенициллин, ЕД/мл	0,5	0,25	0,125	0,06	0,03	--
Стафилококк	по одной “петле”
Результаты(рост/отсутствие роста):
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: минимальная ингибирующая концентрация (МИК) пенициллина____ЕД/мл

Таблица 13. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом диффузии в агар (методом дисков)

Вид бактерий	Антибиотик, диаметр зоны задержки роста, мм
цефалексин	доксициклин
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: выделенные бактерии вида _______________________ чувствительны к ________________________________________________, устойчивы к ____________________; выделенные бактерии вида________________ чувствительны к __________________________, устойчивы к ______________________________________________________.

Рисунок 5. Схема определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков

Ø Цефалексин

1. Принципы и методы выделения чистых культур бактерий. Методы культивирования анаэробов. Внутривидовая идентификация бактерий (эпидемическое маркирование).

Выделение чистых культур микроорганизмов и последующее изучение их свойств, физиологических и биохимических процессов, ими осуществляемых – один из важнейших приемов микробиологического анализа. Чистая культура – это культура, содержащая только один вид микроорганизма.

Методы выделения чистых культур основываются на разделении микробных смесей на отдельные клетки. Эти методы условно можно разделить на несколько групп:

1. Методы, основанные на механическом разобщении отдельных клеток микробов в питательных средах (используют при первичном выделении микроорганизмов из материала).

2. Методы предварительной обработки исследуемого материала физическими или химическими факторами, оказывающими избирательное антибактериальной действие или избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры различными факторами (например, при получении культур грамотрицательных бактерий в среды вносят антибиотики, подавляющие рост грамположительной микрофлоры).

3. Методы, использующие способность некоторых микроорганизмов быстро размножаться в организме чувствительных к ним лабораторных животных.

4. Выделение отдельных клеток под контролем глаза с помощью микроманипулятора.

Описанные методы не дают полной уверенности в чистоте выделенной культуры. Поэтому после выделения микроорганизмов в чистые культуры еще раз проверяют их чистоту. Для этого рассеивают их на плотные среды различного состава и наблюдают за характером и однородностью роста колоний. Одновременно проводят микроскопический контроль, при котором о чистоте культуры судят по однородности клеток в препарате.

Для выделения чистых культур патогенных микроорганизмов часто проводится заражение восприимчивых животных.

Чистые культуры сохраняются и поддерживаются в лабораториях, из них составляют коллекции микробных культур. Значение таких коллекций очень велико для развития микробиологии и связанных с ней отраслей науки и практики. Целью создания коллекции микробных культур является сохранение и поддерживание полезных свойств микроорганизмов – продуцентов БАВ, сохранение таксономических свойств эталонных культур, применяемых для идентификации вновь выделенных штаммов.

Сохранение жизнеспособности и поддержание свойств микроорганизмов в течение длительного времени сопряжено с большими трудностями. Поэтому ведутся непрерывные поиски наилучшего методов их хранения. Одним из первых и наиболее распространенных способов поддержания коллекций культур является метод периодических пересевов на свежие питательные среды. Однако по мере увеличения объема коллекцией это становится все более трудной задачей. Кроме того, в процессе пересевов микроорганизмов существенно изменяют свои свойства. Поэтому стали применять различные методы консервации культур: хранение на агаризованных питательных средах при температуре около 50C в замороженном состоянии, под слоем вазелинового масла. Применяется также лиофилизация – высушивание из замороженного состояния с последующим хранением запаянных ампул в холодильниках.

Сущность условий, необходимых для культивирования анаэробов, заключается в снижении парциального давления молекулярного кислорода.

1. Посев уколом в столбик сахарного агара.

2. Метод Виньял-Вейона: в расплавленный и остуженный до 50° С агар вносят исследуемую анаэробную культуру, перемешивают и засасывают в пастеровскую пипетку, конец которой запаивают. Через 24 — 48 часов столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов — анаэробов.

1. Анаэростат — создание вакуумных условий.

2. Аппарат Киппа — замена воздуха индифферентным газом (водородом).

3. Среда Китт-Тароцци — содержит кусочки печени, обладающие высокой адсорбционной способностью, 0.5% глюкозы. Перед посевом среду кипятят на водяной бане не менее 15 минут, сверху заливают слоем вазелинового масла, чтобы предохранить посев от проникновения кислорода,

1. Прибор Омелянского — для поглощения кислорода используется пирогаллол.

2. Среда Вильсон — Блера. Содержит глюкозу, сернисто-кислый натрий, хлорид железа. Анаэробы образуют черные колонии за счет восстановления сернисто-кислого натрия в сернистый натрий, который, соединяясь с хлоридом железа, образуют осадок черного цвета - сернистое железо.

Биологический метод Фортнера

С целью выявления эпидемической цепочки заболевания, в т. ч. для обнаружения источника инфекции, осуществляют внутривидовую идентификацию бактерий, которая заключается в определении фаготипа (фаговара), изучении антигенных и других свойств выделенных бактерий. Определение фаготипа - фаготипирование производят при стафилококковой инфекции, брюшном тифе, паратифе В.

Фаготипирование — один из методов эпидемиологического маркирования. Применяется для выявления источника инфекции. Выделение бактерий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения. Предварительно фаготируется.

Тесты онлайн по различным предметам и дисциплинам. Большая подборка полезных тестов онлайн включающая экзамен охранника, мигранта, по охране труда, в ГИМС, по русскому языку, литературе, а также для получения лицензии на оружие, психологические тесты и тесты для проведения профессионального отбора (профотбора) поступающих на службу в силовые структуры - такие как вооруженные силы РФ, в том числе в военные училища (проводят военкоматы), органы внутренних дел (полицию), в том числе институты МВД РФ, министерство по чрезвычайным ситуациям (МЧС).

Тесты онлайн разработаны специально для повышения своего уровня знаний, и подходят для людей различных профессий, а также учащихся различных учебных заведений, как средних так и высших. Многие учащиеся школ, СПТУ, колледжей, институтов, академий воспользовались нашими тестами онлайн, для подготовки к успешной сдачи экзаменов. Грамотно и удобно разработанный интерфейс тестов позволяет отлично подготовится и успешно сдать экзамены.

Специфические бактериофаги являются очень точными индикаторами, определяющими видовую и типовую принадлежность бактерий. Поэтому они нашли широкое применение для идентификации бактерий.

В настоящее время наиболее полно и тщательно разработаны методы фагодиагностики стафилококков и бактерий брюшного тифа и паратифов. По отношению к микробам тифо-паратифозной группы найдены фаги, с помощью которых можно с большой точностью определять виды бактерий и четко разграничивать определенное количество типов в пределах этих видов.

Техника фаготипирования микробов по модифицированному методу Креджи и Иенсена.

В основу фаготипирования положен принцип совместного выращивания типируемой культуры с типовым бактериофагом. Наступление лизиса является индикаторным признаком, определяющим типовую принадлежность бактерий.

Для фаготипирования бактерий рекомендуется применять 1,5% мясо-пептонный агар с 5% глицерина.

Суточную агаровую культуру исследуемого штамма отсевают на бульон и помещают в термостат при 37 °С. С появлением заметного роста культуру набирают в пастеровскую пипетку с тонко оттянутым капилляром и наносят небольшими каплями на поверхность хорошо подсушенной питательной среды. Расположение капель на поверхности агара можно наметить заранее. Количество капель должно соответствовать числу типовых фагов плюс 1 капля для контроля роста культуры. Каплям культуры дают возможность впитаться, для чего требуется 3-10 мин. Затем на поверхность каждой капли наносят эксцентрично по 1 капле типового фага с таким расчетом, чтобы часть культуры оставалась свободной от воздействия бактериофага. Сектор, оставшийся свободным от воздействия бактериофага, является контролем роста культуры. При постановке опыта для каждого типа бактериофага берут отдельную пипетку. Типовой бактериофаг применяют в критическом тест - разведении, т. е. в наибольшем разведении, при котором исследуемый бактериофаг вызывает на плотной питательной среде явный лизис культуры гомологического фаготипа и не лизирует культуры других гетерологических типов. После того как бактериофаг впитается в питательную среду, чашки с посевом помещают в термостат при 37 °С. Через 6—8 ч производят учет результатов фаготипирования. Непрерывное б-часовое инкубирование чашек в термостате можно заменить 2-часовой инкубацией, после которой чашки переносят в холодильник, а на следующий день их снова на 3—4 ч помещают в термостат и затем учитывают результаты.

Наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с одним из типовых фагов указывает на принадлежность культуры к данному фаготипу. Появление выраженных признаков лизиса одновременно в нескольких каплях указывает на то, что степень разведения типовых фагов, взятых в опыт, недостаточна. В этих случаях опыт следует повторить с большими разведениями бактериофагов.

Учет фаготипирования производят как в проходящем, так и в падающем свете. Интенсивность лизиса отмечают с помощью четырехкрестной системы.

Практическое применение фагов.

Бактериофаги широко используют в микробиологических лабораториях (в лабораторной диагностике инфекций), а также в клинике для лечения и профилактики инфекционных заболеваний.

1. Фагоиндикация – метод определения видовой принадлежности микроорганизмов, выделенных в чистой культуре, по типу лизирующего фага. По содержанию бактериофагов в объектах окружающей среды (например, в воде) можно судить о присутствии в них соответствующих патогенных бактерий. Подобные исследования проводят при эпидемиологическом анализе вспышек инфекционных болезней.

3. Фаготерапия – применение бактериофагов для лечения инфекционных заболеваний. Чаще всего используются брюшнотифозный, сальмонеллезный, дизентерийный, синегнойный, стафилококковый, стрептококковый фаги и комбинированные препараты (колипротейный, пиобактериофаги и др). Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парентерально или местно в виде жидких, таблетированных форм, свечей или аэрозолей.

4. Фагопрофилактика - применение бактериофагов с целью профилактики инфекционных заболеваний у людей, бывших в контакте с больным, но статус которых еще не известен (характерные симптомы еще не проявляются).

5. Бактериофаги широко применяют в генной инженерии и биотехнологии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК.

Читайте также: