Посев культуры на среду с фенилаланином производят дозой

Обновлено: 07.07.2024

Методы выявления бактерий рода Proteus основаны на посеве исходного разведения анализируемой пробы продукта или другого эквивалентного разведения в питательные среды, культивировании посевов при (37 ± 1) °С в течение 24-48 ч, выделении типичных и (или) предполагаемых колоний, подтверждении их принадлежности по культуральным, морфологическим

признакам и биохимическим свойствам к бактериям рода Proteus.

Проведение исследований

Методы выявления бактерий рода Proteus

· Выявление Н-форм бактерий рода Proteus

С помощью стерильной пипетки 0,5 см 3 исходного разведения анализируемой пробы продукта или другого эквивалентного разведения вносят в конденсационную воду пробирок со свежескошенным питательным

агаром, не касаясь поверхности среды. Пробирки с посевами, вертикально поставленные в штатив, инкубируют при температуре (37 ± 1) °С. Предварительный учет результатов проводят через (24 ± 2) ч, окончательный - через (48 ± 2) ч и нкубирования. После инкубирования пробирки с посевами просматривают. Н-формы бактерий рода Proteus из конденсационной жидкости растут вверх по поверхности среды с образованием ползучего вуалеобразного налета с голубым оттенком.

· Выявление О-форм бактерий рода Proteus

С помощью стерильной пипетки по 0,2 см 3 исходного разведения анализируемой пробы продукта или другого эквивалентного разведения наносят на поверхность среды Плоскирева в чашках Петри и растирают по поверхности среды шпателем — изогнутой стеклянной палочкой. Чашку закрывают крышкой и оставляют на 15 мин при комнатной температуре для адсорбирования посевного материала. Инкубируют чашки с посевами дном вверх при температуре (37 ± 1) °С.

Предварительный учет результатов проводят через (24 ± 2) ч, окончательный - через (48 ± 2) ч инкубирования. После инкубирования чашки Петри с посевами просматривают и отмечают на обратной стороне дна чашки Петри типичные и (или) предполагаемые колонии. О-формы бактерий рода Proteus растут в виде прозрачных колоний с характерным запахом, слегка подщелачивающих среду, с окрашиванием ее в желтый цвет.

Подтверждение принадлежности выявленных микроорганизмов к бактериям рода Proteus

Выявленные микроорганизмы с характерными культуральными свойствами исследуют на подтверждение принадлежности к бактериям рода Proteus.

Подтверждение принадлежности выросших микроорганизмов к бактериям рода Proteus определяют по отношению к окраске по Граму, способности ферментировать глюкозу, образовывать сероводород, дезаминировать фенилаланин.

Окраска по Граму и микроскопирование

Из выявленных культур готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При микроскопировании бактерий рода Proteus - полиморфные грамотрицательные палочки, подвижные (перетрихи), не образующие спор и капсул.

Приготовление чистой культуры

Пересевы производят для получения чистых культур и использования их для биохимических исследований. Из каждой отобранной типичной или предполагаемой колонии (не менее пяти колоний) проводят пересев на поверхность скошенного мясо-пептонного агара или в мясо-пептонный бульон. Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 2) ч.

Готовят мазки, окрашивают их по Граму, микроскопируют. По мазкам, окрашенным по Граму, проверяют чистоту выделенной культуры.

Определение ферментации глюкозы и образования сероводорода

Для определения ферментации глюкозы и образования сероводорода чистую культуру высевают в пробирки уколом в столбик и штрихом по поверхности скошенного трехсахарного агара или питательного агара с глюкозой.

Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С. Предварительный учет результатов проводят через (24 ± 2) ч, окончательный - через (48 ± 2) ч.

Бактерии рода Proteus ферментируют глюкозу с образованием кислоты и газа, при этом скошенная поверхность среды окрашивается в ярко-красный цвет, а в столбике появляется газ. Бактерии рода Proteus образуют сероводород, при этом столбик среды чернеет.

Определение дезаминирования фенилаланина

Для определения дезаминирования фенилаланина суточную чистую культуру высевают в пробирку со скошенной средой для расцепления фенилаланина. Посев делают штрихами на поверхность скошенной среды. Инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (48 ± 2) ч.

Затем на поверхность агара с выросшей культурой наносят три-пять капель раствора железа треххлорного 6-водного с массовой долей 8,0 %.

Появление интенсивной зеленой окраски среды свидетельствует о дезаминировании фенилаланина - положительная реакция. При отрицательной реакции цвет среды не меняется.

Бактерии рода Proteus дезаминируют фенилаланин.

Обработка результатов

При выявлении полиморфных грамотрицательных палочек, не образующих спор и капсул, ферментирующих глюкозу до кислоты и газа, образующих сероводород, дезаминирующих фенилаланин, дают заключение о присутствии в анализируемой пробе продукта бактерий рода Proteus.

Питательная среда для энтеробактерий, соответствует прописи Ewing и др.

Описание

Данная среда соответствует твердой форме, предложенной Эвингом и его коллегами, которая является модификацией среды, разработанной Buttiaux и др.; при положительной реакции цвет данной среды продолжительно меняется на зеленый.

Способность к окислительному деаминированию фенилаланина, превращая его в фенил-пировиноградную кислоту, является одним из свойств Proteus spp, что отличает их от других энтеробактерий. Наличие фенил-пировиноградной кислоты можно определить по характерному зеленоватому цвету среды, в которой происходит ее реакция с железом. В настоящее время, данный тест, и тест на образование уреазы имеют большое значение в таксономии Proteus spp.

Приготовление

Развести 26 г порошка в 1 л дистиллированной воды и довести до кипения. Разлить в соответствующие флаконы или пробиркии стерилизовать автоклавированием 15 минут при температуре 121ºС

Техника посева

Скошенный агар инокулируют достаточным количеством посевного материала и инкубируют в течение 12-16 часов при 35 ±2°С. Добавляют 0,2 мл 10% раствора хлорида железа таким образом, чтобы он полностью покрыл зону роста. О наличии фенил-пировиноградной кислоты (при положительном результате) свидетельствует развитие характерной сине-зеленой окраски поверхности спустя приблизительно 1 минуту.

Хранение

Среда предназначена только для лабораторного использования. Храните среду в банке с плотно закрытой крышкой, в темном, сухом, прохладном месте (при температуре от +4°C до 30°C и влажности Контроль качества

Температура инкубации: 35°C ± 2,0

Инокуляция: чистая культура, нанесенная на поверхность среды штриховым посевом.

Фенилаланин-агар в виде сухого порошка для приготовления плотной питательной среды, предназначенной для дифференциации энтеробактерий по способности к дезаминированию фенилаланина, при проведении микробиологических исследований. Применяется исключительно для научных работ и для внутризаводского контроля

Функциональное назначение

Дифференциальная среда для инкубирования посевов. Нанесение 2-3 капель 10% водного раствора треххлористого железа на культуру микроорганизма, дезаминирующего фенилаланин, изменяет цвет среды с желтого на зеленый; культура микроорганизма, не дезаминирующего фенилаланин, при этом не изменяет цвет среды

Аналогичный агар M281 имеет регистрационное удостоверение изделия медицинского назначения

Технические характеристики

Кроме декарбоксилаз в ферментативном расщеплении аминокислот могут принимать участие ферменты дезаминазы, катализирующие удаление аминогруппы (NH₂) из молекулы органического азотистого соединения.

Существуют 4 вида дезаминирования аминокислот, в основе которых лежат восстановительные реакции, гидролиз, внутримолекулярные структурные перестройки и окисление. Каждая из этих реакций протекает с участием соответствующей группы специфических ферментов. Однако, независимо от того, каким путем идет процесс дезаминирования, в конечном итоге NH₂ аминокислоты всегда освобождается в виде NH₃.

У микроорганизмов преобладающим является процесс окислительного дезаминирования, например:

Тест на дезаминирование фенилаланина применяют в дифференциальной диагностике энтеробактерий. Среди членов семейства Enterobacteriaceae только у Morganella spp., Proteus spp., Enterobacter agglomerans, Enterobacter sakazakii, Rahnella aquatilis и Tatumella ptyseos от 20 до 50% исследованных штаммов, принадлежащих к различным видам, способны дезаминировать фенилаланин. Среди грамотрицательных неферментирующих бактерий этим признаком обладает еще меньшее количество штаммов.

Тест основан на том, что микроорганизмы, вырабатывающие специфическую дезаминазу в отношении фенилаланина, при росте на питательных средах, содержащих L-фенилаланин, подвергают его окислительному дезаминированию. Конечными продуктами реакции являются циклические соединения фенилпировиноградной кислоты — фенилпируват и аммиак. Появление в среде фенилпирувата является прямым показателем дезаминирования фенилаланина. Для обнаружения его применяют качественную реакцию с хлоридом железа (III) (FeCl₃). Фенилпируват, вступая в реакцию соединения с добавленным в среду хлоридом железа, образует фенилпируват железа, окрашивая среду в интенсивно зеленый цвет.

Положительный результат теста: через несколько минут после добавления раствора хлорида железа содержимое пробирки приобретает интенсивный зеленый цвет.

Отрицательный результат теста: цвет среды при добавлении раствора хлорида железа остается без изменений.

Некоторые виды микроорганизмов способны дезаминировать фенилаланин в первые же часы роста. Поэтому наряду с общепризнанной постановкой теста рекомендуется экспресс-метод.

Экспресс-метод определения дезаминирования фенилаланина. Готовят густую суспензию исследуемой культуры (примерно N2 по стандарту мутности Мак-Фарланда) в 0,5 мл забуференного раствора фенилаланина. Приготовленную взвесь инкубируют в термостате при 37 °С в течение 4 ч. По прошествии указанного времени к бактериальной взвеси добавляют 0,1 мл реактива хлорида железа (III) (FeCl₃), и через 30 с после этого учитывают результаты реакции.

Положительный результат реакции проявляется окрашиванием взвеси в светло-зеленый цвет.

Читайте также: