Посев пищевых продуктов на бгкп
Обновлено: 28.09.2024
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, кроме молока и молочных продуктов, и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта колиформных бактерий и три метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и методы посева в или на агаризованные селективно-диагностические среды.
Метод определения НВЧ колиформных бактерий предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 150 или в 1 жидкого продукта менее 15 клеток колиформных бактерий.
Метод определения количества колиформных бактерий посевом в агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 150 или в 1 жидкого продукта более 15 колониеобразующих единиц (КОЕ) колиформных бактерий.
Метод определения количества колиформных бактерий посевом на агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 1500 или в 1 жидкого продукта более 150 КОЕ колиформных бактерий.
Допускается использование хромогенных сред для предварительного выявления количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий) в масложировой продукции.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия
ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе
ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов
ГОСТ 29184-91 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 колиформные бактерии: Бактерии, которые при температуре 37°С ферментируют лактозу с образованием газа по методам, приведенным в настоящем стандарте.
3.2 выявление колиформных бактерий: Определение присутствия или отсутствия колиформных бактерий в определенной массе или объеме продукта в соответствии с настоящим стандартом.
3.3 определение количества колиформных бактерий:
3.3.1 Количество бактерий, содержащееся в 1 или 1 грамме продукта, определенное путем по сева продукта и (или) его разведений в или на агаризованную селективно-диагностическую среду, под счете после инкубирования при температуре 37°С типичных и атипичных колоний и определении возможности бактерий из этих колоний ферментировать лактозу с образованием газа по методам, приведенным в настоящем стандарте.
При необходимости, подтверждают по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.
3.3.2 Количество бактерий, содержащееся в 1 или 1 грамме продукта, определенное по методу НВЧ, указанному в настоящем стандарте.
4 Метод выявления колиформных бактерий и определения количества по методу НВЧ
Методы выявления и определения НВЧ колиформных бактерий основаны на высеве определенного количества продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду с лактозой, инкубировании посевов, учете положительных пробирок, пересеве культуральной жидкости в жидкую селективную среду для учета газообразования или пересева, при необходимости, культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды для подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.
4.1 Метод выявления колиформных бактерий.
4.1.1 Пробирку с селективной обогатительной средой инокулируют продуктом или разведением навески продукта и инкубируют при температуре 37°С 24 или 48 ч.
4.1.2 Пробирку с подтверждающей средой инокулируют из пробирки, полученной по 4.1.1, где отмечено образование газа и/или помутнение и инкубируют при температуре 37°С 24 или 48 ч.
4.1.3 Присутствие колиформных бактерий считается подтвержденным, в случае если отмечено помутнение и образование газа после осмотра пробирки, полученной по 4.1.2.
4.2 Метод НВЧ - определение количества колиформных бактерий.
4.2.1 Три пробирки с жидкой обогатительной средой двойной концентрации инокулируют определенным количеством продукта, если исходный продукт жидкий, или определенным количеством исходной суспензии в случае другого продукта.
4.2.2 Три пробирки с жидкой обогатительной средой нормальной концентрации инокулируют определенным количеством продукта и/или разведением продукта, если исходный продукт жидкий, или определенным количеством исходной суспензии и/или разведением в случае другого продукта.
4.2.3 Посевы в пробирках, содержащие обогатительную среду двойной концентрации, инкубируют при температуре 37°С 24 ч. Посевы в пробирках со средой нормальной концентрации, инкубируют 24 или 48 ч, после этого в этих пробирках отмечают наличие газа и/или помутнения, мешающего выявлению образования газа.
4.2.4 Пробирки с подтверждающей средой инокулируют культурами из пробирок с обогатительной селективной средой двойной концентрации и культурами из пробирок с обогатительной селективной средой нормальной концентрации, в которых отмечено образование газа и/или помутнение.
Посевы в пробирках с подтверждающей средой инкубируют при температуре 37°С 24 или 48 ч, после этого в пробирках отмечают образование газа.
4.2.5 Наиболее вероятное число колиформных бактерий в 1 или 1 г пробы продукта (НВЧ) рассчитывают, исходя из числа пробирок с подтверждающей средой (4.2.4), показавших образование газа. Для определения наиболее вероятного числа пользуются таблицей ГОСТ 26670.
5 Методы определения количества колиформных бактерий - подсчет колоний
Методы определения количества колиформных бактерий посевом в или на агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве определенного количества продукта и/или его разведений в или на агаризованную селективно-диагностическую среду с лактозой, инкубировании посевов, подсчете типичных и атипичных колоний, пересеве типичных колоний и атипичных колоний в жидкую селективную среду с лактозой для определения газообразования, подтверждения, при необходимости, по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.
5.1 Метод посева в агаризованную селективно-диагностическую среду.
5.1.1 Для определения количества колиформных бактерий по 1 продукта, если продукт жидкий, или по 1 исходного разведения в случае другого продукта вносят в две стерильные чашки Петри.
Другую пару чашек используют для других количеств - исходной суспензии и/или десятикратных разведений продукта.
Чашки с внесенным в них продуктом или его разведением заливают агаризованной питательной средой.
Посевы в чашках инкубируют при температуре 37°С в течение 24 ч.
5.1.2 Типичные и атипичные колонии подсчитывают и определяют у бактерий из типичных и атипичных колоний возможность ферментации лактозы.
5.1.3 Число колоний на 1 или на 1 г продукта рассчитывают по ГОСТ 26670, исходя из числа подтвержденных типичных и атипичных колоний, выросших на чашках.
5.2 Метод посева на агаризованную селективно-диагностическую среду
5.2.1 На подсушенную поверхность агаризованной селективно-диагностической среды в двух чашках Петри наносят 0,1-0,2 продукта, если продукт жидкий, или исходной суспензии в случае другого продукта.
Другую пару чашек используют для других количеств - исходной суспензии или десятикратных разведений продукта.
Внесенный в чашки продукт или его разведения распределяют по поверхности агаризованной питательной среды стерильным шпателем.
Посевы в чашках инкубируют при температуре 37°С в течение 24 ч.
5.2.2 Типичные и атипичные колонии подсчитывают и определяют у бактерий из этих колоний возможность ферментации лактозы.
5.2.3 Число колоний на 1 или на 1 г продукта посчитывают по ГОСТ 26670, исходя из числа подтвержденных типичных и атипичных колоний, выросших на чашках.
6 Питательные среды и реактивы
Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред и реактивов, должны быть аналитического качества.
6.1 Селективная обогатительная среда (лаурил сульфат триптозный бульон)
6.1.1 Состав среды приведен в таблице 1.
а) Среда двойной концентрации
б) Среда нормальной концентрации
Ферментативный перевар молока и животных протеинов, г
Двузамещенный фосфорнокислый калий , г
Однозамещенный фосфорнокислый калий , г
Натрий хлористый, г
Натрий лаурил сульфат, г
При нагревании растворяют компоненты или дегидратированную готовую среду в воде. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°С.
Разливают среду по 10 в пробирки размером приблизительно 16 х 160 мм, содержащие пробирки Дархама (поплавки), в случае использования среды нормальной концентрации, и в пробирки размером приблизительно 20 х 200 мм, не содержащие пробирки Дархама (поплавки), в случае использования среды двойной концентрации.
Стерилизуют среду в автоклаве при температуре °С в течение 15 мин. Пробирки Дархама (поплавки) после стерилизации не должны содержать пузырьков воздуха.
6.2 Бриллиантовый зеленый лактозный желчный бульон.
ферментативный перевар казеина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 г;
лактоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 г;
желчь . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 г;
бриллиантовый зеленый . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,0133 г
(или 2,66 раствора, приготовленного
по 6.2.3, в случае приготовления среды
из отдельных компонентов);
При нагревании растворяют компоненты или дегидратированную готовую среду в воде. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°С. Разливают и стерилизуют среду по 6.1.2.
6.2.3 Раствор бриллиантового зеленого.
бриллиантовый зеленый . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 г;
Бриллиантовый зеленый переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 и доводят водой до метки.
Кишечные палочки (Бактерии группы кишечных палочек) В 1885 г. Эшерих открыл микроорганизм, который получил название Escherichia coli (кишечная палочка). Этот микроорганизм является постоянным обитателем толстого отдела кишечника человека и животных. Кроме Е. coli, в группу кишечных бактерий входят эпифитные и фитопатогенные виды, а также виды, этиология (происхождение) которых пока не установлена. К бактериям группы кишечных палочек относят роды Escherichia (типичный представитель Е. coli), Citrobacter (типичный представитель Citr. coli citrovorum), Enterobacter (типичный представитель Ent. aerogenes), которые объединены в одно семейство Enterobacteriaceae благодаря общности морфологических и культуральных свойств. Они характеризуются различными ферментативными свойствами и антигенной структурой.
Бактерии группы кишечных палочек — это короткие (длина 1-3 мкм, ширина 0,5-0,8 мкм) полиморфные подвижные и неподвижные грамотрицательные палочки, не образующие спор.
Культуральные свойства
Бактерии хорошо растут на простых питательных средах: мясопептонном бульоне (МПБ), мясопептонном агаре (МПА). На МПБ дают обильный рост при значительном помутнении среды; осадок небольшой, сероватого цвета, легкоразбивающийся.Образуют пристеночное кольцо, пленка на поверхности бульона обычно отсутствует. На МПА колонии прозрачные с серовато-голубым отливом, легко сливающиеся между собой. На среде Эндо образуют плоские красные колонии средней величины. Красные колонии могут быть с темным металлическим блеском (Е. coli) или без блеска (E.aerogenes). Для лактозоотрицательных вариантов кишечной палочки (B.paracoli) характерны бесцветные колонии. Им свойственна широкая приспособительная изменчивость, в результате которой возникают разнообразные варианты, что усложняет их классификацию.
Биохимические свойства
Большинство бактерий группы кишечных палочек (БГКП) не разжижают желатина, свертывают молоко, расщепляют пептоны с образованием аминов, аммиака, сероводорода, обладают высокой ферментативной активностью в отношении лактозы, глюкозы и других сахаров, а также спиртов. Не обладают оксидазной активностью. По способности расщеплять лактозу при температуре 37°С БГКП делят на лактозоотрицателъные и лактозоположительные кишечные палочки (ЛКП), или колиформные, которые формируются по международным стандартам. Из группы ЛКП выделяются фекальные кишечные палочки (ФКП), способные ферментировать лактозу при температуре 44,5°С. К ним относится Е. coli, не растущая на цитратной среде.
Устойчивость
Бактерии группы кишечных палочек обезвреживаются обычными методами пастеризации (65 — 75° С). При 60° С кишечная палочка погибает через 15 минут. 1% раствор фенола вызывает гибель микроба через 5-15 минут, сулема в разведении 1:1000 — через 2 мин., устойчивы к действию многих анилиновых красителей.
Санитарно-показательное значение
Санитарно-показательное значение отдельных родов бактерий группы кишечных палочек неодинаково. Обнаружение бактерий рода Escherichia в пищевых продуктах, воде, почве, на оборудовании свидетельствует о свежем фекальном загрязнении, что имеет большое санитарное и эпидемиологическое значение. Считают, что бактерии родов Citrobacter и Enterobacter являются показателями более давнего (несколько недель) фекального загрязнения и поэтому они имеют меньшее санитарно-показательное значение по сравнению с бактериями рода Escherichia. При длительном применении антибиотиков в кишечнике человека также обнаруживают различные варианты кишечной палочки. Особый интерес представляют лактозоотрицателъные варианты кишечной палочки. Это измененные эшерихии, утратившие способность сбраживать лактозу. Они выделяются при кишечных инфекциях человека (брюшном тифе, дизентерии и др.) в период выздоровления. Наибольшее санитарно-показательное значение имеют кишечные палочки, не растущие на среде Козера (цитратная среда) и ферментирующие углеводы при 43-45°С (E. coli).Они являются показателем свежего фекального загрязнения. В связи с неодинаковым санитарно-показательным значением отдельных родов бактерий группы кишечных палочек их дифференцируют на основании следующих признаков, образующих комплекс ТИМАЦ.
Санитарно-бактериологическое исследование смывов — Ф. К. Черкес
Для оценки санитарно-гигиенического состояния предприятий общественного питания, предприятий пищевой промышленности, лечебно-профилактических и детских учреждений проводят исследование смывов с рук персонала и предметов окружающей обстановки.
В зависимости от цели исследования определяют:
2. Наличие S. aureus.
3. Общее количество бактерий.
Исследования на патогенную микрофлору проводят только по эпидпоказаниям.
На предприятиях общественного питания и в детских учреждениях исследования обычно ограничивают выявлением БГКП (как показатель фекального загрязнения) и S. aureus.
В отделениях хирургического профиля (операционных, отделениях реанимации, интенсивной терапии и т. д.), кроме вышеуказанных показателей, определяют количественную обсемененность микроорганизмами, наличие синегнойной палочки и протея.
Отбор проб. Взятие проб осуществляют методом смывов. Используют ватные тампоны (палочка с намотанной на нее ватой вставлена в пробирку) или салфетки 5×5 см, которые захватывают стерильным пинцетом. Тампоны и салфетки увлажняют, помещая их в пробирки с 2 мл изотонического раствора натрия хлорида.
Примечание. Марлевые салфетки, предварительно завернутые по одной в бумажные пакетики, и ватные тампоны, помещенные в пробирки, стерилизуют в стерилизационном шкафу 1 ч при 160° С.
Смывы с рук делают в следующей последовательности: начинают с левой руки, с участков меньшей загрязненности — протирают тыльную сторону руки от кисти к пальцам, затем ладонную сторону, между пальцами и под ногтевым ложем. Этим же тампоном в такой же последовательности производят смывы с правой руки.
Смывы с предметов обихода при контроле больших поверхностей делают из нескольких мест. Исследуемые участки ограничивают рамкой трафарета площадью 50×50 или 100×100 см2. Трафарет изготовляют из проволоки и перед употреблением прожигают над пламенем горелки.
Примечание. Смывы, как правило, берут с чистых, подготовленных к работе предметов, а с бывших в употреблении — только по эпидпоказаниям.
Исследование на БГКП
Первый день исследования
Взятые смывы засевают на среду Кода. При росте кишечной палочки среда изменяет цвет. При изменении цвета среды исследуемый материал пересевают на среду Эндо.
Второй день исследования
Изучают колонии на среде Эндо. Из подозрительных колоний делают мазки и микроскопируют. Дальше исследование ведут по обычной схеме.
Выявление S. aureus
Полученные смывы засевают на желточно-солевой агар в чашке Петри и параллельно на 6,5% солевой бульон (среда накопления). На желточно-солевой агар можно сделать посев тампоном. Бульон предварительно разливают в пробирки по 5 мл и в каждую засевают 0,2-0,3 мл смыва. Посевы инкубируют при 37° С в течение 24 ч. Дальше исследование ведут по общепринятой методике.
Определение общего числа бактерий
Первый день исследования
К 2 мл взятых смывов прибавляют 8 мл изотонического раствора натрия хлорида. Получается разведение 1:5. Тампоны тщательно отмывают встряхиванием. 1 мл засевают в чашку Петри и заливают 12 мл расплавленного и остуженного до 45° С агара. Чашки инкубируют в термостате при 37° С 24 ч.
Второй день исследования
Посевы вынимают из термостата, подсчитывают количество выросших колоний и делают пересчет на 1 см2 исследуемой поверхности.
Выявление синегнойной палочки (см. главу 24).
Выявление протея (см. главу 32).
Внимание! Выявление в смывах патогенной флоры производят только по эпидпоказаниям
Контрольные вопросы
1. С какой целью проводят исследование смывов с рук и предметов обихода?
2. Какие основные исследования проводят?
3. Как определяют общее количество бактерий?
4. На какую среду засевают смывы для:
а) выделения БГКП?
б) выделения S. aureus?
Задания
1. Приготовьте тампоны.
2. Сделайте смывы с рук друг у друга и посейте на среду Эндо (смывы произвести до мытья рук и после мытья).
3. На второй день учтите результаты посевов.
Можно ли брать смывы с влажного металлического оборудования, например с дуршлага?
Прямого указания на состояние тарелок, кастрюль и прочей утвари в документе нет, но мы знаем цель исследования: проверить, насколько эффективно проводится санитарная обработка посуды. Вспоминаем, что по правилам она предполагает несколько этапов:
- механическую очистку от остатков пищи,
- мытье горячей водой с применением разрешенных моющих средств,
- ополаскивание под проточной горячей водой,
- просушивание инвентаря в специальных местах и условиях,
- хранение в отведенных местах.
Получается, что взять смыв с влажного дуршлага нельзя, ведь его санитарная обработка еще не доведена до конца.
Работники лаборатории должны взять посуду для проверки с места ее хранения после сушки.
Микробиологическое исследование пищевых продуктов проводят с целью выявления КМАФАнМ путем высева на чашки Петри с питательной средой (мясопептонным агаром) или отдельных групп микроорганизмов путем высева на элективные питательные среды. Количество микроорганизмов определяют в 1 см 3 продукта жидкой консистенции или в 1 г продукта плотной консистенции.
Отбор средней пробы. При анализе партии продукта готовят среднюю пробу. Для разных пищевых продуктов установлены нормы отбираемых средних проб и правила их отбора. Однако во всех случаях необходимо соблюдать условия, исключающие контаминацию исследуемого продукта посторонними микроорганизмами.
При исследовании жидкие и полужидкие продукты (молоко, сметана, соусы и др.) тщательно перемешивают и затем отбирают в стерильную посуду простерилизованным черпаком емкостью 50-100 см3. Пробы плотных продуктов (мясо, колбаса, рыба, кулинарные изделия и др.) отбирают из толщи продукта в разных местах. Предварительно поверхность исследуемых участков прижигают раскаленным ножом и по ней делают глубокий разрез стерильным скальпелем. Края разреза раздвигают стерильным пинцетом и вырезают стерильными ножницами небольшие кусочки продукта. Отобранные таким образом из разных мест образцы измельчают, собирают в стерильную тару и составляют из них среднюю пробу.
При оборе средней пробы таких продуктов, как сливочное масло, творог, сыр используют стерильный щуп, который вводят в продукт с одного края и доводят до противоположного вглубь и наискосок. Затем стерильным скальпелем из нескольких мест отобранной пробы берут кусочки, измельчают их и помещают в стерильную посуду.
Подготовка пробы к анализу. При исследовании плотных продуктов из средней пробы берут навеску массой от 1 до 10 г, переносят ее в стерильную ступку и тщательно растирают. Если продукт очень плотный, то его растирают в ступке с предварительно прогретым кварцевым песком. Растертый продукт вносят в колбу, содержащую от 90 до 99 см 3 стерильного физиологического раствора (0,5 %-й раствор хлорида натрия). Содержимое колбы осторожно взбалтывают в течение 5 мин. В колбе получается первое разведение продукта (1:10), из которого готовят последующие разведения.
Навеску сливочного масла расплавляют на водяной бане при температуре не выше 45 °С, после чего в 9 см 3 физиологического раствора вносят стерильной пипеткой 1 см 3 продукта, получая разведение 1:10.
Для исследования жидких и полужидких продуктов из полученной средней пробы после тщательного перемешивания отбирают стерильной пипеткой 1 см 3 продукта и вносят его в пробирку, содержащую 9 см 3 стерильного физиологического раствора.
Приготовление разведений. Пищевые продукты могут содержать значительное количество микроорганизмов, поэтому, чтобы получить изолированные колонии, необходимо приготовить десятикратные разведения продукта.
Полученное 1-е разведение продукта тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в нее и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3-5 раз, затем той же пипеткой отбирают 1 см 3 суспензии и переносят её во 2-ю пробирку с 9 см 3 стерильного физиологического раствора. Получают 2-е разведение (1:100). Пипетку нельзя погружать в жидкость во избежание смывания микроорганизмов с ее наружной поверхности. Новой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое 2-го разведения, набирают из него 1 см 3 и переносят в следующую пробирку с 9 см 3 стерильной воды, получая третье разведение (1:1000). Таким же образом готовят последующие разведения до получения необходимого результата.
Внимание! Для приготовления каждого разведения следует использовать отдельную стерильную пипетку. Пренебрежение этим правилом может привести к получению ошибочного результата.
Посев в чашки Петри. Для определения КМАФАнМ используют метод глубинного посева на плотные питательные среды. Схема посева приведена на рис. 15.1. На крышках чашек стеклографом отмечают исследуемый вариант и разведение. Каждое разведение высевают не менее чем в 2-3 параллельные чашки. Разведения выбирают с таким расчетом, чтобы на чашке выросло от 30 до 300 колоний. Стерильной пипеткой отбирают из пробирки по 1 см 3 соответствующего разведения суспензии и переносят его в 2-3 пустые стерильные чашки Петри. После внесения разведения суспензии чашки заливают питательной средой не позднее чем через 15 мин. Для этого над пламенем спиртовки вынимают пробку из пробирки или колбы с расплавленной и остуженной до 45-50 °С питательной средой и обжигают края. Затем приоткрывают крышку чашки так, чтобы только вошло горлышко колбы, и осторожно вливают 10-15 см 3 питательного агара, толщина слоя которого должна быть около 5 мм. Чашку закрывают крышкой и сразу же легкими вращательными движениями перемешивают питательную среду с посевным материалом, после чего оставляют на 10-15 мин в горизонтальном положении для застывания среды. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и помещают на 24-48 ч в термостат с температурой 37±1 °С.
Рис. 15.1. Схема посева продукта для определения КМАФАнМ
Подсчет выросших колоний. После инкубации отбирают чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний, подсчитывают их визуально или с помощью специального прибора для подсчета колоний. При подсчете колоний чашки просматривают в проходящем свете и отмечают подсчитанные колонии чернилами или тушью. В случае, если на чашке с максимальным разведением выросло более 300 колоний, можно вести их подсчет при помощи лупы и сетки из оргстекла со стороной квадрата 1 см при боковом освещении. Подсчет колоний проводят не менее чем в 20 квадратах, определяют среднее их число на 1 см 2 и умножают на площадь поверхности среды в чашке.
Количество микроорганизмов в 1 см (или в 1 г) продукта (КМАФАнМ) определяют, как произведение количества выросших колоний (N) на показатель разведения (n):
КМАФАнМ = N •10 n КОЕ/см 3 .
Примечание. Анаэробные микроорганизмы не определяются чашечным методом, так как для их выращивания необходимо создать анаэробные условия. Культивирование анаэробов осуществляют в анаэростатах (см. рис. 4.1) или используют питательные среды с редуцирующими веществами.
15.2. Определение бактерий группы кишечных палочек (БГКП) в пищевых продуктах
Определение БГКП в пищевых продуктах проводят в соответствии с ГОСТ Р 50474-93. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечной палочки (колиформных бактерий).
Метод определения БГКП основан на обнаружении образования газа и кислоты при высеве определенного количества продукта (или смыва с его поверхности) в жидкие питательные среды, содержащие лактозу (среда Кесслера) с последующим подтверждением принадлежности выросших микроорганизмов к группе кишечных палочек по морфологическим и культуральным признакам.
Исследование на наличие БГКП проводят в несколько этапов:
I этап - приготовление разведений продукта. Если продукт плотный (колбаса, сыр, масло, творог и др.), то результат выражают в отсутствии БГКП в определенной его массе (г). Если продукт жидкий (молоко, кисломолочные напитки, сок и т. д.), то БГКП должны отсутствовать в определенном его объеме (см 3 или дм 3 ).
II этап - посев определенного количества продукта или его разведений в среду Кесслера. Среду Кесслера разливают в пробирки или колбы, в которые помещают поплавок (стеклянная трубочка
с одним запаянным концом). После стерилизации поплавок должен быть заполнен средой.
В пробирки со средой Кесслера вносят по 1 см 3 соответствующего разведения продукта (10 -1 ;10 -2 ;10 -3 )и ставят в термостат при температуре (37±1) °С. Через 24 ч инкубации посевы просматривают и отмечают образование газа в поплавке и изменение цвета среды из фиолетового в желто-зеленый. Записывают, в каких разведениях произошло газообразование.
После инкубации чашки просматривают. Бактерии группы кишечной палочки образуют на среде Эндо красные или розовые блестящие колонии с металлическим блеском или без него. Такой характер роста на среде Эндо эти бактерии дают за счет сбраживания лактозы и образования кислоты, вызывающей восстановление индикатора фуксина, окрашивающего колонии в красный цвет.
Из типичных колоний на среде Эндо готовят препараты, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Если в препарате обнаруживаются мелкие грамотрицательные неспорообразующие палочки, то одновременно ставят оксидазный тест. Заключение о том, что обнаруженные в продукте микроорганизмы относятся к БГКП, делают на основании выявления в посевах грамотрицательных, не образующих спор палочек, сбраживающих лактозу с образованием кислоты и газа при температуре 37±1 °С с отрицательным тестом на оксидазу. При этом указывают массу навески продукта (в г) или его объем (в см 3 ). В случае отсутствия на среде Эндо типичных для БГКП колоний продукт считают не загрязненным кишечными палочками.
15.3. Определение количества дрожжей и плесеней
Для определения количества дрожжей и плесеней в пищевых продуктах делают посев соответствующих разведений в чашки Петри, которые заливают расплавленным и остуженным до температуры 45-50 °С сусло-агаром (СА) или средой Сабуро. Содержимое чашек перемешивают вращательными движениями и оставляют для застывания на 10-15 мин, после чего ставят в термостат с температурой 30±2 °С на 2-3 сут. После инкубации в чашках подсчитывают отдельно количество выросших колоний плесеней и дрожжей. Результат выражают числом КОЕ/ см3 (или г).
Контрольные вопросы
1. Что такое КМАФАнМ?
2. Для чего делают разведения пищевого продукта при определении количества микроорганизмов?
3. Какие питательные среды используют для определения КМАФАнМ, дрожжей и плесеней?
4. Из каких этапов состоит определение БГКП в пищевых продуктах?
5. Какие среды используют для определения БГКП в пищевых продуктах?
6. По каким признакам устанавливают рост БГКП в среде Кесслера?
7. Как выглядят колонии БГКП на среде Эндо?
8. В каком случае дают положительный ответ на присутствие в пищевом продукте БГКП?
Взятие проб. Отбор проб проводят стерильно, стерильными приспособлениями, в стерильную посуду. Пробы помещают в соответствующую тару, пломбируют. Транспортировку осуществляют в сумках-холодильниках в кратчайшие сроки.
Санитарно-микробиологическая оценка пищевых продуктов включает определение общего микробного числа и титра санитарно-показательных микроорганизмов.
Определение общего микробного числа (ОМЧ)
ОМЧ – общее количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г (см 3 ) продукта. Для его определения используют метод кратных разведений.
Метод кратных разведений. При исследовании плотных субстратов навеску измельчают в гомогенизаторе или растирают в ступке с кварцевым песком и готовят исходную взвесь в разведении 1:10. Из полученной взвеси или исходного жидкого материала готовят ряд последующих разведений с таким расчетом, чтобы при посеве двух последних разведений на чашке Петри в агаре выросло от 50 до 300 колоний. Из последних двух разведений по 1 см 3 вносят в чашку и заливают 10-15 мл расплавленного и остуженного до 45 0 С МПА. Чашки инкубируют при 37 0 С 48 ч, подсчитывают количество выросших колоний. ОМЧ определяют с учетом разведения исследуемого материала.
Метод предельных разведений (титр). Из исходного жидкого материала готовят ряд десятикратных разведений до тех пор, пока в последней пробирке можно будет предположить наличие одной бактериальной клетки. Посев делают в жидкую селективную среду с последующим выделением микроорганизмов на твердой питательной среде и изучением их характеристики.
За титр принимают, то наименьшее количество субстрата, в котором обнаружена одна особь искомого микроорганизма.
Определение санитарно-показательных микроорганизмов
Санитарно-показательные микроорганизмы характеризуют продукт с точки зрения эпидемической опасности.
Основными санитарно-показательными микроорганизмами считают БГКП и для количественного учета используют методы определения количества и титра. При этом под количеством понимают определение наиболее вероятного числа (НВЧ) БГКП в единице массы или объема продукта.
Определение НВЧ БГКП.
Для определения НВЧ из жидкого продукта или исходной взвеси плотного, последовательно делают разведения 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , из которых по 1 см 3 засевают в три пробирки со средой Кесслера для каждого разведения. Через 24 ч инкубации при 37 0 С в пробирках регистрируются изменения цвета среды и газообразование. В зависимости от количества проросших пробирок определяют НВЧ колиформных бактерий.
Определение титра БГКП
Титр устанавливают по наименьшему количеству продукта, в котором обнаружены БГКП или по стандартным таблицам.
В оценке пищевых продуктов по микробиологическим показателям необходимо учитывать возможность обнаружения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Продукты питания анализируют на наличие сальмонелл, сульфитредуцирующих клостридий, стафилококков, протея. При более широком исследовании продукты исследуют на грибковую флору.
Для исследования на сальмонеллы из анализируемых продуктов готовят суспензию и засевают на среды накопления (селенитовый, хлористо-магниевый бульоны). После суточной инкубации при 37 0 С производят пересев на среды Эндо, Левина, Плоскирева или висмут-сульфит агар. Далее колонии идентифицируют путем учета характеристики роста на средах Гисса, Ресселя, Олькеницкого и в реакции агглютинации с монорецепторными сыворотками.
Для выявления сульфитредуцирующих клостридий проводится посев исследуемого материала в 2 пробирки со средой Китта-Тароцци, Вильсона-Блер или казеиново-грибную среду. Одну пробирку прогревают при 80 0 С для уничтожения сопутствующей микрофлоры. Инкубируют посевы при 37 0 С 5 сут. При наличии характерного роста достаточно констатировать в мазках специфическую микрофлору и при необходимости провести проверку токсинообразования в биопробе на белых мышах.
Для выявления стафилококков исследуемый материал засевают на желточно-солевой агар. Посевы инкубируют в термостате 24 ч. Подозрительные на стафилококки колонии окрашивают по Граму, делают их пересев на молочный агар и проводят дальнейшую идентификацию выделенной культуры.
Для выявления протея производят посев исследуемого материала на скошенный агар методом Шукевича. После суточной инкубации с верхнего края роста делают мазки и при наличии в них грамотрицательных полиморфных бактерий делают заключение о выделении протея, при необходимости используют биохимическое и антигенное типирование.
Читайте также: