Сахаролитические свойства выявляют при посеве на
Обновлено: 05.10.2024
1. Сахаролитические свойства – это способность микроорганизмов ферментировать определенные углеводы с образованием органических кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газа (СО2 и Н2). Для многих микроорганизмов они служат таксономическим признаком.
2. Для определения сахаролитических свойств используются дифференциально-диагностические среды – жидкие и полужидкие среды Гисса.
В эти среды добавляют углеводы (лактозу, глюкозу, мальтозу и т.д.) и различные индикаторы. В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – регистрируется также появление газообразных продуктов.
3. Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. При сбраживании сахара бактериями цвет среды в присутствии индикатора Андреде (интервал рН 7,2-6,5) изменяется от соломенно-желтого (первоначальный цвет) до ярко-розового (красного). Если кроме кислоты происходит также образование газа, он скапливается в поплавке. При отсутствии ферментации цвет среды не изменяется.
Поскольку определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, входящие в состав сред Гисса, то наблюдается довольно пестрая картина. Поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором был назван "пестрым рядом". Каждый вид бактерий характеризуется своим "пестрым рядом".
Используют короткий и длинный "пестрый ряд". К первому относятся среды Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и спиртом маннитом. В длинный "пестрый ряд" наряду с перечисленными углеводами вводят среды с моносахаридами (арабинозой, ксилозой, рамнозой, галактозой и т.д.), полисахаридами (инулином, крахмалом, гликогеном и т.д.) и спиртами (глицерином, дульцитом, инозитом).
4. Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % МПА, 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды розовато-серый. При ферментации сахара цвет среды становится голубым, а при наличии и газообразования по ходу посева видны пузырьки газа, а сам агар разрывается.
Наиболее часто среды Гисса используют для дифференциальной диагностики бактерий кишечно-тифозной группы (для отличия патогенных представителей кишечно-тифозного семейства от нормальных представителей, например E. coli).
5. Для изучения бактерий кишечной группы широкое использование получили дифференциально-диагностические среды, содержащие лактозу – среды Эндо, Левина и Плоскирева. Благодаря наличию у E. coli фермента, расщепляющего лактозу, колонии этого микроба изменяют цвет среды в присутствии того или иного индикатора (на среде Эндо колонии кишечной палочки окрашиваются в красный цвет; на среде Левина – в темно-фиолетовый, на среде Плоскирева – в красный). До посева бактерий индикатор фуксин в среде Эндо обесцвечен сульфитом натрия и находится в лейкосоединении. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид. Он взаимодействует с сульфитом натрия, рвется двойная связь, соединяющая его с фуксином, и фуксин восстанавливается.
6. Ферментация лактозы может быть изучена при посеве культуры на молоко: обезжиренное молоко подщелачивают 10 % р-ром карбоната натрия и добавляют в качестве индикатора лакмусовую настойку, разливают по пробиркам и стерилизуют дробным методом. При росте микробов на молоке можно наблюдать подкисление или подщелачивание, свертывание или пептонизацию.
7. Для обнаружения интенсивного кислотообразования, характерного для брожения смешанного типа, используют среду Кларка (1 % глюкоза, 0,5 % пептон, индикатор – метиленовый красный). При рН 4,5 и выше он имеет желтый цвет, при более низких значениях рН – красный цвет.
8. Микроорганизмы, образующие амилазу, способны расщеплять крахмал. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель р-ра Люголя. Если крахмал расщепляется, то цвет среды не изменяется. Если крахмал не расщепляется, среда с этим раствором дает синее окрашивание.
Методика приготовления индикаторов. Индикатор Андреде – 0,5 г кислого фуксина растворяют в 100 мл дистиллированной воды, прибавляют 16,4 мл нормального раствора едкого натрия. Раствор стерилизуют при 100° С в течение 5 мин и сохраняют в темном месте в флаконе с притертой пробкой. Индикатор имеет соломенно-желтый цвет. При смещении pH в кислую зону индикатор Андреде приобретает ярко-малиновую окраску.
Индикатор бромтнмол-бляу – 0,4 г бромтимолбляу растворяют в 40 мл дистиллированной воды, нагревая ее до кипения. После этого к раствору прибавляют 6,4 мл децинормального раствора едкого натрия (жидкость при этом приобретает зеленоватый цвет), доливают дистиллированной водой до 100 мл и хранят в темном месте в склянке, закрытой притертой пробкой. К среде этот реактив добавляют в количестве 1–2%. Бромтимол-бляу можно добавлять к средам в виде спиртового раствора – на 1 л среды рекомендуется добавлять 1,6% спиртового раствора индикатора. При помощи бромтимол-бляу можно определить изменение реакции среды в пределах pH 6,0–7,6. При щелочной реакции среда имеет синий цвет, при кислой – желтый и при нейтральной – травянистый оттенок. В тех случаях, когда хотят охватить более широкий диапазон pH (5,0–8,0), применяют смесь бромкрезол-пурпура и крезол-рота (по 0,5 мл 1,6%-ного каждого спиртового раствора на 1 л среды).
Лакмусовая настойка по Кальметту, Негру и Бока – 100 г лакмуса измельчают и кипятят в 85%-ном спирте, после чего спирт сливают. Порошок собирают на куске полотна, смешивают с 500 мл воды, кипятят в выпарительной чашке, фильтруют через бумагу. К фильтрату добавляют равный объем 85%-ного спирта и делят на две равные части. К одной половине жидкости добавляют по каплям соляную кислоту до тех пор, пока жидкость не станет почти красной и только тогда добавляют другую половину настойки.
Сахаролитические свойства фитопатогенных бактерий можно выявить при изучении способности у них разлагать крахмал. Крахмал – полисахарид, находящийся в растительных клетках, разлагается сравнительно небольшим количеством бактерий. Такие бактерии обладают обычно мощным комплексом ферментов, под действием которых происходит гидролиз крахмала на декстрин и мальтозу, а затем – глюкозу. Эти свойства наблюдаются и у некоторых фитопатогенных бактерий. Для выявления способности у бактерий гидролизировать крахмал их высевают штрихами на твердую питательную среду, содержащую растворимый крахмал и выдерживают в термостате семь дней. В результате гидролиза крахмала вокруг таких штрихов образуется светлая зона (ореол), хорошо заметная, если чашки залить раствором йода или Люголя, окрашивающим среду в синий цвет. Если гидролиз крахмала дошел до стадии образования декстринов, то ореолы окрашиваются в красновато-бурый цвет, если же крахмал перешел в сахар, то они остаются бесцветными.
Рецепт применяемой среды: к 1 л расплавленного горячего мясопептонного агара прибавляют 0,5 г растворимого крахмала, предварительно размешанного в небольшом количестве воды, и хорошо перемешивают. После этого агар разливают в пробирки или сотки и стерилизуют в течение 30 мин под давлением 1 атм.
О сахаролитических свойствах бактерий можно судить также и по их поведению на молоке. Под влиянием фитопатогенных бактерий в молоке могут происходить следующие изменения – свертывание, пептонизация, свертывание + пептонизация, либо молоко может оставаться без изменения. Кроме того, на молоке может наблюдаться образование пигмента. Для обнаружения у бактерий способности свертывать молоко его необходимо слегка подогреть на пламени горелки. Изменения, происходящие в молоке под влиянием фитопатогенных бактерий, следует регистрировать периодически. Первый раз записывают изменения на 1–2-й день, затем на 4, 10 и 21-й день. Свертывание молока может быть вызвано действием фермента бактерий, сбраживающего лактозу (молочный сахар), с образованием молочной кислоты, под влиянием которой белок молока (казеин) свертывается, образуя творожистую массу. Сгусток в дальнейшем не изменяется. Свертывание молока под влиянием протеолитического фермента может происходить с дальнейшей его пептонизацией. Отмечают начало и конец этого процесса. Пептонизация может происходить и без предварительного свертывания. При исследовании изменений молока отмечают его консистенцию – вязкую, тягучую, без изменений и цвет – бурый, синий, зеленый и др.
Биохимические методы идентификации бактерий. Способность к ферментации углеводов у бактерий. Пёстрый ряд при диагностике бактерий. Расщепление белков бактериями.
Методов, используемых для идентификации особенностей метаболизма бактерий, очень много, но на практике применяют небольшое их количество. Большинство способов основано на использовании дифференциально-диагностических сред, включающих различные индикаторы.
Способность к ферментации углеводов у бактерий
Способность к ферментации углеводов у бактерий оценивают по изменению окраски среды вследствие образования органических кислот (соответственно, происходит уменьшение рН), вызывающих изменение окраски индикатора.
Стеклянные поплавки при диагностике ферментации углеводов у бактерий
Стеклянные поплавки при диагностике ферментации углеводов у бактерий. Для определения способности микроорганизмов ферментировать углеводы с образованием кислоты и газа в сосуды со средами вносят стеклянные поплавки (запаянные с одного конца короткие трубочки), всплывающие после наполнения их газом.
Расщепление белков бактериями
Некоторые бактерии проявляют протеолитическую активность, выделяя протеазы, катализирующие расщепление белков. Наличие протеолитических ферментов из группы коллагеназ определяют при посеве уколом в МПЖ. При положительном результате наблюдают его разжижение в виде воронки либо послойно сверху вниз. Способность к расщеплению белков и аминокислот также можно оценивать по изменению окраски среды, так как образующиеся продукты — аммиак, индол и сероводород — сдвигают рН в щелочную сторону, вызывая изменение окраски индикатора.
Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.
Сахаролитические свойства, т.е. способность расщеплять сахар и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа чаще всего изучают на дифференциально-диагностических средах Гисса, которые содержат питательный агар, тот или иной углевод и индикатор Андреде (ВР или др.). В зависимости от изучаемого рода и вида бактерий подбирают среды с соответствующими моно- и дисахаридами (глюкоза, лактоза и др.), полисахаридами (крахмал, гликоген и др.), высшими спиртами (глицерин, маннит и др.), в процессе ферментации которых образуются альдегиды, кислоты и газообразные продукты (С02, Н2, СН4).
В состав короткого “пестрого” ряда Гисса входит 5 углеводов: с глюкоза, лактоза, маннит, мальтоза и сахароза. При некоторых исследованиях для более углубленного изучения биохимических свойств выделенного микроба ряд Гисса дополняют дульцитом, сорбитом, ксилозой, арабинозой и некоторыми другими сахарами. Название “пестрый” ряд обусловлено тем, что под действием ферментов микроорганизмов одни углеводы остаются неизменными и, следовательно, цвет питательной среды не меняется, в то время как другие сахара расщепляются, образуя кислые продукты распада, которые изменяют цвет индикатора и соответственно цвет питательной среды. По консистенции среды Гисса бывают жидкими и полужидкими (с добавлением 0,2—0,5% агар-агара). В пробирки с жидкими средами Гисса для обнаружения газов, являющихся конечными продуктами распада сахаров, опускают “поплавок” — трубочку диаметром 0,5—0,7 см, запаянную с одного конца. “Поплавок” помещают запаянным концом кверху; при стерилизации он полностью заполняется питательной средой. При образовании в среде газообразных продуктов они вытесняют часть жидкости, находящейся в “поплавке”, вследствие чего у запаянного конца его собирается воздушный пузырек. В полужидких средах Гисса газообразование определяют по наличию мелких пузырьков газа в толще среды и стойкой пены на ее поверхности. Таким образом, при изучении сахаролитических ферментов, выделяемых микробами, учитывают не только явления расщепления тех или иных сахаров по кислотообразованию, но и глубину ферментативного процесса по наличию в питательной среде конечных газообразных продуктов. Пробирки с набором сред Гисса ставят в штатив в один ряд. На каждой пробирке надписывают название сахара, содержащегося в среде. На первой пробирке каждого ряда, кроме названия сахара, указывают номер или вид исследуемой микробной культуры. Культуру берут на кончик петли в очень небольшом количестве и засевают по общепринятой методике.
Критерии учета результатов:
цвет среды не меняется - культура не ферментирует углевод;
Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, Левина, Плоскирева. Микроорганизмы, сбраживая до кислоты находящийся в этой среде молочный сахар, образуют окрашенные колонии (кислота изменяет цвет индикатора). Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны.
Таблица 17. Дифференциально-диагностические среды
Наименование и внешний вид среды
Принцип действия и внешний вид среды после посева
Бледно-розовая плотная среда, разливается в чашки Петри
Питательная основа-МПА, субстрат - лактоза, индикатор - основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия (Na2SO3)
Для рассева исследуемого материала (нативного или после обогащения) с целью получения изолированных колоний патогенных и условно-патогенных знтеробактерий: эшерихий, сальмонелл, шигелл, йерсиний и других
На среде можно наблюдать рост красных или бесцветных колоний. Эшерихии разлагают лактозу до кислых продуктов, в том числе альдегидов, они соединятся с сульфитом натрия, при этом освобождается фуксии, который окрашивает колонии и среду в красный цвет, часто с металлическим зеленоватым блеском (положительный результат). Сальмонеллы и шигеллы не разлагают лактозу и образуют бесцветные колонии (отрицательный результат).
Среда Левина
Плотная среда красновато-фиолетового цвета. Среда является дифференциально-диагностической и слабо селективной, так как оказывает ингибирующее действие на грамположительную микрофлору
Питательная основа-МПА, Субстрат - лактоза. Индикаторы - эозин и метиленовый синий
Для получения изолированных колоний патогенных и условно-патогенных энтеробактерий - см. среду Эндо.
Среда Левина может быть использована также для выделения грибов Candida albicans
На среде можно наблюдать рост синих или бесцветных колоний. Escherichia coli, разлагающая лактозу, вызывает сдвиг рН в кислую сторону, при этом комплекс индикаторов эозина и метиленового синего выпадает в осадок и колонии приобретают темно-сине-фиолетовый, почти черный цвет, часто с металлическим блеском (положительный результат). Энтеробактерии не расщепляющие лактозу, образуют бесцветные колонии.
Среды Гисса
Набор пробирок с полужидкой средой розового цвета.
Питательная основа - полужидкий МПА (0,4%), Субстрат (в каждой пробирке разный углевод), Индикатор - бром крезоловый пурпурный или BP (водный голубой и розоловая кислота)
Определение спектра сахаролитической активности с целью идентификации (определение родовой и видовой принадлежности) выделенной культуры бактерий семейства Enterobacteriaceae, а также других семейств и родов.
При ферментации субстрата образуются кислые продукты (молочная, уксусная, муравьиная и другие кислоты), которые снижают значение рН и розовый цвет индикатора изменяется на синий, что указывает на положительную реакцию. При образовании газа (Н2 и СО2;) - пузырьки и трещины в толще среды. Рост бактерий в среде Гисса без изменения ее цвета свидетельствует об отсутствии фермента, расщепляющего данный углевод, то есть об отрицательной реакции
Читайте также: