Схема микроклонального размножения земляники

Обновлено: 05.10.2024

Во многих странах мира таким образом производят посадочный материал плодовых растений - банана, цитрусовых, ананаса, клубники, а также таких культур как сахарный тростник, картофель, батат и маниока. Среди декоративных растений микроклональным путем размножают различные виды антуриума, гербер, орхидей, роз.

Сегодня метод размножения и культивирования in vitro также широко используется для решения задач сохранения и восстановления генофонда редких и исчезающих видов растений.

Крошечные кусочки листа, побега или другой части растений (экспланты) культивируют на специально подобранной питательной среде в стерильных условиях (Рисунок 1). Затем микрорастения черенкуют и укореняют уже на среде другого состава. Далее следует очень важный этап адаптации, в ходе которого нежные растительные клоны приучают к жизни в условиях атмосферы и почвогрунта. Теоретически все растения могут быть подвергнуты микроразмножению, но на практике лабораторные протоколы (точные методики с четко определенными составами сред и другими условиями) для многих растений не разработаны. Часто требуются серьезные исследования, чтобы выяснить, как именно размножать определенные культуры микроклональным путем.

Схема процесса микроклонального размножения растений в декоративном и сельскохозяйственном растениеводстве: 1 – стерилизация эксплантов, 2 – культивирование в стерильных условиях, 3 - микрочеренкование, 4 – укоренение, 5 – повторное размножение, 6 – адаптация микроклонов, 7 – высадка в грунт

Почему микроклональное размножение растений – удобный и широко используемый в мире подход для применения в сельскохозяйственном производстве? Этот способ имеет ряд серьезных преимуществ перед традиционным размножением семенами или черенкованием:

Получение генетически однородного посадочного материала;
Радикальное оздоровление растений путем удаления возбудителей вирусных, грибных, бактериальных и других инфекций;
Высокий коэффициент размножения, а значит быстрое получение большого количества посадочного материала;
Возможность проведения работ в круглогодичном режиме.

Благодаря своим особенностям микроклональное размножение растений подходит для решения специфических задач сельскохозяйственного растениеводства и садоводства:

Микроклональное размножение земляники садовой определенных сортов с получением посадочного материала для промышленного культивирования

Массовое выращивание растений с заданными качествами: микроразмножение иногда используется для получения растений с более высокой скоростью роста (которую также связывают с более низким содержанием возбудителей болезней растений в искусственно выращенном материале), образующих более компактные кусты и др.

В России сегодня работает меньше десятка предприятий, специализирующихся на микроклональном размножении растений и адаптации микроклонов. Потребности рынка при этом очень велики. При наличии квалифицированных кадров, необходимого оснащения биотехнологической лаборатории и при умелой организации процесса микроклональное размножение может стать частью технологического процесса непрерывного производства посадочного материала для сельхозпроизводителей и садоводов.

Гипотеза: в основе микроклонального размножения земляники лежит способность изолированных частей растений восстанавливать недостающие органы и регенерировать целые растения.

Цель работы: доказать, что в основе микроклонального размножения земляники лежит способность растений к регенерации

Вложение	Размер
mikroklonalnoe_razmnozhenie_rasteniy.doc	94 КБ

Предварительный просмотр:

МУНИЦИПАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

для участия в Шестой научно-практической конференции проектных и исследовательских работ учащихся медико-биологических классов

школ-партнеров Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Предметная область - биология

Козявина Кристина Юрьевна

Раковский Александр Александрович

Калошина Алёна Александровна

Руководитель: Бабич Елена Викторовна

Должность: учитель биологии

Введение………………………………………………………………….….3
Гипотеза, цель и задачи исследования…………………………………….3
Объект и методы исследования……………………………………. …3
Обзор литературы по выбранной теме

Регенерация и микроклональное размножение растений………. 4
Этапы и методы микроклонального размножения растений………………………………………………………………6

5. Практическая часть

5.1 Приготовление питательной среды для культивирования изолированных органов, тканей и клеток растений……………. 7

Биотехнология – наука о методах и технологиях создания и использования генетических трансформированных биологических объектов. Один из методов биотехнологии – это микроклональное размножение (клеточная биотехнология), основанное на способности клеток и тканей к регенерации, что обеспечивает ускоренное получение ценных форм и линий сельскохозяйственных растений. Оно не зависит от сезона, позволяет получать оздоровленный посадочный материал от вирусной и бактериальной инфекции, дает возможность выращивать сотни тысяч растений из одной меристемы, размножать ценные генотипы, получать биологические препараты пищевого, кормового и медицинского направления.

2. Гипотеза, цель и задачи исследования

Задачи работы: изучить метод микроклонального размножения растений и его значение по литературным источникам; овладеть технологией приготовления питательных сред для культивирования изолированных органов и тканей; провести микроклональное размножение растений на основе их способности к регенерации; сделать выводы о проделанном исследовании.

3. Объект и методы исследования

Объект исследования: меристематические верхушки растений земляники.

Методы исследования: метод индукции адвентивных почек тканей эксплантата; наблюдение; экспериментальный метод.

Работа выполнялась в лаборатории Брянской Сельскохозяйственной Академии под руководством заведующего лабораторией биотехнологии Сковородникова Дмитрия Николаевича.

4. Обзор литературы по выбранной теме

В ходе работы были изучены публикации отечественных авторов по сельскохозяйственной биотехнологии, биотехнология сельскохозяйствен-ных растений, а так же методическое пособие по биотехнологии.

4.1. Регенерация и микроклональное размножение растений

Регенерация — способность живых организмов восстанавливать повреждённые ткани, целые органы. Значение регенерации заключается в том, что на основе клеточного и внутриклеточного обновления органов обеспечивает восстановление и компенсация функций, нарушенных в результате различных патогенных факторов.

Широкое распространение регенерации в царстве растений обусловлено сохранением у них меристем (тканей, состоящих из делящихся клеток) и недифференцированных тканей. На кончике нормального стебля имеется верхушечная почка (адвентивная), обеспечивающая непрерывное образование новых листьев и рост стебля в длину в течение всей жизни данного растения. Если отрезать эту почку и поддерживать ее во влажном состоянии, то из имеющихся в ней паренхимных клеток или из каллуса, образующегося на поверхности среза, часто развиваются новые корни, почка при этом продолжает расти и дает начало новому растению [4].

В природе существует два способа размножения растений: семенной и вегетативный. К особенностям семенного размножения следует отнести генетическую пестроту получаемого посадочного материала и длительность вегетационного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность вегетационного периода.

Достижения с области культуры клеток и тканей привели к созданию нового метода вегетативного размножения – микроклонального размножения (получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путём растений, генетически идентичны исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки давать начало целому растительному организму и регенерации. Первые исследования начались в конце 50-х годов 20 века, нашей стране работы проводились в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева. Этот метод имеет ряд преимуществ:

Получение генетически однородного посадочного материала;
Освобождение растений от вирусов;
Высокий коэффициент размножения;
Сокращение продолжительности селекционного процесса;
Ускорение перехода растений от ювенальной к репродуктивной фазе развития;
Получение растений, трудноразмножаемых традиционными способами;
Возможность проведения работ в течение круглого года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочных материалов;
Возможность автоматизировать процесс выращивания.

Область применения микроразмножения разнообразна и имеет тенденцию к постоянному расширению:

Размножение взрослых древесных пород (каштан, дуб, клён, осина);
Сохранение редких и исчезающих лекарственных видов растений;
Получение вторичных метаболитов, используемых для производства лекарств (алкалоидов, глюкозидов, стероидов), вкусовых добавок (сахаров); гормонов, витаминов, белков;
Использование культурных клеток в качестве источника новых химических веществ;
Размножение и промышленное производство плодоовощных и декоративных растений [3].

Таким образом, клеточная биотехнология, основанная на способности клеток и тканей к регенерации, позволяет человеку решать многие актуальные вопросы селекции, связанные с проблемой растущего населения Земли.

4.2. Этапы и методы микроклонального размножения растений

Процесс микроклонального размножения можно разделить на 4 этапа: 1. Выбор растения-донора и получение хорошо растущей стерильной культуры;

2. Собственно микроразмножение, когда достигается максимальное количество микропобегов;

3. Ускорение развития размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям;

4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации и посадке в поле [3].

Изучив предложенные в литературе методы микроразмножения растений, мы выбрали метод, используемый в биотехнологической лаборатории Брянской Государственной Сельскохозяйственной Академии - индукции адвентивных почек эксплантата.

Он основан на способности изолированных частей растений при благоприятных условиях питательной среды, восстанавливать недостающие органы и регенерировать целые растения из разных частей (изолированного зародыша, листа стебля, семядолей, чешуек сегментов корней и зачатков соцветий) [3].

Мы проводили микроклональное размножение земляники. При этом изолировали меристематические верхушки этих растений и выращивали их на питательной среде Мурасиге-Скуга. Через 3-4 недели культивирования меристема развивалась в проросток, в основании которого формировались адвентивные почки, которые быстро росли и давали начало новым почкам. В течение 6-8 недель образовались конгломераты почек, связанные между собой соединительной тканью и находящиеся на разной стадии развития. Появились листья на коротких черешках, в нижней части которых сформировались новые адвентивные почки. Это почки мы разделили и, затем пересадили на свежую питательную среду. Таким образом, от одного материнского растения можно получать несколько миллионов растений-регенератов в год.

5. Практическая часть

5.1 Приготовление питательной среды для культивирования изолированных органов, тканей и клеток растений

Для обеспечения роста и развития любой растительной ткани или органа растения требуется соблюдение внешних физико-химических условий (освещённости, температуры, влажности, кислорода для дыхания, углекислого газа для фотосинтеза), поступление элементов минерального и органического питания. При культивировании растительных эксплантатов в закрытых пробирках фотосинтез затруднён, поэтому требуются более сложные по составу среды, обеспечивающие все потребности тканей или органов [2].

Культурные среды для растительных эксплантатов содержат следующие группы компонентов:

Неорганические макроэлементы в виде солей (N, P, K, S, Fe, Ca, Mg) и микроэлементы (Co, Cu, Zn, B, Mo, Mn, J, Ni);
Углеводы – сахароза, глюкоза – основа гетеротрофного питания растений in vitro, обеспечивает рост эксплантата.
Аминокислоты, получаемые при гидролизе молочного белка казеина. Они синтезируются in vitro из сахара и минеральных веществ, их добавка оказывает положительное влияние на эксплантаты из меристем.
Витамины (В1, В6, С, никотиновая кислота, и др.) – являются коферментами, обеспечивающих активность, улучшают адаптацию тканей и их рост.
Фитогормоны – стимулируют рост и деление клеток растений, направляет развитее эксплантата в нужную сторону: ауксины – получение корней, цитокинины – побеги, гиббереллин – ростстимурирующий гормон.
Желирующее вещество (агар-агар) регулирует консистенцию среды [2].

Самой популярной и универсальной минеральной основой для питательных сред является минеральная часть среды Мурасиге-Скуга (МС).

Для семенных растений характерно два способа размножения: семенной и вегетативный. Оба эти способа имеют как преимущества, так и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести, в первую очередь, генетическую пестроту получаемого посадочного материалa и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной.

Это обусловлено следующими причинами:

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

Этот метод, несомненно, имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:

Первые достижения в области клонального микроразмножения были получены в конце 50-х годов XX столетия французским ученым Жоржем Морелем, которому удалось получить первые растения-регенеранты орхидей. Успеху Ж. Мореля в микроразмножении способствовала уже разработанная к тому времени техника культивирования апикальной меристемы растений в условиях in vitro. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы, одуванчика, салата и изучали влияние состава питательной среды на процессы регенерации и формирования растений. Ж. Морель в своих работах также использовал верхушку цимбидиума (сем. орхидные) состоящую из конуса нарастания и двух-трех листовых зачатков, из которой при определенных условиях наблюдал образование сферических сфер — протокормов. Сформировавшиеся протокормы можно было делить и затем культивировать самостоятельно на вновь приготовленной питательной среде до образования листовых примордиев и корней. В результате им было обнаружено, что этот процесс бесконечен и можно было получать в большом количестве высококачественный и генетически однородный, безвирусный посадочный материал.

В России работы по клональному микроразмножению были начаты в 60-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Под руководством чл.-корр. РАН, академика РАСХН Бутенко Р. Г. были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы, фрезии и некоторых других растений и предложены промышленные технологии. Таким образом, первые успехи в клональном микроразмножении связаны с культивированием апикальных меристем травянистых растений на соответствующих питательных средах, обеспечивающих в конечном итоге получение растений-регенерантов.

Однако область применения микроразмножения разнообразна и имеет тенденцию к постоянному расширению. Это в первую очередь относится к размножению in vitro взрослых древесных пород, особенно хвойных, и использование техники in vitro для сохранения редких и исчезающих видов лекарственных растений. В настоящее время в этом направлении наметился положительный сдвиг.

Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов XX столетия и связаны с именем французского ученого Готре.

В них сообщалось о способности камбиальных тканей некоторых видов вяза и сосны к каллусогенезу in vitro. В последующих работах 40-х годов было выяснено о способности различных тканей вяза листового к образованию адвентивных почек. Однако дальнейший рост и формирование побегов авторами не были получены. Лишь к середине 60-х годов Матесу удалось получить первые растения-регенеранты осины, которые были доведены до почвенной культуры. Культивирование тканей хвойных город in vitro долгое время использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования ювенильных и тем более взрослых тканей, изолированных с растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные, характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и другие вещества), которые в изолированных тканях окисляются различными фенолазами. В свою очередь, продукты окисления фенолов обычно ингибируют деление и рост клеток что ведет к гибели первичного экспланта или к уменьшению способности тканей древесных пород к регенерации адвентивных почек которая с возрастом растения-донора постепенно исчезает полностью. Однако, несмотря на все трудности, ученые все чаще используют в качестве объектов исследований различные ткани и органы древесных растений В настоящее время насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, осина, гибриды тополей с осиной, сосна, ель, секвойя и др.), а работы в этом направлении ведутся в научных учреждениях Москвы, Санкт-Петербурга, Воронежа, Уфы, Новосибирска, Архангельска, Киева, Одессы, Ялты и др.

Этапы микроклонального размножения растений.

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.
Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.
Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2оС, +10оС).
Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100—200 мг/л. Это в первую очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается тенденция к накоплению внутренней инфекции.

На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. В тех случаях, когда наблюдается ингибирование роста первичного экспланта, за счет выделения им в питательную среду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), снять его можно, используя антиоксиданты. Это возможно двумя способами: либо омывкой экспланта слабым его раствором в течение 4—24 ч, либо непосредственным добавлением в питательную среду. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую кислоту (1 мг/л), глютатион (4—5 мг/л), дитиотриэтол (1—3 мг/л), диэтилдитиокарбомат (2—5 мг/л), поливинилпирролидон (5000—10000 мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент - древесный активированный уголь в концентрации 0,5—1%. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.

2 этап — собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.

Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов—ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.

При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5—10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Вместе с тем, возможно наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Н.В. Катаевой и Р.Г. Бутенко, путем использования питательных сред с минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающих стабильный коэффициент микроразмножения, или путем чередования циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов.

3 и 4 этапы — укоренение микропобегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5—1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют β-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК.

Укоренение микропобегов проводят двумя способами:

Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений — весна или начало лета.

Растения с двумя-тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85—90° С в течение 1—2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1); торф, дерновую почву, перлит (1:1:1); торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют семейство орхидных, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1).

Приготовленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20—22° С), освещенностью не более 5 тыс. лк и влажностью 65—90%. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений.

Через 20—30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения подкармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасига и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным минеральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизированных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для каждого индивидуального вида растений.

Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Эти явления связаны, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтому целесообразно на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите растений от патогенов.

Индийскими учеными предложен простой метод предотвращения быстрого обезвоживания листьев растений, выращенных in vitro, во время их пересадки в полевые условия. Метод заключается в том, что листья в течение всего акклиматизационного периода следует опрыскивать 50%-ным водным раствором глицерина или смесью парафина, или жира в диэтиловом эфире (1:1). Применение этого метода помогает избежать длинных и затруднительных процессов закаливания пробирочных растений и обеспечивает 100%-ную их приживаемость.

Методы клонального микроразмножения.

Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году, процесс можно осуществлять следующими путями:

Активация пазушных меристем.
Образование адвентивных побегов тканями экспланта.
Возникновение адвентивных побегов в каллусе.
Индукция соматического эмбриогенеза в клетках экспланта.
Соматический эмбриогенез в каллусной ткани.
Формирование придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (деление первичных эмбриоидов).

Н. В. Катаева и Р. Г. Бутенко (1983) выделяют два принципиально различных типа клонального микроразмножения:

Активация уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля).
Индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo:
1. образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта;
2. индукция соматического эмбриогенеза;
3. дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Основной метод, использующийся при клональном микроразмножении растений - активация развития уже существующих в растении меристем. Он основан на снятии апикального доминирования.

Этого можно достичь двумя путями:

Схема размножения растений методом активации уже существующих меристем (по А. Р. Родину, Е. А. Калашниковой, 1993): 1 – путем удаления верхушечной меристемы: 2 – добавлением цитокининов в среду (б/г – среда без гормонов, Ц – цитокинин, А – ауксин)

Полученные таким образом побеги отделяют от первичного экспланта и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков.

Часто в качестве экспланта используют верхушечные или пазушные почки, которые изолируют из побега и помещают на питательную среду с цитокининами.

Образующиеся пучки побегов делят, при необходимости черенкуют и переносят на свежую питательную среду. После нескольких пассажей, добавляя в питательную среду ауксины, побеги укореняют in vitro, а затем переносят в почву, где создают условия, способствующие адаптации растений.

Адаптация пробирочных роз к почвенным условиям.

В настоящее время этот метод широко используется в производстве посадочного материала сельскохозяйственных культур, как технических, так и овощных, а также для размножения культур промышленного цветоводства (например, гвоздики), тропических и субтропических растений, плодовых и ягодных культур, древесных растений.

Для некоторых культур, таких как картофель, технология клонального размножения поставлена на промышленную основу.

Применение метода активации развития существующих меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 100000 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней - ценного безвирусного семенного материала.

Второй метод - индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения.

Можно добиться образования адвентивных почек почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковиц, сегментов корней и зачатков соцветий).

Этот процесс происходит на питательных средах, содержащих цитокинины в соотношении с ауксинами 10:1 или 100:1. В качестве ауксина используют ИУК или НУК.

Таким способом были размножены многие представители семейства лилейных, томаты, древесные растения (из зрелых и незрелых зародышей).

Достаточно хорошо разработана технология клонального размножения земляники, основанная на культивировании апикальных меристем. Меристематические верхушки изолируют из молодых, свободных от вирусных болезней растений, и выращивают на питательной среде МС, содержащей БАП в концентрации 0,1 - 0,5 мг/л. Через 3 - 4 недели культивирования меристема развивается в проросток, в основании которого формируются адвентивные почки, быстро растущие и дающие начало новым почкам. В течение 6-8 недель образуется конгломерат почек, связанных между собой соединительной тканью и находящихся на разной стадии развития. Появляются листья на коротких черешках, в нижней части которых формируются новые адвентивные почки. Эти почки разделяют и пересаживают на свежую питательную среду. На среде без регуляторов роста за 4 - 5 недель формируются нормальные растения с корнями и листьями. От одного материнского растения таким образом можно получить несколько миллионов растений-регенерантов в год.

Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении, основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему виду напоминают зиготические зародыши. Этот метод получил название соматического эмбриогенеза.

В отличие от развития in vivo, соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. Согласно Стеварду, соматические зародыши проходят 3 стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную и в конечном итоге имеют тенденцию развития в проросток.

земляника садовая Fragaria ananassa Duch., клональное микроразмножение in vitro, регуляторы роста, посадочный материал.

Аннотация

Изучены особенности технологии клонального микроразмножения ремонтантных гибридных форм земляники садовой (Fragaria ananassa Duch.). Традиционно землянику садовую размножают вегетативно с помощью усов, однако для ремонтантной земляники такой способ размножения малоэффективный, так как за период вегетации она образует 1–2 уса на одну розетку. Альтернативным методом вегетативного размножения является клональное микроразмножение in vitro. Для введения земляники в культуру in vitro использовали верхушечные столоны (усы) и неукоренившиеся розетки, собранные в период с апреля по июнь.

С целью получения полиплоидных форм, образующихся в процессе каллусогенеза использовали стеблевые и листовые экспланты. Основной питательной средой была агаризованная среда Мурасиге-Скуга (МС), дополненная регуляторами роста и аскорбиновой кислотой (1,5 мг/л), контролем являлся безгормональный вариант среды МС. Изучено влияние различных концентраций цитокинина 6-бензиламинопурин (0,3-1 мг/л 6-БАП) на коэффициент размножения и ауксина α-индолилуксусной кислоты (0,5-1 мг/л ИУК) на укоренение ремонтантных гибридов земляники садовой в культуре in vitro. Определены оптимальные концентрации 6-бензиламинопурина (0,3 мг/л) на этапе собственно размножения и α-индолилуксусной кислоты (0,5 мг/л) на этапе укоренения земляники садовой.

Полученные в процессе культивирования микророзетки с хорошо развитой корневой системой, акклиматизировали и выращивали на гидропонике. Адаптированные к росту в открытом грунте растения использовались как посадочный материал, который далее размножали в теплице.

Читайте также: