Среды для бак посевов

Обновлено: 26.08.2024

Посев на жидкую питательную среду. Пробирку с исследуемым материалом и пробирку с питательной средой держат слегка наклонно в левой руке между большим и указательным пальцами так, чтобы края пробирок были на одном уровне (пробирка с исследуемым материалом должна быть первой по отношению к работающему). В правую руку берут бактериологическую петлю (иглу или пипетку) как писчее перо. Пробки от пробирок прижимают мизинцем к ладонной поверхности правой кисти, в зоне пламени горелки пробирки открывают, края пробирок обжигают. Петлю вертикально прокаливают в пламени горелки. Простерилизованную петлю (иглу, пипетку) вводят через пламя горелки в пробирку с посевным материалом. Петлю охлаждают, забирают небольшое количество материала, переносят в пробирку со стерильной питательной средой. Материал стряхивают в среду или, слегка погружая в жидкость петлю, растирают посевной материал по стенке пробирки не касаясь среды держателем, после чего смывают его средой. Края пробирок и пробки вновь проводят над пламенем горелки, закрывают пробирки пробками, стерилизуют петлю и ставят ее в штатив или стакан. При посеве материала с помощью пипетки использованную пипетку опускают вниз концом в банку с дезинфицирующим раствором.

Посев на плотную питательную среду. Посевы выполняют разными способами. Эти способы основаны на том, что микроорганизмы иммобилизуются на поверхности или в глубине питательной среды.

Посев в пробирку. Материал, забранный петлей, опускают до дна пробирки со скошенным агаром, погружают в конденсационную жидкость и зигзагообразными движением петли проводят снизу вверх, слегка касаясь поверхности среды (посев штрихом). При посеве материала уколом в столбик среды, петлей с материалом или иглой прокалывают вертикально центру пробирки питательную среду, петлю или иглу вынимают, прожигают. (Правила работы с пробирками и петлей при посеве в пробирку с плотной средой аналогичны правилам при посеве на жидкие питательные среды).

Посев на чашку Петри. Чашку берут в левую руку, большим пальцем левой руки слег приподнимают крышку, чтобы в образовавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель, обжигают на пламени горелки края чашки в зоне щели, вносят посевной материал на поверхность питательной среды, затем растирают его при помощи стеклянного шпателя или бактериологической петли.

1. Посев штрихом. Посевной материал втирают петлей в поверхность среды у края чаш избыток снимают, проколов агар. Оставшийся материал растирают параллельными штрихами по поверхности среды.

2. Посев петлей на секторы: дно чашки расчерчивают на секторы, посев производят зигзагообразными движениями от края чашки к центру так, чтобы штрихи с одного сектора не переходили на другой.

3. Дробный посев: бактериологической петлей с посевным материалом несколько раз делают параллельные штрихи в одном секторе чашки Петри, петлю прожигают в пламени горелки, дают остыть и часть материала из первого сектора (А) распределяют во втором секторе (В) аналогичным способом, затем в третьем (С) и четвертом (Д) секторах.

Посев шпателем. Материал наносят на поверхность среды петлей или пипеткой, затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают по всей поверхности агара, вращая полуоткрытую чашку. После посева стеклянный шпатель помещают в дезинфицирующий раствор, металлический — прокаливают в пламени горелки.

Посев тампоном. Тампон с исследуемым материалом вносят в чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, одновременно вращая тампон и чашку.

Посев газоном. 1 мл исследуемого материала (жидкая бульонная культура или взвесь микробов в физиологическом растворе) наносят пипеткой на поверхность среды и тщательно распределяют жидкость по всей поверхности чашки. Избыток материала отсасывают пипеткой и вместе с ней помещают в дезинфицирующий раствор.

Посев уколом. Посев уколом в агар столбиком (прямой агар) применяется для выращивания анаэробов или выявления характерного признака микроба, так как рост по уколу типичен для ряда бактерий. Посев уколом в полужидкий агар практикуется также с целью длительного хранения культур. При посеве уколом в столбик желатина наблюдается разжижение ее бактериями, обладающими протеолитическим ферментом. Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку, как обычно, вынимают пробку и обжигают край пробирки, и в центре столбика питательной среды сверху вниз почти до самого дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней материалом.

Бактериологический посев или, как принято называть короче – бак посев, применяется для получения большого количества микробов одного вида (чистая культура) с целью изучения их физико-химических и биологических свойств, чтобы затем полученные данные использовать для диагностики инфекционных заболеваний.

К сожалению, даже популярные нынче иммуноферментный анализ (ИФА), полимеразная цепная реакция (ПЦР) и другие методы, основным недостатком которых являются ложноположительные или ложноотрицательные результаты, не всегда могут идентифицировать возбудителя. Кроме того, они не способны подобрать антибактериальные препараты направленного действия. Подобную задачу решает бак посев, который часто не спешат назначать, ссылаясь на то, что, например, уреа- микоплазмы медленно культивируется, а стоимость анализа немалая. Однако ведь и здоровье того стоит!

Для питания и дыхания нужны условия

пример роста микроорганизмов после бак-посева в питательную среду

Цель культивирования микроорганизмов и значимость ее для диагностики

Кроме воды, воздуха, почвы, содержащие в тех или иных концентрациях различные микроорганизмы, в том числе и приносящие болезнь (патогенные), многие отрасли медицинской науки интересуют микробы, живущие на коже и слизистых человеческого организма, которые могут быть представлены:

Постоянными обитателями, не несущими никакой опасности человеку, то есть, нормальной микрофлорой организма, без которой мы просто жить не можем. Например, исчезновение бактерий, живущих в кишечнике и участвующих в процессе пищеварения, приводит к дисбактериозу, лечить который – дело непростое. Так же происходит и с исчезновением вагинальной микрофлоры. Ее тут же заселяют условно-патогенные микроорганизмы, гарднереллы, например, которые вызывают бактериальный вагиноз (гарднереллез);
Условно-патогенной флорой, которая приносит вред лишь в больших количествах при определенных условиях (иммунодефицит). Вышеназванная гарднерелла – представитель такого типа микроорганизмов;
Наличием патогенных микробов, которые в здоровом теле не присутствуют. Они чужды человеческому организму, куда попадают случайно при контакте с другим (больным) человеком и вызывают развитие инфекционного процесса, порой, довольно тяжелого или даже смертельного. Например, встреча с возбудителями сифилиса – еще куда ни шло, на первых порах лечится, а вот (упаси Бог!) выпустит на волю холеру, чуму, черную оспу и др.

Таким образом, методы посева, как и питательные среды, бывают разными, тем не менее, цель у них одна: получить чистую культуру без посторонних примесей в виде микробов других классов, которые обитают повсеместно: в воде, в воздухе, на поверхностях, на человеке и внутри его.

Когда назначается бак посев и как разобраться в ответах?

Название микроорганизма и его количество

Бактериологический анализ пациенты сами себе не назначают, это делает врач, если у него есть подозрения, что проблемы больного, предъявляющего различные жалобы, связаны с проникновением в организм патогенного возбудителя или с усиленным размножением микроорганизмов, постоянно живущих с человеком, но проявляющих патогенные свойства только в определенных условиях. Сдав анализ и через некоторое время получив на руки ответ, человек теряется, а порой и пугается, увидев непонятные слова и обозначения, поэтому, чтобы этого не произошло, хочется дать краткое разъяснение по данному вопросу:

Первым пунктом заключения, как правило, стоит название возбудителя на латинском языке, например, Escherichiacoli. Это – кишечная палочка, она является естественным обитателем кишечника и в допустимых количествах никакого вреда не приносит;
Следующий пункт – концентрация микроорганизма. Е.coli– обильный рост (1х10^ 6 и более) норма – менее 1x10^ 4 ;
Далее – патогенность: флора условно-патогенная.

Вид микроорганизма, допустим, та же Е.coli в количестве 1х10^ 6 ;
Название антибиотика с обозначением (S) указывает на чувствительность возбудителя к этому препарату;
Вид антибиотиков, не действующих на микроорганизм, обозначается символом (R).

Бактериологический анализ представляет особую ценность в определении чувствительности к антибиотикам, поскольку основной проблемой в борьбе с хламидией, микоплазмой, уреаплазмой и др. остается подбор действенного лечения, не приносящего вред организму и не ударяющего по карману пациента.

Таблица: альтернативный пример результатов бак-посева с выявлением эффективных антибиотиков

Правильная подготовка к бактериологическому анализу – залог достоверного результата

Бактериологическому анализу может подвергаться любой биологический материал, взятый у человека (кожа, кровь, сперма, слизистые ротовой полости, дыхательных и мочеполовых путей, желудочно-кишечного тракта, органов зрения, слуха и обоняния и др.). Чаще всего бак посев назначают гинекологи и урологи, поэтому на нем следует несколько остановиться.

Правильная подготовка к бактериологическому посеву будет залогом правильного результата, потому что в противном случае, анализ придется сдавать заново и ждать назначенное время. Как сдать кровь на стерильность из вены – это задача медработников. От больного здесь, как правило, ничего не зависит, он просто предоставляет локтевой сгиб, а медсестра производит забор в стерильную пробирку с соблюдением всех правил асептики и антисептики.

Другое дело – моча или мазок из половых путей. Здесь пациент должен обеспечить первый этап (забор), соблюдая предписанные правила. Следует заметить, что моча женщин и мужчин несколько отличается, хотя в мочевом пузыре у обоих полов она стерильна:

У женщин при прохождении через мочеиспускательный канал может захватить небольшое количество непатогенных кокков, хотя в целом, часто остается стерильной;
У мужчин все несколько по-другому. Передняя часть уретры может снабдить проходящую мочу находящимися там:
1. дифтероидами;
2. стафилококками;
3. некоторыми непатогенными грамотрицательными бактериями, что и покажет впоследствии бактериологический анализ.

Однако, если они находятся в допустимой концентрации (до 10 3 КОЕ/мл), то пугаться нечего, это вариант нормы.

Чтобы избежать присутствия других микроорганизмов и максимально обеспечить стерильность взятого материала, перед сдачей анализа производится тщательный туалет половых органов (вход во влагалище у женщин закрывается ватным тампоном – защита от попадания отделяемого половых органов). Для анализа берется средняя порция мочи (начало мочеиспускания в унитаз, приблизительно 10 мл средней порции в стерильную баночку, окончание в унитаз). Пациентам необходимо знать: моча, взятая на посев, должна быть обработана не позднее, чем через два часа при хранении не выше 20°С, поэтому следует рассчитывать время на транспортировку.

Кроме этого материал на бак посев при необходимости берут из уретры и прямой кишки у мужчин, из уретры, прямой кишки, влагалища, шейки матки и цервикального канала – у женщин, но это происходит в медицинском учреждении, куда пациент должен прибыть. Подмывание, спринцевание и использование антисептических средств в таких случаях запрещено.

Другие вопросы, волнующие пациентов

Многие пациенты интересуются, сколько дней делается анализ. Однозначно на этот вопрос ответить нельзя, все зависит от того, какой материал подвергается исследованию и какой возбудитель нужно искать. Иногда ответ готов через 3 дня, иногда через неделю или даже дней 10 – 14, поскольку некоторые образцы требуют пересева на другую среду.

Не обходят стороной люди, направляющиеся на бак посев и вопрос о цене анализа. Примерная стоимость в Москве составляет порядка 800 – 1500 рублей. Разумеется, она может быть выше и зависит от широты спектра бактериологического поиска. Бесплатно анализ, наверное, можно сдать при беременности в женской консультации, или в поликлинике по особым медицинским показаниям.

Для беременных бак посев является обязательным, сдается 2 раза (при постановке на учет и в 36 недель), при этом, мазок берется не только из половых путей, но и со слизистых носа и зева. Объектом поиска в данном случае, кроме урогенитальных инфекций, будет золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), который в послеродовом периоде может натворить много бед (гнойный мастит и др). Кроме этого, беременным в обязательном порядке делается посев мочи, соскоба влагалищного эпителия и мазки из шейки матки и цервикального канала.

Видео: ролик-демонстрация по бак-посеву из цервикального канала

Частные случаи, особо интересные сдающим анализы

Следует заметить, что, если соскоб со слизистых мочеполовых путей, взятый для посева на уреаплазму, является не таким уж редким явлением, то посева мочи сами врачи часто избегают, поскольку с ней работать сложнее.

Трудности в диагностике создает хламидийная инфекция, приносящая большой вред не только при беременности. Кроме этого, хламидия вызывает множество заболеваний, свойственных не только женщинам, но и мужскому населению тоже, поэтому ее сеют, культивируют, изучают, определяют чувствительность к антибактериальной терапии и, таким образом, борются с ней.

Методы посева

Для выделения чистых культур возбудителей на первом этапе прибегают к их посеву на соответствующие среды, который проводится в специальных (стерильных!) условиях. В основном, перенос материала на среду осуществляется с помощью приспособлений, применяемых еще в 19 века великим Луи Пастером:

Бактериальной петлей;
Пастеровской пипеткой;
Стеклянной палочкой.

Конечно, многие инструменты за 2 столетия претерпели изменения, на смену пришли пластиковые стерильные и одноразовые, однако и старые не остались в прошлом, продолжая и поныне служить микробиологической науке.

Первый этап получения колоний требует соблюдения определенных правил:

Посев осуществляется над спиртовкой в боксе, предварительно обработанном дезинфектантами и кварцеванием, или в ламинарном шкафу, обеспечивающем стерильность в рабочей зоне;
Одежда медработника, перчатки и среда также должны быть стерильными, поскольку обратное мешает выделению изолированных штаммов;
Работать в боксе нужно быстро, но аккуратно, нельзя разговаривать и отвлекаться, при этом – необходимо помнить о личной безопасности, ведь материал может быть заразным.

Выделение штаммов и изучение чистых культур

Посев мочи, промывных желудочных вод и других жидких материалов тоже имеет свои особенности, где для получения чистой культуры, жидкость сначала следует центрифугировать (условия – асептические!), а уж затем сеять, причем не саму жидкость, а ее осадок.

Культивирование и выращивание колоний осуществляют на чашках Петри или помещают сначала в жидкую среду, разлитую в стерильные флакончики, а затем изолированные колонии еще раз высевают, но уже на скошенный агар и помещают материал на сутки в термостат. Убедившись в чистоте полученной культуры, штаммы переносят на предметное стекло, делают мазок и окрашивают по Граму (чаще всего), Цилю-Нильсену и др. и для дифференцировки изучают морфологию микроба под микроскопом:

Размер и форму бактериальной клетки;
Наличие капсул, жгутиков, спор;
Тинкториальные свойства (отношение микроорганизма к окрашиванию)*.

*Читатель, вероятно, слышал о таком возбудителе, как бледная трепонема? Это – возбудитель сифилиса, а ее название (бледная) поэтому и появилось, что она плохо воспринимает краски и остается слегка розоватой при окрашивании по Романовскому. Микроорганизмы, невоспринимающие анилиновые красители называются грамотрицательными, а воспринимающие – грамположительные. Грамотрицательным бактериям придают розовый или красный цвет при окраске по Граму дополнительные красители (фуксин, сафранин).

Бак посев можно назвать древним анализом, однако его популярность от этого отнюдь не падает, хотя современная бактериология имеет возможности выделения не только штаммов, но и отдельной клетки из него, которая называется клоном. Однако для получения клона необходим специальный прибор – микроманипулятор, который в обычных лабораториях отсутствует, поскольку применяется, в основном, в научно-исследовательских целях (генетические исследования).

3) при выделении чистой культуры микробов в целях всестороннего изучения их свойств и определения видовой принадлежности и т.д.

Основным методом бактериологического исследования является посев анализируемого материала на питательные среды.

Посевом в микробиологической практике называется внесение в стерильную питательную среду какого-либо исследуемого материала для обнаружения в нем микроорганизмов.

Пересев - это перенос выращенных микроорганизмов в свежую стерильную питательную среду. При выполнении этих приемов требуется перенести тот или иной материал в питательную среду так, чтобы в нее из воздуха не попали посторонние микроорганизмы.

При посевах и пересевах с одной питательной среды на другую пользуются платиновой проволокой в виде петли или иглы, так как они допускают быструю стерилизацию на огне без повреждения металла. Платиновая проволочка накаливается очень быстро и так же быстро остывает. Над пламенем горелки иглу или петлю следует держать вертикально, чтобы проволока на всем протяжении была одновременно накалена докрасна. Затем слегка обжигают прилегающий к проволоке отрезок стеклянной или металлической палочки, в которую впаяна или заделана проволочка. Нужно строго следить за тем, чтобы до внесения в огонь стеклянная палочка была совершенно сухая, в противном случае стекло треснет и петля (или игла) из него выпадет. После нагревания до красного каления платиновая проволочка будет простерилизована. Лишь после такой стерилизации петлю или иглу можно вносить в пробирку с бактериальной культурой. Но прежде чем захватить ею бактериальную культуру, петелькой или концом иглы касаются части среды, свободной от микробного налета (если имеют дело с твердой средой), или внутренней стенки пробирки с жидкой средой. Это делается для того, чтобы удостовериться, что прокаленная петля достаточно остыла. Если проволочка имеет еще высокую температуру, то среда на данном участке расплавляется или кипит. Этим создается гарантия, что бактерии, снятые проволочкой, будут вполне жизнеспособны.

Посев на жидкую питательную среду (бульон)

Посев на жидкую питательную среду производится с помощью петли и стерильных трубок и пипеток.

Посев петлей (иглой). Прокаленной петлей или иглой, которую держат в руке между указательным, средним и большим пальцами (подобно карандашу или ручке), захватывают небольшое количество налета с поверхности сырья или каплю посевного материала из исследуемой жидкости, слегка погрузив в нее петлю. В левой руке держат пробирку (или колбочку) с питательной средой. На пламени горелки обжигают верхнюю часть пробирки (колбы) непосредственно у пробки. При этом сосуд со средой слегка наклоняют, но так, чтобы жидкость не выливалась и не смачивала пробки и краев посуды. Мизинцем и безымянным пальцем правой руки вынимают пробку из пробирки и зажимают ее до конца посева между этими пальцами и ладонью так, чтобы входящая в пробирку часть пробки не прикасалась к руке. Все манипуляции производят над пламенем горелки. В открытую и наклоненную пробирку вводят петлю с посевным материалом, слегка погружая петельку в среду и размазывая внесенный материал по стенке пробирки, осторожно размешивают петлей питательную среду. Закончив посев, не изменяя наклонного положения пробирки, закрывают ее ватной пробкой, обжигая в пламени горелки конец пробирки и ту часть ватной пробки, которая входит в пробирку. Лишь после этого возвращают пробирку в вертикальное положение. По окончании посева петлю немедленно стерилизуют в пламени горелки.

Техника посева петлей бактериологического материала из одной пробирки в другую почти аналогична. Обе пробирки - с культурой и стерильной питательной средой - держат в наклонном положении между большим и остальными пальцами левой руки (рис. 56, положение а). При этом пробирку с культурой микробов следует держать ближе к себе. Вся работа, как и в первом случае, выполняется под защитой пламени горелки, а наклонное положение пробирок предохраняет питательную среду от оседания в нее микроорганизмов из воздуха.

Петлю держат между указательным и большим пальцами правой руки, а свободными пальцами извлекают из пробирок пробки, предварительно внеся их на несколько секунд в пламя горелки (положение б). Извлекать ватные пробки нужно плавно, не рывком, а легким винтообразным движением.

Прокалив на огне петлю и подвергнув легкому обжигу верхние концы пробирок, вводят внутрь пробирки с культурой петлю, забирают петлей ничтожную часть бактериального материала (положение в) и переносят его во вторую пробирку со стерильной средой (положение г). Когда посев закончен, края пробирок и нижние концы ватных пробок проводят сквозь пламя горелки и легким движением закрывают пробирки пробками (положение д). Петля стерилизуется и откладывается (положение е). Работать нужно быстро, но избегая резких движений, вызывающих усиленное движение воздуха.

Посев на плотную среду

Посев уколом делают в желатиновые среды с целью выявления протеолитической способности микробов. Засеянные пробирки выдерживают 2-3 дня при температуре 22-23 °С, наблюдая за быстротой и формой разжижения столбика желатиновой среды. У различных видов микробов форма разжижения желатины различна: послойная, в форме гвоздя, чулка и пр. Затем пробирки опускают в холодную воду. Если среда в пробирке с микроорганизмом остается жидкой, а среда в контрольной пробирке застынет, это значит, что микроб обладает протеолитической способностью.

Можно установить протеолитическую способность микроба, фиксируя также образующиеся при распаде белка продукты - сероводород, аммиак, индол, являющиеся показателями протекающего процесса гниения. Наличие этих продуктов определяют с помощью цветных реакций. Сероводород дает почернение полоски фильтровальной бумаги, смоченной раствором основного уксуснокислого свинца, благодаря превращению H2S в PbS. Появление серебристой побежалости (оттенка) свидетельствует об образовании при гниении тиоспиртов и меркаптанов.

Раствор основного уксуснокислого свинца готовят приливанием к 10%-ной взвеси РЬ(СН3СОО)2 10%-ного раствора едкого натра до растворения осадка. Полоски фильтровальной бумаги пропитывают этим раствором, высушивают при комнатной температуре и хранят в склянке с притертой пробкой. При проведении опыта подготовленную полоску фильтровальной бумаги смачивают стерильной дистиллированной водой и помещают в пробирку с изучаемой культурой между ватной пробкой и стенками пробирки. Полоска бумаги должна свободно свешиваться внутрь пробирки, а не касаться ни ее стенок, ни среды. Пробку сверху плотно закрывают целлофановым колпачком (можно надеть резиновую соску), что предотвращает улетучивание выделяющихся при гниении газов.

Для выявления в продуктах гниения аммиака в пробирку с культурой микроорганизма аналогично помещают влажную красную лакмусовую бумажку, синеющую от присутствия NH3.

Индолообразование выявляется добавлением к 5 мл бульонной культуры микроба 5 мл специфического раствора Эрлиха и 2,5 мл насыщенного раствора пиросульфита калия (K2S2O7). При наличии индола появляется интенсивное красное окрашивание. Реактив Эрлиха приготовляют растворяя 4 г парадиметиламидобензальдегида в 30 мл 96%-ного спирта-ректификата, приливая затем сюда же 80 мл концентрированной соляной кислоты.

Посев уколом в высокий столбик сахарного агара дает возможность выявить у микроорганизмов степень анаэробности. Аэробы растут только в верхней части укола; анаэробы, наоборот, - только в нижней; факультативные анаэробы - по всему уколу. Укол должен проходить по возможности посредине столбика среды в пробирке на равном расстоянии от краев и доходить почти до дна. Внесение материала в толщу питательной среды можно также производить после предварительного ее расплавления и вносить материал в остуженную до 45 °С, но еще жидкую среду, а затем дать ей остыть.

Техника посева в чашки Петри

Питательный агар в колбах, флаконах, пробирках расплавляют в кипящей водяной бане. Сосуд со средой следует погружать в баню так, чтобы уровни среды и воды совпадали или уровень среды был чуть ниже уровня воды в бане. Затем среде дают несколько остыть - до 50-60 °С и разливают ее в стерильные чашки Петри, установив их на горизонтальной поверхности. Техника розлива среды в чашки Петри следующая (рис. 58). Над пламенем горелки, слегка наклоняя сосуд, содержащий расплавленный агар, вынимают пробку и края сосуда обжигают. Левой рукой приподнимают с одной стороны крышку чашки и, вводя в образовавшийся просвет открытый конец сосуда со средой, выливают среду в чашку. Совсем открывать чашку Петри нельзя. Ее лишь слегка приоткрывают с одной стороны. Это предохраняет среду от оседания в нее микробов из воздуха.

Опустив крышку и наклоняя чашку в разные стороны, распределяют налитый в нее агар ровным слоем по всему дну. Когда агар застынет, чашки ставят в термостат вверх дном для подсушивания и удаления конденсационной воды. Посев на агаровые среды в чашки Петри производится штрихом при помощи платиновой петли или стеклянным шпателем.

При посеве штрихом платиновой петлей забирают небольшое количество материала и легко проводят по поверхности агара, нанося ряд линий. При этом один край крышки чашки Петри следует лишь осторожно приподнять левой рукой, не дотрагиваясь пальцами до нижнего ранта. Закрыв первую чашку Петри той же петлей, не набирая материала, наносят штрихи на поверхность агара во второй, затем в третьей чашке с соблюдением тех же предосторожностей, предупреждающих попадание микробов из воздуха на поверхность среды.

После посева чашки ставят в термостат вверх дном на 24 ч и по истечении указанного срока рассматривают выросшие колонии микроорганизмов. В первой чашке, куда попало много материала, может получиться сплошной рост, во второй и третьей чашках вырастут единичные изолированные колонии. Каждая колония представляет собой обособленное скопление однородных микробов.

При посеве на твердую среду можно пользоваться и одной чашкой Петри, разделив ее на несколько секторов. Для этого на стекле с нижней стороны дна чашки наносят линии карандашом для стекла. Каждый отдельный сектор в данном случае будет заменять соответствующую чашку Петри.

При посеве шпателем на поверхность агаровой среды наносят платиновой петлей одну небольшую каплю исследуемого материала. Затем прокаленным и остуженным шпателем растирают эту каплю по всей поверхности среды, совершая легкие зигзагообразные движения во все стороны. Этим же шпателем засевают вторую и третью чашки.

Посев жидких материалов на твердую среду в чашки Петри пипеткой. Определенный объем исследуемой жидкости (обычно 1 или 0,1 мл) вносят в стерильную чашку. Затем в эту же чашку вливают расплавленный и остуженный до температуры 45 °С мясопептонный агар и плавными движениями чашки на горизонтальной плоскости тщательно перемешивают среду с исследуемой жидкостью. После застывания агара чашку Петри, как обычно, перевертывают вверх дном и ставят в термостат. Выращивание микробов производят 24-48 ч при температуре, оптимальной для изучаемого вида микроорганизмов, чистую культуру которых выделяют.

Каждая микробная клетка, а также спора, попавшая в питательную среду из посевного материала, при застывании среды оказывается закрепленной на одном месте, начинает развиваться и дает колонию. Чем меньше колоний выросло на чашке и чем изолированнее одна от другой эти колонии, тем успешнее можно выделить чистую культуру микроба. Поэтому при посевах желательно брать посевной материал, содержащий как можно меньше микроорганизмов. С этой целью производят разбавление (разведение) материала.

Для разведения исследуемых материалов необходимо иметь достаточное количество стерильных пипеток емкостью 1 мл и стерильную воду в пробирках по 9 мл.

Техника разведения следующая (рис. 59). После тщательного перемешивания исследуемой пробы стерильной пипеткой отбирают 1 мл материала и вносят в пробирку с 9 мл стерильной воды. Работу проводят над пламенем горелки с соблюдением правил стерильности. Получают первое разведение в 10 раз. Осторожно перемешивают содержимое пробирки. Перемешивание можно произвести повторным всасыванием жидкости в пипетку и выпусканием ее обратно в пробирку. Из пробирки с первым разведением второй стерильной пипеткой переносят 1 мл в следующую пробирку, содержащую 9 мл стерильной воды. Получают второе разведение (в 100 раз). Эту операцию при необходимости производят и дальше, получая третье, четвертое, пятое разведения. Производить разведение более чем в 100 000 раз (пятое разведение) не рекомендуется, так как при слишком больших разведениях изучаемые микробы могут не попасть в отбираемую пробу, особенно в том случае, если количество их составляло относительно небольшой процент по отношению ко всей микрофлоре субстрата.

Выделение чистых культур аэробных микроорганизмов

Из каждого разведения 1 мл жидкости высевают в стерильную чашку Петри, заливая 10-15 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С мясопептонного агара. Посев выращивают в термостате при температуре, оптимальной для изучаемых микроорганизмов, в течение 24-48 ч. Просматривая чашки Петри после выращивания, отбирают ту чашку, в которой выросшие колонии оказываются наиболее изолированными.

Однородность по внешнему виду выросших на чашке колоний свидетельствует о том, что посевной материал содержал микроорганизмы одного вида. Если же колонии оказываются неоднородными, то, следовательно, в посевном материале находилась смесь разнообразных микробов. Все выросшие колонии в этом случае нужно разбить на группы по однородности и изучать каждую группу однородных колоний в отдельности.

Из однородных колоний в чашке Петри выбирают одну изолированную колонию, из нее делают мазок и устанавливают чистоту культуры. Об этом будет свидетельствовать морфологическая однородность микробных клеток, наблюдаемых в поле зрения микроскопа. Оставшуюся часть колонии прокаленной и остуженной петлей с соблюдением правил стерильности пересевают (отвивают) на поверхность скошенного агара. Выросшая на косом агаре культура также должна давать однородный рост и при микроскопировании однородные клетки. В противном случае пересевы колоний с чашек Петри повторяют до тех пор, пока не убедятся в чистоте выделенной культуры.

Выделение чистых культур анаэробных микроорганизмов

Одним из основных условий при культивировании анаэробных микробов является удаление из питательной среды молекулярного кислорода, оказывающего токсическое действие на анаэробные культуры. Вторым обязательным условием, обеспечивающим выделение анаэробов из исследуемого субстрата, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду.

Изолированные колонии анаэробных микробов можно получить в глубине плотной питательной среды - в трубках Вейона. Средой накопления для анаэробов является среда Китта-Тароцци. Уже указывалось, что для создания анаэробных условий при приготовлении среды Китта-Тароцци на дно пробирок помещают кусочки печени. Можно использовать и круто сваренный белок куриного яйца.

Анаэробные микроорганизмы являются спорообразующими, поэтому при исследовании материалов, где предполагается наличие вегетативных форм, необходимо засеянные пробирки прогреть в водяной бане при 80 °С в течение 30 мин.

Посевы выдерживают в термостате при 37 °С в течение 5 суток. При наличии роста отмечают наступившее в среде Китта-Тароцци изменение: помутнение или помутнение и газообразование; из проросших пробирок делают мазки и окрашивают по Граму. Материал для мазков берут пастеровской пипеткой, которую опускают до дна пробирки.

Высев из среды Китта-Тароцци можно производить и в чашки Петри, применяя метод последовательного разведения. В этом случае посевы необходимо выдерживать в анаэростатах или эксикаторах, на дно которых помещаются кислородпоглощающие вещества (смесь гидросульфита натрия с двууглекислой содой или щелочной раствор пирогаллола).

Квалифицированное бактериологическое исследование (бак посев) позволяет оценить весь состав аэробной и микроаэрофильной микрофлоры в исследуемом материале. Каковы методики проведения этого лабораторного анализа? Они могут варьировать в зависимости от цели диагностического исследования, исследуемого материала, подозрения на тот или иной возбудитель.

Следует отличать бак.посев от других видов бактериологического исследования, в частности от микроскопии мазка. Задача микроскопии – визуально обнаружить клетки микроорганизмов в исследуемом материале (мазке). Задача посева – получить колонии возбудителя на питательных средах, и тем самым обнаружить его. Микроскопия – экспресс-метод, позволяет довольно быстро получить результаты. Однако точность этого метода (чувствительность) гораздо ниже, чем бак.посева. Микроскопия позволяет лишь примерно определить тип возбудителя – кокки, палочки, дрожжи. Бак. посев в свою очередь позволяет точно определить вид микроорганизма, его количество, и чувствительность к лекарственным препаратам.

Содержимое абсцессов, папул, везикул и т.д. отбирают обычно шприцем, соблюдая правила асептики. Жидкий материал (мочу, сперму, грудное молоко и т.д.) отбирают в стерильные контейнеры с резьбовой крышкой. Такой материал должен быть доставлен для исследования в лабораторию в тот же день, его хранение не допускается. Пересылка материала для бак посева должна осуществляться в термоизолированных сумках.

В бактериологической лаборатории проводят посев клинического материала на питательные среды, после чего посевы инкубируют в определенных условиях. Важно, чтобы использовались качественные стандартизованные питательные среды, предпочтительно известных производителей. В различных диагностических лабораториях используют различные алгоритмы посева. Оптимально, когда материал высевают на набор различных сред, обеспечивающих рост всех групп патогенных микроорганизмов. Обычно используют специальные дифференциально-диагностические среды, на которых опытный микробиолог практически сразу может определить вид возбудителя, и дополнительные тесты уже не нужны. Хотя такие среды довольно дороги, они позволяют существенно сократить время исследования. Если вид микроорганизма таким образом определить не удается, проводят его идентификацию с помощью дополнительных биохимических тестов.

Условия выращивания бактериологических посевов также играют большую роль. Должна поддерживаться оптимальная температура; определенные микроорганизмы требовательны к содержанию углекислого газа, а некоторые нуждаются в анаэробных (безкислородных) условиях. Все эти факторы должны учитываться специалистами лаборатории.

Когда выращивание посевов закончено, определяют вид выделенных микроорганизмов, и подсчитывают количество выросших колоний. Это дает представление о количественном содержании микроба в клиническом материале, что имеет определенное диагностическое значение.

Чувствительность к антибиотикам обычно определяют диско-диффузионным методом. На поверхность питательной среды вносят взвесь микробных клеток, а сверху помещают диски, пропитанные антибиотиками. Посевы выращивают, и затем учитывают зоны подавления роста микроба вокруг дисков. Измеряют диаметр этих зон, и в зависимости от этого относят микроорганизм к одной из трех групп – чувствительный, устойчивый, промежуточный.

Наборы антибиотиков, к которым определяется чувствительность, варьируют у разных лабораторий. Обычно используют разные наборы для разных групп микроорганизмов – грамположительных и грамотрицательных. Помимо этого, у выделенных стафилококков определяют метициллинрезистентность (выявление МРС), наличие которой свидетельствует о резистентности ко всем бета-лактамным антибиотикам. У грамотрицательных микроорганизмов (родов Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas и др.) выявляют наличие БЛРС (бета-лактамаз расширенного спектра), что свидетельствует о резистентности ко всем пенициллинам и цефалоспоринам I-IV поколений. Все эти сведения указываются в ответе лаборатории.

Следует отметить, что обнаружение того или иного микроба не всегда говорит о его этиологической роли. Хотя бак.посев является ценнейшим диагностическим методом, диагноз должен ставиться на основании комплекса анамнестических и диагностических данных.

В результате такого исследования врач и пациент получают наиболее полное представление о микробной флоре пациента, а также о средствах терапии – у выделенных микроорганизмов определяется чувствительность к антибиотикам (антмикотикам) и бактериофагам. Это наиболее достоверный и информативный метод микробиологического исследования, который позволяет назначить оптимальное лечение. Заменить такое исследование пока не могут даже самые современные методы вроде ПЦР.

Таким образом, время, затраченное на комплексное микробиологическое исследование, полностью себя оправдывает.

В этой статье мы коснемся вопросов бакпосева: где сдать, сколько делается по времени, расшифровка бак посева, важность бак посева при беременности.

При бактериологических посевах высеваются микроорганизмы из любого биологического материала. Исследовать можно спинномозговую жидкость, желчь, отделяемое глаз, половых органов и ран. Можно сделать бак посев крови, бак посев кала, бак посев мочи и бак посев мокроты, а также бак посев спермы (эякулята).

В норме кровь человека не содержит возбудителей. Подтвердить или исключить наличие бактерий в крови просмотром ее под микроскопом невозможно. Бак посев крови дает возможность размножить бактерии (при их наличии) сначала в жидкой питательной среде. Культуральная среда с образцом крови содержится при температуре +37° С до видимого роста бактерий.

Обычно этот процесс занимает 6-18 часов, а в случае видов, которые растут медленно, может длиться несколько дней. Затем культура исследуется под микроскопом - это первый шаг в идентификации вида микроорганизмов, которые могут присутствовать в крови (кокки, палочки и другие). При последующем посеве жидкой культуры на плотную среду производится более точная идентификация колоний - проводятся химические тесты и окончательно определяется вид микроорганизма. Бак посев крови нужно делать до начала лечения антибиотиками, поскольку они могут отсрочить или подавить рост бактерий, и это даст ложноотрицательный результат. Забор крови проводят на пике температуры – в это время количество бактерий в крови максимально. Лаборатории рекомендуют делать забор второго образца крови через 1 час после первого - этим повышаются шансы обнаружения бактерий.

Бак посев кала на тифопаратифозную группу назначают для выявления различных кишечных инфекций для идентификации возбудителя. В кишечнике в норме имеются условно-патогенные микроорганизмы - клебсиелы, энтеробактеры, грибы Candida, протей, стафилококки, клостридии, псевдомонады. Изменения нормальной микрофлоры кишечника (ее количественных или качественных характеристик) создают условия для развития условно патогенных бактерий, что сопровождается жалобами на боли в животе, метеоризмом, урчанием, неустойчивым стулом.

Бак посев кала на дисбактериоз проводят в случае заболеваний ЖКТ, которые сопровождаются рвотой и расстройством стула.

Нормальный состав кишечной флоры

Расшифровка бак посева кала:

I степень – отмечаются невыраженные изменения в аэробной части микробиоценоза, при этом посторонняя микрофлора отсутствует;

II степень - характерно изменения количества лакто - и бифидофлоры, параллельно проявляется количественные изменения эшерихий;

III степень характеризуется резким снижением и даже отсутствием бифидофлоры, лактофлоры и преобладают гемолитические стафилококки и дрожжеподобные грибы;

IV степень – характерны глубокие изменения микробиоценоза: увеличение условно-патогенных микроорганизмов, появление протея.

При сдаче кала на данный анализ необходимо помнить, что прием антимикробных препаратов и пробиотиков в значительной степени оказывает влияние на достоверность результата. Поэтому обследование рекомендуется производить через 3 недели после отмены препаратов.

Биоматериал для исследования берется до начала антибактериальной терапии, если же это контрольный анализ после лечения, то сдать его нужно не ранее двух недель после окончания курса антибиотиков. На анализ собирается средняя порция утренней мочи в стерильный одноразовый контейнер. Для обследования достаточно 3-5 мл мочи. Сбор мочи осуществляется после туалета наружных половых органов. Мочу необходимо доставить на исследование в течение 1-2 часов, если температура +18+20°С, в холодильной камере возможно хранение до 5-6 часов.

Расшифровка бак посева мочи:

Диагностическое значение имеет концентрация микроорганизмов в моче 104 - 105 КОЕ/мл. Однако бывают случаи, когда общий анализ мочи нормальный, жалоб обследуемый не предъявляет, а в моче выявлены патогенные микроорганизмы, например, кишечная палочка, которая могла появиться из-за нестерильных условий проведения исследования и нарушений при доставке. В таком случае бак посев мочи следует повторить.

При наличии хронического бронхита или часто повторяющихся острых затяжных бронхитах целесообразно сделать бак посев мокроты. Бак посев мокроты, как и любого другого отделяемого, сдается в стерильную посуду и доставляется в лабораторию, где проводится бак посев. Бак посев мокроты и одновременное определение чувствительности к антибиотикам позволит рационально назначить лечение, сократить его сроки при максимальной эффективности.

В каких случаях назначается бак посев спермы?

Мужчинам при воспалительных заболеваниях урогенитальной области, при бесплодии обязательно назначается спермограмма и бак посев спермы (эякулята). Бак посев эякулята (спермы) позволяет выявить наличие патогенного агента и вовремя начать лечение.

Существуют правила сдачи бак посева спермы:

в течение 3-7 дней исключить половые связи;
запрещен прием алкоголя в течение 3-4 дней;
бак посев спермы (эякулята) назначается через 2 недели после приема антибиотиков;
эякулят для бак посева собирают в стерильный контейнер с питательной средой, который нужно получить в лаборатории;
утром необходимо помочиться, тщательно вымыть руки с мылом, произвести туалет наружного отверстия мочеиспускательного канала тоже с мылом. После этого головку полового члена и крайнюю плоть высушить стерильной салфеткой. Сбор спермы для бакпосева производится путем мастурбации, касаться стенок контейнера нельзя;
сперму нужно доставить в лабораторию в течение 3 часов после сбора. Если сперма для бак посева не может быть доставлена за это время, то до момента доставки она должна храниться в холодильнике, но не более 24 часов;
если проводится бак посев эякулята с целью исследования на уреа- и микоплазмы, материал помещается во флакончик со специальной транспортной средой для микоплазм. Также имеется среда для культивирования трихомонад. Об этом нужно знать и предупредить в лаборатории, когда берете стерильный контейнер для бак посева спермы.

Обычно через 7 дней бак посев эякулята будет готов.

Бак посев при беременности

В любой отрасли медицины – пульмонология, дерматология, урология, андрология, венерология, гинекология используется бак посев при обследовании.

Наиболее часто этот метод обследования использует гинекология. Бакпосев назначается беременным женщинам в обязательном порядке, если они при планировании беременности не делали этот анализ. С наступлением беременности в связи с тем, что организм женщины становится уязвимым, появляется необходимость регулярно наблюдаться у врача. За время беременности женщина должна несколько раз сдать анализы, что является необходимым для выявления различных заболеваний, которые негативно могут повлиять на течение беременности и сказаться на здоровье малыша. В списке обязательных анализов числится и бакпосев при беременности – в этот период исследуется материал из влагалища, носа, зева и моча.

Бак посев из влагалища при беременности является необходимым и важным обследованием. Забор материала на бакпосев при беременности проводится очень аккуратно, этой процедуры не стоит бояться. Патогенная флора влагалища (стафилококк, хламидии, микоплазмы, уреаплазмы, трихомонады) может вызвать нарушения в формировании и развитии плода и быть причиной заболеваний, опасных для его жизни. Бак посев при беременности позволяет выявить во влагалище грибок рода Кандида, который поддерживает хроническое воспаление тканей, которые в родах будут наиболее подвержены разрывам. Таким образом, бак посев при беременности позволяет выявить латентно протекающие заболевания, потенциально опасные как для матери, так и для ребенка. При необходимости проводится лечение, а контрольный бак посев мазка после лечения назначается не ранее, чем через 2 недели после окончания приема антибактериальных препаратов.

Обязательным обследованием является бакпосев из зева и носа при беременности. Делается этот анализ сразу при взятии на учет в женской консультации. Забор материала проводится медперсоналом в поликлинике или непосредственно в лаборатории. Бак посев из зева и выявление носительства золотистого стафилококка помогает вовремя принять меры: просанировать беременную женщину и предупредить заражение ребенка. Есть еще причина, по которой важно и нужно сделать бак посев при беременности на золотистый стафилококк – он является основной причиной гнойного мастита и послеродового сепсиса, поэтому носительство его требует лечения перед родами.

Особое значение уделяется бак посеву мочи при беременности. Известно, что при беременности нарушается пассаж мочи по мочевыводящим путям и создаются условия для размножения патогенной флоры, а бак посев мочи при беременности и расшифровка бак посева позволяет врачу вовремя обнаружить патологию, принять необходимые меры и не пропустить развитие пиелонефрита, который часто встречается у беременных. Бакпосев мочи при беременности сдается два раза: во время постановки на учет и в сроке 36 недель беременности. В некоторых случаях приходится сдавать больше, если к этому есть показания: заболевания почек, появление белка и лейкоцитов в клиническом анализе мочи. Чтобы анализ был достоверным, нужно соблюдать процедуру сбора мочи. Необходимо тщательно подмыться, для исключения попадания выделений из влагалища ввести в него кусочек ваты, первую порцию утренней мочи выпустить в унитаз и собрать среднюю порцию мочи в стерильную баночку и доставить в лабораторию. При любом бак посеве обследование проводится до приема антибиотиков или по окончании их приема через 3 недели. Часто возникающий вопрос – бак посев, сколько раз делается? После лечения проводится однократный контрольный анализ с интервалом в 2-3 недели.

Бакпосев. Где сдать?

У многих возникнет этот вопрос. Обычно все необходимые обследования назначает врач. В таком случае правильно и грамотно будут назначены все обследования и вас проинформируют, в какой лаборатории это можно сделать. Но можно самостоятельно обратиться в лабораторию и сдать бакпосев. Лаборатория, которая занимается бакпосевами, имеет стерильную медицинскую посуду для забора материала, обученный медицинский персонал, который может взять мазки у женщин и мужчин и расскажет, как правильно подготовиться к исследованию и сдать материал для исследования.

Как вариант, можно предложить сдать бак посев в ИНВИТРО - независимой лаборатории. Это сеть четырех высокотехнологичных лабораторий в городах: Москве, Санкт-Петербурге, Челябинске и Новосибирске. Независимая лаборатория ИНВИТРО применяет современное новейшее оборудование и использует тест-системы ведущих мировых производителей. Она предлагает большой спектр исследований: анализы крови и мочи (клинические и биохимические), цитологические исследования, определение аллергенов и онкомаркеров, ПЦР, бак посев. ИНВИТРО – проводит широкий спектр лабораторных исследований.

Всех интересует вопрос на тему бак посев, сколько делается по времени? Через 5-8 дней (в зависимости от исследуемого материала) вы получите результаты бак посева. За это время идентифицируются микроорганизмы и проводится антибиотикограмма. Обычно результаты бак посева выдаются на руки и в бланке обозначены результаты бакпосева и норма его. Результат исследования также можно получить по электронной почте, факсу, телефону.

Расшифровка бакпосева проводится микробиологом в лаборатории, и врачу выдается заключение; в случае, если плохой бак посев - назначается лечение.

Что значит плохой бак посев? Имеются определенные допустимые нормы присутствия тех или иных микроорганизмов, которые не вызывают субъективных ощущений и заболеваний. Так, например, уреаплазмы и микоплазмы могут входить в состав нормальной микрофлоры человека, и лечение требуется лишь тогда, когда имеются большая концентрация микробов и признаки воспаления.

Существует понятие колониеобразующие единицы (КОЕ) – это одна микробная клетка, из которой в последствие вырастает колония. В этой единице и указываются результаты бак посева. Для каждого метода посева существуют стандарты, указывающие клинически значимые концентрации микроорганизмов, которые могут вызвать заболевание. При превышении колониеобразующих единиц лаборатория сразу выполняет бакпосев и чувствительность к антибиотикам. Такой бакпосев с определением чувствительности к антибиотикам необходим для рационального проведения антибиотикотерапии.

Читайте также: