Технология создания гмо растений
Обновлено: 05.10.2024
- Растения-ГМО: как это делается
- Растения-ГМО: практическое применение
- Растения-ГМО: проекты в перспективе
Растения-ГМО: как это делается
Наверное, каждый из вас слышал о грозном трудноизлечимом заболевании — раке — которое может поражать многие органы у человека и животных. И возникает вопрос: могут ли растения болеть раковыми заболеваниями?
Болеют ли растения раком?
Тем не менее, растения болеют раком. Его вызывают бактерии из семейства Ризобиевые (Rhizobiacae), которые относятся к роду агробактерий (Agrobacterium). На месте инфекции образуется неорганизованно делящаяся масса клеток, похожая на каллус (рис. 1). Если агробактерии убить при помощи антибиотиков, то рост опухоли по-прежнему продолжится. Возникает злокачественная опухоль, рост которой растение не может контролировать.
При анализе содержания гормонов в опухоли оказывается, что уровень и ауксинов, и цитокининов повышен. Каждая клетка опухоли способна самостоятельно производить эти гормоны и больше не зависит от остальных частей растительного организма.
В-третьих, Ti- и Ri-плазмиды (по сравнению с другими плазмидами бактерий) имеют большие размеры: около 200–300 тыс. пар оснований. Это не позволяет при помощи стандартных методик отделить ДНК этих плазмид от ДНК нуклеоида, что создаёт определённые трудности в работе молекулярных биологов с плазмидами.
Какие же гены несут в себе Ti-плазмиды? Для заражения растений наиболее важным оказывается Vir-район (от англ. virulence — способность поражать [растения], патогенность), в котором закодировано довольно много генов. Постоянно работают только два гена: VirA и VirG. Белок VirA — это рецептор на особое вещество фенольной природы — ацетосирингон. Ацетосирингон выделяется при повреждении клеток растений. Белок VirA реагирует на ацетосирингон и передаёт сигнал на белок VirG, который активирует все остальные гены Vir-района. В результате: 1) клетки агробактерий плывут к месту поражения (ориентируясь по увеличению концентрации ацетосирингона); 2) Ti-плазмида начинает размножаться и передаваться другим бактериям того же вида; 3) появляются другие белки-продукты генов Vir-области (рис. 2).
Белок VirD1 совместно с белком VirD2 находят в Ti-плазмиде определённые участки, состоящие из 25 пар нуклеотидов, и разрезают их, перебрасывая ковалентную связь с конца ДНК на белок VirD2. У Agrobacterium tumefaciens таких участков два: они ограничивают так называемый Т-район (от англ. transferred — переносящийся). Одна из цепей ДНК отделяется и уходит; таким образом, в Ti-плазмиде возникает брешь. Специальная система репарации ДНК застраивает брешь новой цепью ДНК, и из той же Ti-плазмиды можно ещё раз вырезать Т-район, Ti-плазмида в целом сохраняется.
На поверхности клетки агробактерии при помощи разнообразных белков VirB образуется аппарат для переноса ДНК из одной клетки в другую. Именно белки VirB отвечают за перемещение комплекса VirD2 с одноцепочечной ДНК из клетки агробактерии в клетку растения. Белки VirE2 также перемещаются в клетку хозяина.
Что содержится в Т-районе
Гены, которые содержатся в Т-районе, в самой клетке агробактерии не работают, поскольку у них есть только эукариотические промоторы. Два из этих генов отвечают за биосинтез ауксинов: iaaH и iaaM. Ещё один ген — iptZ — кодирует ключевой фермент синтеза изопентениладенина (одна из форм цитокининов). Таким образом, попав в геном растения, Т-ДНК вызывает синтез как ауксинов, так и цитокининов (рис. 3). При этом клетки растения-хозяина начинают неорганизованно делиться, образуя опухоль.
Получение генетически модифицированных растений при помощи агробактерий
Итак, задача практической работы с Ti-плазмидой решена. Но как понять, произошёл ли перенос ДНК из Т-района? Ведь теперь в клетки не попадают гены биосинтеза ауксинов и цитокининов, и опухоль образоваться не может.
На всех этапах работы хорошо бы посмотреть, в какие именно клетки попала искусственная Т-ДНК. Для этого в Т-район вводят ещё один ген — репортёрный. Основное требование к нему — продукт гена не должен встречаться в обычных растительных клетках и должен легко и быстро выявляться. В качестве репортёрных на сегодня чаще всего используют два гена: глюкуронидазы (из бактерий) и зелёного флуоресцирующего белка (из медузы). Глюкуронидаза даёт цветную реакцию с синтетическим веществом, при которой генетически модифицированные клетки окрашиваются в тёмно-синий цвет (рис. 4). Есть только один недостаток: клетки при таком окрашивании погибают. Зелёный флуоресцентный белок светится при освещении светом с определённой длиной волны, и клетки не погибают (рис. 5).
И лишь на последних этапах проверяют, работает ли ген интереса (как правило, приходится проводить многочисленные анализы на наличие определённых последовательностей ДНК, РНК и на сам белковый продукт гена интереса).
Читайте также: