Для идентификации сортов пшеницы используют
Обновлено: 15.09.2024
Союз Советских Социалистических Заеспубяик.(22) Заявлено о 1 ю.72.с присоединением зая 1827284 51) М Гвсударатаеиньй иемитетВеаата: йтиииатроа СССРиа делам изебретенийоткрыт 016, 01 Нблнковао 25 т.ть. Бюллетеньи (53а опубликования описания 28,04,76 Г. Кокарев, И, И, Гаврилюк и И. К, Губарев 2) Авторы изобретения дена Ленина научно- иеследовательский инстнуАтеиневвдства им; И. И. Вавилова(1) Заявит СНОСОВ СОРТОВОЙ ИБЕЙХИФИКАЙИИ ЗЕ И МУХИ ЛЮЕНИЦЫствляют следующимлиадина навеску муки изилн 1/3 зндосперма зали М мочевины, Экстрагиектрофорезу в нолиакИзобретение относится к сельскому хозяйству, а)именно к биохимии растений, н может быть использовано для определения сортовой идентификации зер.на и муки пшеницы,Известный способ сортовой идентификации зерна бн:муки пшеницы, заключающийся в получении злект.рофоретйческого спектра глиадина в полиакриламндном геле, не позволяет осуществить. точную идентификацию электрофоретических компонентов глиадина, без чего нельзя прочесть электрофоретическнй Юспектр и составить точную белковую характернсти.ку сорта.Цель изобретения . точное и быстрое определениесорта,Для этого по предлагаемому способу электрофо 1 ареграмму глиадийов определяемого сорта сопостав.ляют с электрофоретнческим спектром смеси глн.адинов типйчных представителей геномов А, В н Лпшеницы, по которому составляют формулу глиа.дина определяемого сорта и сортовую принадлеж. 20Ность его оценивают по каталогу сортовых формул,составленному также по эталонному спектру смесиглиадннов,Ра чертеже изображена структурспектра. 25 Йредлагаемьтй способ есущеобразом,Для выделения белка годного исследуемого зернавают пятикратним ебьемомруемый белок подвергают злрнламидном геле.Иолучеиную электрофореграмму глнадинов определяемого сорта сопоставляют с электрофоретическим спектром смеси тлидинов,Для юлучеиня эталонного злектрофоретическо.го спектра отбирают наиболее типичных нредстави.гелей источников геномов пшеницы, а именно полинии генома А.Т,1 оеоФ,ьс тгпт К 27141 (номеркаталога ВИР), по линии генома ВАе. аеИойевК.197, по лйнии генома Д-Ае. а(рач,ао аа К 109Берут по 100 )белка от каждого из этих образцов,смешивают и проводят электрофорез в полиакрил.амндном геле.Все электрофоретические компоненты сгруппнпонаны по фракциям ск, )а, з и ш, которыерасололожены в направлении от катода к старту. Впределах каждой фракции в том же направлениизанумерованы лозицнн компонентов. Максимальноечисло позиций для указанных фракций равно соот. ,507271 глиапина, При наличии спектров разного типа сос.тавляют соответствуюшие им формулы глиадина иопределяют процент их зерен в образце,При идентификации неизвестного образца сначалабопределяют его принадлежность к виду пшеницы(твердая или мягкая) по наличию или отсутствиюв а .глиадинах компонентов 8 и 9. Затем по каталогу сортовых формул соответственно твердых илимягких пшениц устанавливают сортовую принадлеж.И 1ность основной массы зерна и примесей других сортов, если таковые имеются,Для ускорения оценки образцов анализ ведут вдва этапа, На первом этапе в анализ берут 12-24 зер.на (одна закладка в аппарат) . Если спектры глиади.на по зернам однородны и совпадают со спектромсуммарного образца, то необходимость анализа остальных 80.82 зерен отпадает.Для быстрой оценки сортовой принадлежностизерна ведется только суммарный анализ образца.По такому же принципуестественно, определяют1 сортовую принадлежность муки.Предлагаемый способ достаточно быстрый и тре.бует для анализа всего лишь треть эндослерма. Кроме того, позволяет при необходимости определятьналичие в образцах примеси других сортов с точф 1 ностью до одного зерна на 100 зерен анализируемого образца,Ниже приведены примеры определения сортовойпринадлежности неизвестного образца зерна или ЗО муки (Х 1) и определение сортовой чистоты зерна(Я 2).П р и м е р 1. Полученные электрофоретическиеспектры глиадина неизвестных образцов зерна и мукирасшифровывают и записывают в виде формул, 3 которые приведены в табл. 1.Таблица 1 11 о 11 оОбряд. 246891011(1) 23489 1 4567 2 (1) (2) 567 3 (1) (2) 567 1234 123 1234 1234 124 14 345 (6) 7- ,3. 4 12567 1234 По наличию в со -глиадине компонентов 8 и 9 образцы 1, 2 и 3 отнесены к виду мягкой пшеницы и 60 по каталогу сортовых формул мягкой пшеницы идентифицированы соответственно как сорта Мироновская 808, Аврора и Кавказ, Вц 1 - глиадине образ.ца 4 компоненты 8 и 9 отсутствуют.По каталогу сор.товых формул твердой пшеницы образец идентифи.цирован как сорт Харьковская 46. Как видно иэ при.мера, предлагаемый способ позволяет различать иидентифипировать паже такие близкие по всем признакам сорта как Аврора и Кавказ.;П р и м с р . Для анализа взято 100 зерен за.91 3ветственно 7, 4, 4 и 12. Исходя из этого, спектр. 1эталон записывают в виде следующей формулы:4.1234567 ф 1234 1 1234 Ф 123456789101112. Отдельные компоненты этого спектра используют в качестве маркеров того или иного генома, Вчастности, компоненты 8 и 9 ю .глиадинов являют.ся маркерами генома Д.Сортовые формулы составляют путем сопостав.ления элекгрофоретических спектров глиадина определяемых образцов со спектром. эталоном. В сор.товую формулу вносятся номера тех компонентов,которые имеются в спектре глиадина определяемо.го сорта, Наличие в со -глиадинах компонентов8 и 9 характерно для всех сортов мягкой пшеницы.Они отсутствуют у сортов твердой пшеницы и служат надежным признаком различения твердых имягких пшениц. Сортовыми признаками являютсяраспределение компонентов по позициям и количественное соотношение их в пределах фракций. В сор.товых формулах номера интенсивных компонентовподчеркивают, слабых . берут в скобки. Возможнысдвоенные компоненты, Они обозначаются двумяточками над номером позиции,В случае невозможности идентификации какого.либо компонента путем совмещения спектров при.меняют метод белковых смесей или метод сплит.Для серийных анализов используют специально иэ.готовленные шаблоны спектра-эталона с коррекцией на изменение пути пробега компонентов в зависимости от условий электрофореза./Каталог сортовых формулсоставляютна основеанализа глиадина образцов оригинальных сортов. Наанализ берут 100 зерен. Идеальным является анализкаждого зерна. Если спектр глиадина всех зеренодинаков, то по нему составляют сортовую формулу соренного образца сорта Безостая 1. Проведен элект. рофоретический анализ глиадина каждого зерна.Выявлены три типа спектра, формулы которых при. ведены в табл. 2. Они соответствуют сортам Безо- стая 1, Аврора и Одесская. Как видно из таблицы, сортовая чистота образца составляет 94%, Образецсодержит 4% примеси зерна сорта Аврора и 2% - сорта Одесская.Из примера видно, что предлагаемый способ позволяет определять сортовую чистоту зерна в лабо.раторных условиях быстро, точно и в любое время года.Я 727Табл и да Формулы глиадина Число зерен Сорт Безостая 1 123 3689124 (1) 23458 12 1345689 1234 2567(3) 4567 1234 АврораОдесская 16 1234 В смеси глиадииов типичных представителей геномовА, В и Д пшеницы.2. Способпоп,1, отличающийся тем.что по электрофоретическому спектру смеси глиа.динов типичных представителей источников геномовсоставляют формулу глиадина определяемого сортаи сортовую принадлежность его оценивают по ката- .логу сортовых формул, составленному также поэталонному спектру смеси глиадинов. 1. Способ сортовой идентификации зерна и мукипшеницы по электрофореграммам глиадинов и полиакриламидномгеле, отличающийся тем,что, с целью точного и быстрого определения сорта,электрофореграмму глиадинов определяемого сортасопоставляют с электрофоретическим спектром 1 83 Ф 5 6 789 Ю /16,оставитевь трова И, Ковач Кооуектор А. Лакида 723 Подписноеударственного комитета Совета Министров СССР Редактор Т. ИвановаЗаказ 2118цни Техред Тираж ПИ Гос тенмй и открытийшскаи наб., д.4/5жгород, ул Гагарина и изобре-35, Рау 13035, Москва иинаи ППП "Па нт", г. Формула изобретения ХфыийУюУ Мо Фф 5 б 7
Заявка
ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РАСТЕНИЕВОДСТВА ИМЕНИ Н. И. ВАВИЛОВА
КОНАРЕВ ВАСИЛИЙ ГРИГОРЬЕВИЧ, ГАВРИЛЮК ИННА ПАВЛОВНА, ГУБАРЕВА НАТАЛЬЯ КОНСТАНТИНОВНА
В статье приведены результаты молекулярно-генетического анализа 26 сортов Triticum aestivum L. с использованием ISSR-метода (Inter Simple Sequence Repeat) анализа полиморфизма ДНК на основе ПЦР. Выявлено 60 ISSR-маркеров. Установлено, что доля полиморфных локусов изученных сортов T. aestivum поддерживается на высоком уровне (Р95 = 0,83). Число амплифицированных фрагментов ДНК варьировалось в зависимости от праймера от 10 (праймеры М1, Х11) до 15 (праймер Х10), а их размеры – от 170 до 1770 п.н. В среднем один праймер инициировал синтез 12 фрагментов ДНК. Показано, что ISSR-метод анализа полиморфизма ДНК информативен при идентификации сортов пшеницы мягкой. Полученные результаты могут быть использованы в селекционных программах, для защиты авторских прав и для контроля за оборотом сортового семенного материала пшеницы мягкой.
1. Боронникова С.В. Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация редких и находящихся под угрозой исчезновения видов растений: монография. – Пермь: Перм. ун-т., 2008. – 120 с.
2. Государственный доклад о состоянии природных ресурсов и окружающей среды Республики Башкортостан в 2010 году. – Уфа, 2011. – 343 с.
3. Анализ геномного разнообразия образцов и сортов гречихи посевной и татарской ISSR-методом / Г.Д. Кадырова, Ф.З. Кадырова, Е.В. Мартиросян [и др.] // Сельскохозяйственная биология. – 2010. – № 5. – С. 42–48.
4. Использование методов молекулярно-генетического анализа для изучения полиморфизма ДНК растений рода Rhododendron с целью их паспортизации / В.Н. Калаев, О.А. Землянухина, И.Ю. Карпеченко [и др.] // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 6. – С. 323–328.
6. Молекулярная генетика: учеб.-метод. пособие / под ред С.В. Боронниковой. – Пермь: Перм. ун-т, 2007. – 150 с.
7. Назаров Н.Н. География Пермского края. Ч.I. Природная (физическая) география. – Пермь, 2006. – 139 с.
8. Результаты сортоиспытания сельскохозяйственных культур на госсортоучастках Пермского края за 2011 год: брошюра. – Пермь, 2011. – 73 с.
9. Nei M. Genetic distance between populations // Amer. Naturalist. – 1972. – Vol. 106. – P. 283–292.
10. Nei M., Li W.-H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1979. – Vol. 76. – P. 5269–5273.
11. Sofalian O., Chaparzadeh N., Dolati M. Genetic diversity in spring wheat landraces from northwest of Iran assessed by ISSR markers // Not. Bot. Hort. Agrobot. – 2009. – № 37 (2). – Р. 252–256.
12. Torres A.M., Weeden N.F., Martin A. Linkage among sozyme, RFLP and RAPD markers in Vicia faba // Theor. Appl. Genet. – 1993. – Vol. 5. – Р. 937–945.
13. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J.G.K. Williams, A.R. Kubelik, K.J. Livak [et al.] // Nucl. Acids Res. – 1990. – Vol. 18. – P. 6531–6535.
14. Fingerprinting and identification of closely related wheat (Triticum aestivum L.) cultivars using ISSR and fluorescence-labeled TP-M13-SSR markers / S. Zhu, J. Hu, R. Han [et al.] // Australian Journal of Crop Science (AJCS). – 2011. – Vol. 5 (7). – P. 846–850.
15. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. – 1994. – Vol. 20. – Р. 176–183.
Пшеница является основной зерновой культурой для 35 % населения земного шара, под посевами которой занято 216 млн га. Исследование генетического разнообразия сортов пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.) может предоставить существенную информацию относительно ее потенциала в селекционных целях [11]. Ежегодно селекционными учреждениями создаются и передаются для коммерческого использования сотни новых сортов. Из-за ограниченного количества родительских ресурсов в размножении число подобных сортов пшеницы быстро растет, что приводит к перекрыванию сортов на рынке семян. С увеличением числа новых подобных или тесно связанных сортов пшеницы все более важным становится процесс регистрации культурного сорта, его сертификации и защиты авторских прав селекционеров [14]. Генетическая идентификация и паспортизация различных линий и сортов позволяют также избежать и нелегального распространения перспективного селекционного материала.
Генетическая паспортизация представляет собой метод получения генетически детерминированных характеристик с помощью морфологических или молекулярных маркеров. На сегодняшний день проведение генетической паспортизации считается актуальной задачей современной селекции. В мировой практике для индивидуальной паспортизации объектов лесного и сельского хозяйства используют преимущественно ДНК-маркеры [4]. Молекулярные маркеры отличаются высоким уровнем полиморфизма между сортами и могут эффективно использоваться для оценки общих генетических характеристик [11].
Для исследований межсортового полиморфизма, выявления генетического сходства/отдаленности генотипов разных сортов пшеницы с целью их дифференциации и паспортизации нами был избран ISSR-метод (Inter Simple Sequence Repeat [15]). В настоящее время ISSR-метод широко используется при выявлении внутривидового полиморфизма, в первую очередь у близкородственных генотипов культивируемых растений [3]. При ISSR-PCR анализе микросателлитные последовательности используются в качестве праймеров в полимеразной цепной реакции для создания мультилокусных спектров. ISSR-маркеры полиморфны и могут быть использованы в исследованиях генетического разнообразия, филогении, молекулярном маркировании геномов хлебных злаков. Используемые ISSR-праймеры могут быть ди-, три-, тетра- или пентануклеотидными мотивами микросателлитов, давая огромное количество возможных продуктов амплификации.
Идентификация сортов пшеницы мягкой с высоким адаптивным потенциалом является актуальной задачей для Урала, климат которого характеризуется холодной продолжительной и снежной зимой, теплым коротким летом и ярко выраженными температурными инверсиями [7].
Цель нашего исследования – молекулярно-генетическое маркирование и идентификация перспективных для Урала сортов T. aestivum с использованием ISSR-метода анализа полиморфизма ДНК.
Материалы и методы исследования
Компьютерный анализ молекулярно-генетического полиморфизма ДНК проведен с помощью специализированного макроса GenAlEx6 для MS-Excel с определением доли полиморфных локусов [13] при Р95. Для ISSR-анализа сортов были рассчитаны матрицы бинарных признаков. Генетическое расстояние (D) между сортами определено по формуле M. Нея и В. Ли [10]. На основе матриц бинарных признаков были рассчитаны матрицы генетических различий [9]. По матрице генетических различий невзвешенным парно-групповым методом (UPGMA – unweighed pair-grup method using arithmetic average) была построена дендрограмма, отражающая степень родства исследуемых сортов по ISSR-спектрам при помощи компьютерных программ Treecon 1.3b и POPGENE 1.32.
Результаты исследований и их обсуждение
Каждый праймер индивидуально был проанализирован в ISSR-ПЦР с геномной ДНК T. aestivum. Нами протестировано 23 ISSR-праймера (табл. 1), из которых для дальнейшего анализа отобраны 5 наиболее информативных, то есть дающих четкие и строго воспроизводимые в повторных ПЦР ISSR-маркеры.
Для выявления сортовых различий и составления генетических паспортов для каждого сорта пшеницы мягкой была проведена ПЦР с каждым из 5 информативных ISSR-праймеров. На основании полученных спектров ампликонов были составлены матрицы, отражающие наличие или отсутствие соответствующего ампликона, характерного для каждого из праймеров (наличие ампликона обозначалось цифрой 1, отсутствие – цифрой 0). У всех изученных 26 сортов T. aestivum наличие или отсутствие ампликонов показано в качестве примера одного (Х10) из ISSR-праймеров (табл. 2).
У 26 исследуемых сортов T. aestivum выявлено 60 ISSR-маркеров. Установлено, что доля полиморфных локусов изученных сортов T. aestivum поддерживается на высоком уровне (Р95 = 0,83). Число амплифицированных фрагментов ДНК варьировалось в зависимости от праймера от 10 (праймеры М1, Х11) до 15 (праймер Х10), а их размеры – от 170 до 1770 п.н. В среднем при ISSR-анализе сортов T. aestivum один праймер инициировал синтез 12 фрагментов ДНК. Амплифицированные фрагменты ДНК были отнесены к мономорфным, если частота их встречаемости была > 0,95. Фрагменты с меньшей частотой встречаемости были отнесены к полиморфным.
Проведена идентификация гена устойчивости Tsn 1 к pyrenophora tritici-repentis у 23 сортов озимой пшеницы селекции КНИИСХ им. Лукьяненко и ВНИИЗК им. Калиненко с помощью ДНК-маркеров.
Ключевые слова: pyrenophora tritici-repentis, пшеница, ген устойчивости Tsn 1, молекулярный скрининг.
Identification of gene of resistance to pyrenophora tritici-repentis — Tsn 1 in 23 winter wheat varieties from Lukijanenko Krasnodar research institute of agriculture and Kalinenko All-Russian research institute of crops was maintained with the use of DNA-markers.
Keywords: pyrenophora tritici-repentis, wheat, resistance gene Tsn 1, molecular scrining
Северный Кавказ является зоной широкого возделывания озимой пшеницы. В последнее время возбудитель желтой пятнистости листьев занимает доминирующее положение среди листовых болезней пшеницы на данной территории [1- 3].
Специфичность взаимодействия патогена с растением обусловлена наличием определенных хозяин — специфичных токсинов, которые функционируют как факторы патогенности. Ptr ToxA — ответственен за развитие некрозов на чувствительных сортах пшеницы и является главным фактором патогенности [4- 5]. Ген ToxA, детерминирующий синтез токсина Ptr ToxA был клонирован и сиквенирован в 1997 году [6]. В настоящее время существует несколько кодоминантных SSR-маркеров, фланкирующих данный ген: Xfcp1, Xfcp2, Xfcp394, Xfcp393, Xfcp620 7. Канадские ученые показали, что устойчивость к патогену контролируется рецессивным геном tsn 1, который локализован на длинном плече хромосоме 5 BL.
В связи с сильной восприимчивостью высеваемых сортов на Северном Кавказе [2- 3] к данному патогену, необходимо проводить поиск источников новых доноров устойчивости к p. tritici-repentis. Использование молекулярно-генетических подходов в данном вопросе может способствовать ускорению селекционного процесса.
Цель данного исследования — идентифицировать сорта пшеницы, устойчивые к Ptr ТохА возбудителя желтой пятнистости листьев с использованием ДНК — маркеров.
Материалом исследований служили 23 сорта озимой пшеницы селекции КНИИСХ им. П.П.Лукьяненко и ВНИИЗК им. И.Г. Калиненко, районированные и высеваемые на территории Северного Кавказа. Для идентификации носителей генов устойчивости использовали метод полимеразной цепной реакции. Выделение ДНК проведено на основе СТАВ метода [9].
Для идентификации носителей гена Tsn 1 проводилась ПЦР амплификация с использованием праймера Xfcp 1 R/F. Объем реакционной смеси составлял 25 мкл и содержал 2.5 мкл буфера, 1.0 мкл dNTP, 1,75мкл каждого праймера, 0,5 мкл Tag-полимеразы, 16 мкл Н2О // , 1,5 мкл ДНК. Для разделения фрагментов амплифицированной ДНК электрофорез осуществляли в 1,8 % агарозном геле. Амплификацию проводили при следующих параметрах: денатурация — 94 0 С в течении 4 минут; 45 циклов: 94 0 С -1 минута, 62 0 С — 1 минута; 72 0 С — 2 минуты; финальная элонгация — 72 0 С — 10 минут.
Электрофорез продуктов ПЦР отражает наличие или отсутствие в генотипах исследуемого образца искомого гена. В качестве положительного контроля при идентификации носителей генов использован сорт Glenlea, в котором идентифицирован ген устойчивости. Если в результате ПЦР амплифицируется фрагмент размером 374 п.н., считается, что в генотипе сорта содержится рецессивный аллель tsn 1 и сорт является устойчивым к токсину Ptr tox A. Если в результате ПЦР амплифицируется фрагмент размером 402 п.н., значит образец является носителем доминантного аллеля гена Tsn 1, восприимчивого к токсину Ptr tox A.
Результаты проведения ПЦР с праймером Xfcp1 у 23 сортов озимой пшеницы представлены в таблице 1. Отмечено наличие продукта амплификации 374 п.н. у 16 сортов, которые могут быть рассмотрены в качестве источников устойчивости к ТохА p. tritici-repentis для целенаправленной селекции сортов и гибридов пшеницы.
Результаты идентификации сортов озимой пшеницы на устойчивые к Ptr ТохА возбудителя желтой пятнистости с использованием праймера Xfcp 1 R/F.
Читайте также: