Размножение винограда in vitro

Обновлено: 15.09.2024

К микроклональному размножению можно отнести массовое бесполое размножение растений в условиях асептики, позволяющее исключить появление генетически измененных форм [7]. Успешному размножению растений in vitro на практике предшествовала работа по технике культивирования изолированного апекса побега. Морель одним из первых начал успешно культивировать апикальные меристемы многих видов растений (картофель, георгины, орхидеи, подсолнечник, гвоздика) [11, 22]. Р. Г. Бутенко изучала физиологию изолированных верхушечных почек стеблей периллы, фарбитиса, рудбекии, картофеля, сои [4]. Оздоровление винограда с помощью культуры апикальной меристемы с привлечением термотерапии начато Галзи [19, 20], и оно не потеряло актуальности до сих пор [18]. В СССР работы по размножению винограда in vitro ведутся с начала 1980-х годов [1, 3, 5].
Для винограда показаны три пути получения микропобегов.

Микрочеренкование одиночного побега (с одновременным укоренением), полученного от введенной в культуру изолированной почки (меристемы).
Длительная культура пролиферирующих побегов, или активация пазушных меристем (этап размножения) с последующим разделением побегов и их укоренением на иной по составу среде.
Получение эмбриоидов из каллусной ткани и регенерация из них растений.

Для поддерживающей селекции (питомниководство) без опасности повышения изменчивости можно рекомендовать первый из перечисленных путей [21], который мы используем в своей работе [3], тем более что этот путь наиболее разработан технологически. Генетическая стабильность материала, полученного вторым путем, проверяется [21, 24], поскольку длительная культура пролиферирующих побегов с индукцией развития пазушных почек первого, второго и последующих порядков с помощью цитокинина не исключает появления адвентивных побегов (т. е. образования побегов de novo). Так, оптимизм ранних работ по микроразмножению земляники с использованием цитокинина [13] сменился (у того же автора) реальными оценками — при увеличении числа асептических субкультур в поле регистрируют мутанты и значительное снижение урожая ягод [14]. Известно и прямое указание для винограда о повышенной изменчивости при таком способе размножения [16]. Выявление возможных генетических нарушений может быть отодвинуто во времени к генеративному периоду, что недопустимо для плодовых и винограда, так как обнаружение отклонения от сортовых признаков в многолетних насаждениях будет обесценивать производственные посадки.

Эмбриогенез как адвентивный процесс ведет у винограда к появлению форм с отклонениями от исходной [6, 9]. Исходя из изложенного выше, эмбриогенез может быть рекомендован как раз для получения разнообразия, но не для целей питомниководства такой важной сельскохозяйственной культуры, как виноград, для которой генетическая нестабильность, вызванная, в частности, анеуплоидией, может стать причиной пониженной фертильности, не говоря уже об изменении других технологических признаков сорта.

Таким образом, микрочеренкование, по-видимому, найдет в практике питомниководства винограда наибольшее применение, хотя предложены и другие пути, основанные на культуре пролиферирующих побегов при высоких концентрациях цитокининов [6], хотя с последним мы согласиться не можем.
Следует подчеркнуть, что полностью отказаться от применения цитокинина пока не представляется возможным и для первого из предложенных путей, хотя это применение и ограничивается всего одним (нулевым) пассажем — культивирование изолированной меристемы. При введении же образца в культуру in vitro крупным эксплантом (часть побега, почка), когда не стоит задача оздоровления, необходимость применения цитокинина отпадает полностью [10, 15], если предполагается вести размножение микрочеренкованием.

При размножении микрочеренкованием приходится считаться с особенностями винограда как древовидной лианы — не все черенки дают побег одновременно, как это имеет место для травянистых (например, картофель). Если черенок взят не из ювенильной, не из верхушечной части побега, то его развитие (укоренение, побегообразование) отстает. Часть черенков не дает побегов совсем. Последнее зависит от генотипа. Так, формы Подарок Магарача и Кобера 5ББ дают до 100% побегов при микрочеренковании, а для сортов Ркацители, Ананасный характерны цифры 70 и 60% соответственно.

При масштабировании процесса имеет значение депонирование при низких положительных температурах [21]. Мы испытали метод холодного хранения для ряда генотипов (Подарок Магарача, Кишмиш белый и др.). Все испытанные сорта были возобновлены после 8 мес хранения при температуре 12—15° в камере фитотрона ИФР АН СССР.

Питательные среды. С равным успехом были испытаны питательные среды на основе прописей неорганических солей, используемых рядом авторов [6, 8, 21, 24]. При сравнении их в эксперименте мы остановились на уже использованной нами прописи [3], основанной на неорганических компонентах по Мурасиге и Скугу [23] с введением ИУК в концентрации 0,1— 0,2 мг/л. При культивировании апикальных меристем ауксин в этой прописи заменяется на цитокинин (БАП в концентрации 1 — 2 мг/л). Считаем, что при введении в культуру in vitro первые субкультивирования предпочтительнее проводить в прозрачных твердых средах (агар-агар) — так эффективнее осуществить контроль контаминации. При получении развитого побега дальнейшие субкультивирования можно проводить и в непрозрачных (активированный уголь, искусственные смолы и другие наполнители: песок, целлюлоза и т. д.) и жидких средах, если в этом будет необходимость.

Перевод растений в почвенную культуру. Мы применили приемы, позволяющие значительно упростить технологию перевода растений в почвенную культуру [2]. По существующей технологии растения in vitro проходят адаптацию к условиям климатической камеры или оранжереи после извлечения их из пробирок (колб). Для винограда такой подход не позволяет отказаться от создания влажной камеры в первый период адаптации, как это удается, например, для картофеля [12]. Нежные ткани листочков пробирочного растения винограда вянут и некротизируют без влажной камеры (вариант — мелкокапельное опрыскивание).
Мы применили другой подход, позволяющий обойти существующие трудности. Адаптацию к условиям климатической камеры или оранжереи растения безболезненно проходят в пробирках — для этого достаточно снять пробки с тех пробирок, в которых побег достиг пробки. В таком состоянии растения оставляют на 1,5 — 2 нед. Чтобы предотвратить образование плесеней на агаризованной среде, достаточно 3 — 4 раза за этот период полить растения водопроводной водой — увлажнить поверхность агара и лишнюю воду слить, перевернув пробирку. В конце указанного периода верхушка растения и один-два развитых листочка будут вне пробирки. Такое растение готово к пересадке в почву. Растение следует пересаживать с агаризованной средой — так меньше повреждается корневая система. Необходимо заглублять побег в почвенный субстрат так, чтобы над поверхностью оставалась верхушка с одним-двумя развитыми листочками. Туманообразующая установка или влажная камера не требуются. Чтобы защитить растение от патогенов следует применять стерильный почвенный субстрат или речной песок, свободный от нематод, а помещение изолировать от насекомых-переносчиков болезней.

Данной технологией неоднократно испытаны следующие формы: Магарач 124-66-14, Ркацители, Кишмиш белый (Хисрави), Тайфи розовый, Кобера 5ББ, Мускат янтарный, Крымская жемчужина. Последние два сорта переданы нам А. И. Шелякиным (Отдел виноградарства республиканской сельскохозяйственной опытной станции Чечено-Ингушской АССР, Грозный). Из более чем 200 пересаженных таким образом растений не было ни одного выпада. Растения сорта Ркацители, высаженные из пробирок в 1988 г., дали урожай ягод в 1989 г. в условиях оранжереи ИФР АН СССР.

ЛИТЕРАТУРА

Использование: в сельском хозяйстве и может быть использовано в виноградарстве для ускоренного размещения и оздоровления сортов винограда. Сущность способа: вначале осуществляют микрочеренкование пробирочных растений с 8 10-ю междоузлиями на фрагменты длиной 10 — 12 мм с узлом и листом, а затем высаживают их на твердую питательную среду Мурасиге Скуга. В питательную среду добавляют тонкоразмолотые семена винограда в концентрации 0,1 0,5 от объема среды. 5 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к способам размножения растений, и может быть использовано в виноградарстве для ускоренного размножения и оздоровления перспективных сортов винограда, в исследованиях по физиологии винограда, служит охране окружающей среды.

Известна основная модель клонального микроразмножения растений пролиферация пазушных побегов, основанная на снятии апикального доминирования [1] Есть два направления осуществления этого способа: получение побегов нормальных пропорций с последующим их делением на однопочковые микрочеренки, которые используются в качестве вторичных эксплантов для повторения цикла размножения, введение в питательную среду цитокининов, что приводит к формированию побегов с относительно укороченными междоузлиями, а пазушные почки и меристематические бугорки дают начало новым побегам.

Недостатком данного способа является недостаточно высокий коэффициент размножения в процессе культивирования.

Недостатком способа является то, что в качестве индуктора корнеобразования взята феруловая кислота, которая способна ингибировать рост побегов и снижать выход растений из черенков.

Изобретение предназначено для повышения эффективности клонального микроразмножения.

Новым в предложенном способе является то, что оптимизацию клонального микроразмножения осуществляют за счет питательной среды, в составе которой предлагают стимуляторы роста естественного прохождения, а именно семена винограда, в виде тонкоразмолотого порошка.

Известно, что виноградные семена используют при производстве масла, кормовой муки, удобрений, естественного парника. В предложенном способе семена используются как стимуляторы роста ввиду того, что в них находятся вещества с ценными биологическим свойствами: абсцизовая и хлорогеновая кислоты, общий фенолы, рутин, свободные ауксины и цитокинины.

В состав семян винограда входят такие осмотически активные вещества как соли, сахара, органические кислоты. Также входит большое количество фитогормонов (ауксинов и цитокининов), которые обладают трофическим действием, т.е. способны тормозить деструктивные процессы, которые являются характерной чертой старения органов или целых организмов. Использование семян винограда в виде тонкоразмолотого порошка позволяет адсорбировать токсические вещества, выделяемые растениями при их микрочеренковании в питательную среду, и заменить таким образом активированный уголь. Т.е. налицо неоднозначность предлагаемого приема: адсорбирование токсических веществ, выделяемых пробирочными растениями в питательную среду при их микрочеренковании, и обогащение питательной среды цитокининами, ауксинами и другими фитогормонами, входящими в состав семян винограда. Адсорбирование токсических веществ осуществляют с целью уменьшения ингибирования наружного роста и увеличения регенеративной способности выделенных эксплантов.

Способ осуществляют следующим образом.

Применяют следующий порядок приготовления питательной среды. В 1 л бидистиллированной воды растворяют макроэлементы, микроэлементы, витамины и другие составные части среды.

Навеску предварительно промытого и высушенного агара переносят в колбу, заливают половинным количеством (от объема среды) бидистиллированной воды 1 л и нагревают на плите до 80-100 о С. Семена винограда тщательно промывают, просушивают, перемалывают на лабораторной мельнице до малой фракции около 5 мин. Добавляют их в раствор макро- и микроэлементов, сахара, витаминов и других составных частей среды. Молотые семена добавляют в концентрации 0,25% После растворения и некоторого охлаждения агара к нему добавляют приготовленный раствор. Температура агара и добавленного раствора одинаковая и составляет 80 о С.

Среду фильтруют через два слоя марли и доводят до нужного объема бидистиллятом.

Готовую среду разливают по пробиркам, которые закрывают предварительно простерилизованными в автоклаве ватными пробками, штатив с пробирками закрывают целлофаном и обвязывают шпагатом, а затем среду автоклавируют в автоклаве ГК-1000.

Это оказывает положительное влияние на рост побегов, образование листьев и новых узлов, хотя на первом этапе отличалось угнетение этих процессов, но на втором месяце культивирования скорость роста пробирочных растений увеличивается за счет добавления в питательную среду размолотых семян винограда, что способствует мощному развитию корневой системы. Торможение же роста в течение первого месяца зависит от наличия в составе семян абсцизовой кислоты и фенолов, которые являются ингибиторами широкого спектра действия.

Положительное действие добавки в питательную среду размолотых семян винограда наблюдали при их концентрации 0,1% от объема среды, максимальный положительный эффект был получен при концентрации 0,25% При дальнейшем увеличении концентрации размолотых семян в среде (0,5%) положительное действие сохраняется, но отмечается тенденция к его снижению.

Развитие пробирочных растений в зависимости от количества молотых семян винограда, добавленных в питательную среду (через 63 дня после начала культивирования), представлено в табл.2.

В табл. 3 и 4 соответственно показаны признаки и состав питательной среды.

Предложенная совокупность признаков способствует повышению эффективности клонального микроразмножения на 27,0% и достаточна для достижения поставленной цели.

Добавление в питательную среду размолотых семян винограда оказывает, в первую очередь, положительное влияние на укоренение и развитие корневой системы пробирочных растений: уменьшается длина главного и придаточных корней, но возрастает их число, что способствует увеличению корневой системы.

Динамика развития пробирочных растений без добавления и при добавлении в питательнуюс. реду размолотых семян винограда 0,25 об. среды представлена в табл.5.

Сельское хозяйство

АГРОНОМИЯ

Система интенсивных технологий производства винограда в северной зоне промышленного виноградарства РФ — Микроклональное размножение винограда

Микроклональное размножение винограда, оздоровление от вирусных и микоплазменных болезней.

Закладка базисных маточников

Способ заготовки черенков на существующих насаждениях без применения массовой и клоновой селекции приводит к размножению низко продуктивных растений, зараженных вирусами, бактериальным раком и другими хроническими заболеваниями, передающимися вегетативному потомству через черенки и снижающими выход стандартнысаженцев, долговечность и продуктивность насаждений минимум на 50%.

Для создания долговечных и перспективных высокопродуктивных сортов и клонов необходим переход к закладке промышленных насаждений сертифицированным посадочным материалом.

Система сертификации (сертификационная схема) посадочного материала винограда, действующая в странах Европейскрго Союза, базируется на четких организационных схемах, установленных технологических требованиях и нормативных документах. По международному определению, сертификационная схема представляет собой систему производства посадочного материала, получаемого из отобранных клонов через несколько стадий размножения, в условиях, обеспечивающих соблюдение санитарных стандартов, для посадки, с целью закладки маточников и промышленных виноградников.

Посадочный материал винограда категорий: исходный клоновый, базовый и сертифицированный (согласно правилам Евросоюза) должен отвечать следующим требованиям:

—отсутствие скрытого поражения вирусами короткоузлия, первым и третьим серотипами вируса скручивания листьев винограда, вирусом мраморности, а также вирусами А и В винограда;

—отсутствие визуального поражения болезнями многолетней древесины.

В большинстве стран участниц Международной организации виноградарства и виноделия производство виноградных саженцев основано на сертификации исходного черенкового подвойного и привойного материала и самих саженцев.

Сертификационные схемы посадочного материала разных стран имеют ряд особенностей. Санитарная селекция (сертификация) регламентирует освобождение в первую очередь от наиболее вредоносных вирусов—короткоузлия и скручивания листьев По фитосанитарному состоянию такой посадочный материал относится к категории— тестированный на вирусы (Virus tested)—материал свободный от особо опасных вирусов и вирусоподобных патогенов.

Вторую категорию представляет посадочный материал свободный от вирусов (Virus free)— материал свободный от всех известных вирусов и вирусоподобных заболеваний.

Получить посадочный материал категории (Virus free) можно лишь при помощи приёмов, объединенных в систему биотехнологии.

. Оздоровление растений осуществляется при помощи культуры апикальных меристем при относительном размере эксплантов 0,1-0,2 мм, так как установлено, что экспланты малых размеров, являются лучшими для элиминации вирусов. Для повышения низкой регенерационной способности таких эксплантов в лаборатории биотехнологии разработана оригинальная технология микроклонального размножения, защищенная 6—ью патентами. Она состоит из следующих последовательных этапов: изолирование эксплантов (центральные почки глазков) и получение асептической культуры in vitro, выделение верхушечной меристемы, индукция адвентивного побегообразования, укоренение побегов, получение пробирочных растений, высадка растений регенератов в почвенный субстрат.

Ключевым моментом технологии является регенерация целого нормального жизнеспособного растения. Успех культивирования in vitro и получение нормальных растений непосредственно связано с оптимизаций условий на каждом этапе технологии. Как правило, даже небольшие отклонения от оптимума приводят к резкому снижению скорости роста и размножения, а также к ухудшению физиологического состояния регенерантов.

Экономическая эффективность и стабильность виноградарства в значительной степени определяется качеством посадочного материала, которое зависит от биометрических показателей саженцев, генетического потенциала сорта, клона, их продуктивности и качества.

Виноградарские страны мира перешли на производство и закладку промышленных виноградников только сертифицированным посадочным материалом, который обеспечивает высокую приживаемость саженцев, в дальнейшем - выравненность кустов по силе роста, развитию, вступлению в плодоношение, урожайности и долговечности.

Посадочный материал категории "исходный клоновый" выращивают, как правило, в научно-исследовательских учреждениях. Он имеет самые высокие селекционные показатели и представлен небольшим количеством растений. В связи с этим для его получения используют все известные методы ускоренного размножения, и в первую очередь, метод культуры тканей и органов in vitro. Он позволяет в короткие сроки размножить и получить генетически однородный исходный посадочный материал, свободный от вирусной и бактериальной инфекции.

Сегодня общая технология размножения винограда in vitro известна и включает следующие этапы: отбор и стерилизацию первичных эксплантов; введение эксплантов в культуру in vitro; пролиферацию почек и индукцию развития побегов; укоренение микрочеренков на питательных средах и субстратах; адаптацию микрорастений из условий in vitro к условиям in vivo; доращивание саженцев до стандарта. Но, к сожалению, эта технология без применения дорогостоящих климатических камер, современных теплиц с регулируемым гидротермическим режимом обеспечивает невысокий выход стандартных саженцев со школки, который составляет в среднем 30-40 %. Поэтому исследования, направленные на оптимизацию приемов размножения винограда in vitro, являются актуальными в виноградном питомниководстве Украины, в частности, для производства исходного клонового материала винограда.

На первом этапе культивирования винограда in vitro для стимуляции процессов пролиферации пазушных почек и апикальных меристем используют модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга (МС) с добавлением 0,2-0,3 мг/л цитокинина 6-БАП.

Важным этапом в технологии размножения растений in vitro является укоренение микрочеренков. Успех укоренения зависит от многих факторов: сортовых особенностей, числа пассажей, концентраций фитогормонов и способов их применения. Сегодня для индукции ризогенеза эксплантов используют фитогормоны ауксиновой природы - ИМК (индолил-3-масляная кислота), ИУК ф-индолилуксусная кислота), НУК (а-нафтилуксусная кислота), которые в определенных количествах вводят в питательные среды. Но некоторые исследователи отмечали их положительное влияние только на первых этапах ризогенеза, а в дальнейшем их присутствие в среде для развития корневой системы не только бесполезно, но и нежелательно и должно быть ограничено во времени. В связи с этим для успешного укоренения микрочеренков винограда мы предлагаем использовать безгормональную среду МС, с применением ауксинсодержащей тальковой пудры. Суть способа заключается в следующем: сформированные микроклоны винограда разрезают на одноглазковые черенки и каждый черенок высаживают на свежую питательную среду. Перед посадкой одноглазковых черенков на питательную среду их базальную часть увлажняют стерильной водой, с помощью фильтровальной бумаги слегка просушивают, окунают в изготовленную пудру и высаживают на безгормональную питательную среду. В процессе проведения таких исследований была установлена более высокая эффективность применения приема опудривания микрочеренков, с последующим их культивированием на безгормональной среде МС, чем их культивирование на среде, в состав которой входила ИУК (контроль). Через 30 дней культивирования в опытных вариантах практически все экспланты (90-100 %) образовывали корни, а в контроле - только 80 %. Микрорастения в опытных и контрольных вариантах различались по количеству корней и их длине. Так, например, у каждого экспланта подвойного сорта РхР 101-14 в контрольном варианте образовывалось в среднем по 3,0 корня, у микрорастений, которые перед посадкой на безгормональные питательные среды опудривали пудрой с содержанием ИУК- 6,0 корней. Положительные результаты по укоренению эксплантов винограда в культуре in vitro были получены также на питательной среде МС с половинным содержанием макросолей (50 мл/л питательной среды) и хелата железа (5 мл/л питательной среды). Например, через 45 дней культивирования эксплантов на таких питательных средах мы отмечали формирование растений высотой 5,6 см (МС с половинным содержанием макросолей) и 6,0 см (МС с половинным содержанием хелата железа), которые имели по 5 корней. После культивирования микроклонов на питательной среде МС эти показатели составляли 7,5 см (высота растений) и 3,0 шт. (количество корней). На этом же этапе для повышения рентабельности производства, в качестве желирующего агента мы рекомендуем использовать пищевые крахмалы - кукурузный, картофельный в количестве 70 г/л питательной среды.

Известно, что в технологии размножения винограда in vitro наиболее ответственным этапом является адаптация микрорастений к условиям in vivo. Низкий уровень приживаемости микрорастений винограда связан с нарушением деятельности устьичного аппарата листьев, отсутствием кутикулярного слоя, корневых волосков и другими причинами. И, как следствие, часть микрорастений в процессе адаптации погибает. Поэтому уже на этапе размножения необходимо создавать оптимальные условия для формирования хорошо развитой, полноценно функционирующей корневой системы. Как показывают результаты наших исследований, этому способствует применение двухслойной питательной среды. Ее готовят на основе среды МС с содержанием агара 6,0-7,0 г/л путем добавления в культуральные емкости агроперлита при условии, что его слой будет не более чем 0,4 см. На такой питательной среде через 25 дней культивирования приживались 95 % инициальных эксплантов винограда. Проведение учета биометрических показателей роста и развития микрорастений через 60 дней культивирования показало, что высота стебля растений составляла 12,9-14,1 см, количество листьев 10-12 шт., в контроле (стандартная среда МС) высота стебля растений составляла 12,5 см, количество листьев 8,0 шт. Следует отметить, что на модифицированной среде корни формировались активнее, их количество составляло 11,5-15,3 шт. со средней длиной 9,0-11,6 см, что на 50 % больше по сравнению с культивированием на стандартной среде МС.

Нашими исследованиями установлено, что на этапе адаптации микрорастений винограда к нестерильным условиям целесообразно применять препараты группы антитранспирантов, гидроабсорбентов и влагоудерживающие субстраты на основе кокосовой стружки. По этому способу, для адаптации отбирают микрорастения винограда высотой 4-5 см, которые имеют по 3-5 листовых пластинок и хорошо развитую корневую систему. Первый этап адаптации проводят в условиях культурального бокса на протяжении 5-7 дней. Адаптируют микрорастения к условиям сниженной влажности воздуха путем ежедневного открывания крышек емкостей на 5-10 мин, с каждым днем увеличивая экспозицию. Перед первым открыванием крышек проводят опрыскивание вегетативной массы растений растворами антитранспирантов - Vapor Gard (0,3 % концентрации) или ЭПАА (экзополисахаридакриламид) (0,4 % концентрации), поверхность питательной среды увлажняют дистиллированной автоклавированной водой. На втором этапе адаптации микрорастения винограда переносят в адаптационные помещения и пересаживают на питательные субстраты. В своей работе мы изучали несколько типов питательных субстратов: кокосовый субстрат чистый, кокосовый субстрат + вермикулит (1:1) + теравет (3:1), кокосовый субстрат + агроперлит (1:1) + теравет (3:1), торф сфагнум + агроперлит (1:1), торф сфагнум + вермикулит (1:1).

Источник: Мулюкина Н. А., Зеленянская Н. Н., Джабурия Л. В. Применение методов культуры тканей и органов in vitro для размножения исходного клонового материала винограда. / Садоводство и виноградарство. 2013, №2, с.36-40.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к способам размножения растений, и может быть использовано в виноградарстве для ускоренного размножения оздоровленных от вирусной инфекции перспективных сортов винограда, в исследованиях по физиологии винограда, служит охране окружающей среды.

Известен способ клонального микроразмножения растений, включающий введение в питательную среду цитокининов, что приводит к формированию побегов с относительно укороченными междоузлиями, а пазушные почки и меристематические бугорки дают начало новым побегам [Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда. Ялта, 1986, с.25-29]. Способ осуществления этого направления связан с пролиферацией пазушных почек и побегов.

К недостатку этого способа клонального микроразмножения следует отнести большую трудоемкость процесса, так как необходима частая пересадка эксплантов; слабую их укореняемость; возможность образования каллуса на базальной части агрегата почек и побегов, что может привести к нарушению генетической стабильности размножаемых растений.

Недостаток этого способа заключается в том, что при клональном микроразмножении на начальном этапе, после микрочеренкования, растения растут медленно, что ограничивает эффективность метода. Одной из причин медленного роста являются стрессовые условия, в которых оказываются микрочеренки in vitro. Наблюдается ингибирование ростовых процессов эксплантов токсическими веществами, выделяемыми ими в питательную среду. Грибные патогены также отрицательно влияют на развитие растений и могут способствовать их гибели. При многократных повторных субкультивированиях состояние их ухудшается, снижается выход микрочеренков, что ограничивает эффективность метода. Необходим способ оптимизации этого процесса. Новый класс фиторегуляторов - адаптогенов способствует активации и многоцелевой стимуляции защитных реакций растений. К ним относится препарат эмистим, который представляет собой композицию ростовых веществ цитокининовой и гиббереллиновой природы, продукты метаболизма симбиотического гриба Acremonium lichenicola, выделенного из корней женьшеня. Он положительно влияет на процессы роста и развития растений, снижает влияние неблагоприятных и стрессовых факторов внешней среды.

Все это создает предпосылки для использования его в технологии in vitro для преодоления высказанных нами ранее трудностей.

Целью изобретения является повышение эффективности клонального микроразмножения растений винограда, оздоровленных от вирусной инфекции методом апикальных меристем, на этапе микрочеренкования побегов.

Новым в предложенном способе является то, что микрочеренки пробирочных растений высаживают на жидкую модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга с уменьшенным содержанием макросолей, витаминов и индолилуксусной кислоты.·

Существенным является то, что содержание макросолей уменьшено следующим образом: NH₄NO₃ с 1650 до 138 мг/л, KNO₃ с 1900 до 950 мг/л, MgSO₄·7H₂O с 370 до 185 мг/л, CaCl₂·2H₂O с 440 до 296 мг/л, КН₂PO₄ с 444 до 68 мг/л; содержание мезоинозита со 100 мг/л до 50 мг/л, тиамина с 0,5 до 0,2 мг/л, исключена из состава витаминов никотиновая кислота, индолилуксусная кислота в количестве 0,1-0,3 мг/л с добавлением в состав питательной среды препарата эмистим в концентрации 10 -7 -10 -10 %.

Эмистим оказывает двоякое действие на микрочеренки: способствует индукции ризогенеза и, кроме этого, оказывает влияние на конус нарастания почек глазка, способствуя делению клеток и вытягиванию в длину клеток всех тканей. То есть в данном случае воздействие эмистима и направлено на микрочеренок с целью регенерации из него растения и осуществляется одновременно на тканевом и организменном уровне.

В результате его применения происходит оптимизация метаболических процессов, усиливаются функции иммунитета у растений, активизируются защитные механизмы растений против многих патогенов. Гиббереллиновая и цитокининовая активность препарата положительно влияет на процессы роста растений. Таким образом, препарат эмистим является препаратом широкого спектра действия.

Замена твердой питательной среды (агаризированной) на жидкую питательную среду, уменьшение в ее составе количества макросолей, витаминов и индолилуксусной кислоты обеспечивает улучшение приживаемости микрочеренков, соотношения между развитием у растений ризогенной зоны и надземной части, образование большего числа листьев, а также лучшее развитие растений после субкультивирования, то есть снимается торможение ростовых процессов, которое наблюдается при высоких концентрациях. Кроме этого, за счет замены агара жидкой питательной средой и уменьшения количества реактивов происходит удешевление процесса клонального микроразмножения растений винограда.

Таким образом, налицо неоднозначность предлагаемого приема

Способ осуществляется следующим образом.

Изготавливают мостики из фильтровальной бумаги, помещают их в пробирки, разливают в них приготовленную питательную среду, закрывают фольгой, штатив с пробирками закрывают целлофаном, обвязывают шпагатом и автоклавируют в автоклаве ГК-100-3.

Наблюдения за ростом растений осуществляют через 15 дней.

Результаты развития пробирочных растений винограда на 50-й день культивирования на питательных средах с различным содержанием ИУК и эмистима представлены в табл.1.

Таблица 1
Состояние пробирочных растений винограда сорта Рупестрис дю Ло на питательных средах различного состава Варианты Корни Побеги Коэффициент полярности Выход растений, % питательная среда ИУК, мг/л эмистим, % число, шт длина, мм ризогенная зона, мм длина, мм число листьев, шт Мурасиге и Скуга (прототип) 0 - 0,6 12,2 7,3 21,0 3,0 0,9 53,5 0,1 - 1,0 18,2 18,2 24,9 4,2 1,3 67,8 0,3 - 0,9 24,1 21,6 29,3 4,0 0,7 78,6 Мурасиге и Скуга (техн. решение без эмистима) 0 - 1,3 47,6 61,8 52,0 5,4 1,8 89,2 0,1 - 3,2 40,2 128,6 74,7 4,8 1,7 96,4 0,3 - 5,3 28,4 150,5 75,1 4,8 2,0 96,2 Мурасиге и Скуга (заявл. техн. решен. с эмистимом) 0,3 0 3,1 54,0 168,0 85,7 5,2 2,0 89,4 0,3 10 -10 3,4 71,8 246,4 110,0 5,7 2,2 100,0 0,3 10 -9 4,6 55,9 258,4 91,1 5,5 2,8 92,8 0,3 10 -8 4,7 50,1 237,8 85,3 4,8 2,8 89,8 0,3 10 -6 5,4 49,0 266,5 63,7 5,0 4,2 82,1

Как следует из приведенных данных, на питательной среде Мурасиге и Скуга (прототип) образование корней и их рост, образование побегов и листьев происходило намного слабее, чем на модифицированной питательной среде (техническое решение без эмистима).

ИУК в концентрации 0,3 мг/л на этой питательной среде до 50-го дня культивирования не оказывал отрицательного влияния на растения. Позже (на 64-й день культивирования) отмечено угнетение образования и роста корней и, как следствие этого, уменьшение величины ризогенной зоны, а также снизилось число образовавшихся листьев и коэффициент полярности, то есть нарушилось оптимальное соотношение между развитием корней и побегов.

Таблица 2
Скорость роста пробирочных растений винограда сорта Рупестрис дю Ло на питательных средах различного состава Варианты Скорость роста мм/день на день культивирования питательная среда ИУК, мг/л эмистим, % ризогенной зоны растений 17 31 49 64 17 31 49 64 Мурасиге и Скуга (прототип) 0 - - 0,05 0,1 0,5 0,2 0,3 0,4 0,6 0,1 - 0,03 0,01 0,1 0,9 0,4 0,4 0,5 0,7 0,3 - 0,03 0,06 0 0,7 0,3 0,4 0,6 0,7 Мурасиге и Скуга (техн. решен. без эмистима) 0 - 0,7 1,3 1,2 2,0 0,3 0,5 1,0 1,1 0,1 - 0,02 1,6 2,6 2,9 0,4 0,8 1,5 1,7 0,3 - 0,05 2,1 3,0 2,8 0,1 0,6 1,5 1,8 Мурасиге и Скуга (заявл. техн. решен. с эмистимом) 0,3 0 0,1 3,3 3,4 - 0,4 1,6 1,7 - 0,3 10 -10 2,3 4,0 5,0 - 0,4 1,8 2,2 - 0,3 10 -9 1,0 4,0 5,3 - 0,5 1,4 1,9 - 0,3 10 -8 1,5 3,3 4,8 - 0,4 1,2 1,7 - 0,3 10 -6 2,1 2,1 5,4 - 0,5 1,2 1,3 -

На питательной среде Мурасиге и Скуга (техническое решение без эмистима) улучшились все показатели развития растений: число корней увеличилось в 2,1-5,8 раз, их длина в 1,1-3,9 раза, величина ризогенной зоны в 7,0-8,4 раза, в 2,2-3,0 увеличилось высота растений и несколько увеличилась образование листьев.

При применении ИУК в концентрации 0,1-0,3 мг/л существенной разницы в развитии растений не отмечено. Длина корней уменьшилась, но число их увеличилось, что не оказало отрицательного влияния на величину ризогенной зоны и на процесс стеблеобразования. Таким образом, на модифицированной среде Мурасиге и Скуга с уменьшенным количеством макроэлементов и витаминов возможно применение ИУК в концентрации 0,1-0,3 мг/л.

Кроме этого, эмистим оказал влияние на скорость роста ризогенной зоны и побегов (табл.2). Показатели скорости роста при добавлении эмистима в питательную среду уже на 49 день культивирования превосходили почти в 2 раз показатели роста пробирочных растений на питательных средах без эмистима на 64 день культивирования. То есть происходит ускорение процесса клонального микроразмножения более чем на две недели и, как следствие, повышение его эффективности.

Стимулирование развития корней и побегов отмечено у всех сортов и подвоев, но концентрации, обеспечивающие стимулирование, были различными для каждого сорта (табл.3). Так у сорта Дружба, подвоев Кобер5ББ, 1615-2 лучшее развитие растений произошло при разведении эмистима 10 -7 -10 -8 мл/л, у сорта Цветочный при разведении 10 -10 .

При добавлении эмистима в питательную среду у сорта Рупестрис дю Ло (табл.3) происходит увеличение числа корней, причем более значительное, чем меньше разведение препарата. Влияние эмистима на длину корней менее значительное. Увеличение числа корней и их длины сказалось на величине ризогенной зоны во всех вариантах опыта. При разведении 10 -10 она составила 246,4 мм, а при разведении 10 -7 - 266,5 мм.

Под воздействием эмистима произошли изменения и в надземной части пробирочных растений. Увеличение высоты растений отмечено при концентрации препарата 10 -10 и 10 -9 %. При концентрации эмистима 10 -7 % произошло торможение роста растений, что связано с чрезмерным развитием корневой системы. Аналогичные изменения произошли и с образованием листьев, большее их число отмечено при разведении эмистима 10 -10 и 10 -9 .

Таким образом, по длине корней, высоте растений и образованию листьев выделился вариант с добавлением в питательную среду препарата эмистим в разведении 10 -10 .

Таблица 3
Развитие пробирочных растений различных сортов винограда при различных концентрациях эмистима Варианты Выход растений, шт. Корни Побеги число, штук длина, мм ризогенная зона, мм длина, мм число листьев, шт Кобер 5ББ Контроль 89,2 9,8 18,4 180,3 73,5 6,6 Эмистим 10 -9 75,0 8,9 18,8 167,3 81,9 7,1 Эмистим 10 -8 78,6 8,7 23,5 204,4 87,8 8,1 Эмистим 10 -7 71,4 7,9 19,1 150,8 59,4 6,2 Эмистим 10 -6 64,2 5,6 19,3 108,0 55,3 5,8 1615-2 Контроль 82,1 3,8 11,7 44,4 65,1 1,4 Эмистим 10 -9 96,4 2,8 21,8 61,0 58,6 1,1 Эмистим 10 -8 85,7 2,3 17,0 55,3 60,9 1,7 Эмистим 10 -7 85,7 4,0 14,4 57,6 65,8 1,9 Эмистим 10 -6 100,0 1,8 18,4 33,1 48,6 0,9 Дружба Контроль 50,0 2,2 27,3 60,0 13,2 1,4 Эмистим 10 -9 60,7 2,2 35,4 77,8 - - Эмистим 10- 8 60,7 3,2 23,4 74,9 23,9 1,7 Эмистим 10 -7 67,8 2,8 26,4 73,9 18,5 1,9 Эмистим 10 -6 75,0 0,9 8,6 7,7 2,5 0,9 Цветочный Контроль 92,8 4,0 21,0 84,0 29,5 3,1 Эмистим 10 -10 100,0 3,6 25,1 90,3 33,8 3,4 Эмистим 10 -8 85,7 4,85 14,5 69,6 23,3 2,5 Эмистим 10 -6 92,8 2,8 12,8 35,8 15,0 1,8 Рупестрис дю Ло Контроль 89,4 3,1 54,0 168,0 85,7 5,2 Эмистим 10 -10 100,0 3,4 71,8 246,4 110,0 5,7 Эмистим 10 -9 92,8 4,6 55,9 258,4 91,1 5,5 Эмистим 10 -8 89,2 4,7 50,1 237,8 85,3 4,8 Эмистим 10 -6 82,1 5,4 49,0 266,5 63,3 5,0 Каберне северный Контроль 25,0 3,7 7,6 37,2 26,0 3,3 Эмистим 10 -10 67,8 7,6 14,9 113,2 44,7 3,1 Эмистим 10 -9 67,8 6,4 15,8 100,2 33,4 3,0 Эмистим 10 -8 67,8 5,2 16,8 87,3 36,3 3,0 Эмистим 10 -7 75,0 3.8 17,9 68,0 32,2 2,7

Аналогичные результаты получены при культивировании на питательной среде с эмистимом сорта Каберне северный. Увеличение числа корней, их длины, величины ризогенной зоны отмечено во всех вариантах с эмистимом, но наиболее значительное увеличение этих показателей произошло при разведении 10 -10 %. В этом варианте также отмечены более высокие показатели роста растений и образования листьев.

Следует отметить, что у обоих сортов винограда при концентрации эмистима 10 -7 % отмечалось торможение роста растений и образования листьев, что отрицательно влияет на коэффициент размножения этих сортов.

Наблюдение за ходом развития пробирочных растений сорта Рупестрис дю Ло (табл.4) показало, что в варианте с эмистимом 10 -10 % произошло самое незначительное в опыте, причем с начала культивирования, отставание в росте корней и побегов. В контроле и других вариантах с эмистимом наблюдалось как отсутствие роста корней, так и отсутствие роста побегов до 49-го дня культивирования. В связи с этим выход растений в этих вариантах был 82,1-92,8%, а в варианте с эмистимом 10 -10 -100%.

Таблица 4
Ход развития пробирочных растений винограда при добавлении эмистима в питательную среду Варианты Отсутствие роста Выход растений, % корней, штук на день побегов, штук на день 15 34 49 63 15 34 49 - Рупестрис дю Ло Контроль 5 3 2 - 15 34 49 - 89,4 Эмистим 10 -10 3 1 - - 5 5 - - 100,0 Эмистим 10 -9 6 2 2 - 6 2 2 - 92,8 Эмистим 10 -8 10 3 2 - 9 2 2 - 89,2 Эмистим 10 -7 13 6 3 - 8 3 3 - 82,1 Каберне северный Контроль 25 22 22 21 24 23 21 25,0 Эмистим 10 -10 12 5 8 7 27 15 11 9 67,8 Эмистим 10 -9 15 8 10 7 26 15 13 8 67,8 Эмистим 10 -8 13 8 8 6 28 15 10 7 75,0 Эмистим 10 -7 14 15 11 12 26 17 13 14 50,0

У сорта Каберне северный под влиянием эмистима также улучшилось образование и рост корней и побегов, а выход растений по сравнению с контролем увеличился в 2-3 раза.

Анализ применения эмистима при микрочеренковании сортов винограда показал, что препарат эмистим способствует повышению эффективности клонального микроразмножения оздоровленных растений. Это происходит за счет улучшения приживаемости микрочеренков, более быстрого образования и роста корней, побегов и листьев, что обеспечивает, как мы отмечали выше, ускорение процесса клонального микроразмножения более чем на две недели и, как следствие, повышение его эффективности.

Добавление препарата эмистим в питательную среду на этапе микрочеренкования, помимо вышеизложенного, способствует улучшению процесса адаптации растений к нестерильным условиям, благодаря чему при высадке пробирочных растений в торфоперегнойные горшочки практически отсутствует их гибель, и выход растений составляет 99,0-100%.

Большое значение имеет правильно подобранная концентрация препарата, так как помимо стимулирующего эффекта может наблюдаться и ингибирование, чрезмерное развитие ризогенной зоны, тормозящее развитие побегов и образование листьев, что ведет к снижению коэффициента размножения.

Таблица 5
Влияние препарата эмистим на эффективность клонального микроразмножения оздоровленных растений винограда Показатели Заявленное техническое решение Прототип Рупестрис дю Ло Число корней, штук 3,4 0,3 Длина корней, мм 71,8 2,3 Величина ризогенной зоны, мм 246,4 20,8 Высота растений, мм 110,0 49,6 Число листьев, штук 5,7 4,0 Выход растений, % 100,0 78,6 Каберне северный Число корней, штук 8,3 4,6 Длина корней, мм 22,0 16,6 Величина ризогенной зоны, мм 182,6 76,3 Высота растений, мм 92,0 51,0 Число листьев, шт 6,9 5,0 Выход растений, % 67,8 25,0

Заявленное техническое решение способствует усилению функций иммунитета размножаемых растений, активации их защитных механизмов их против многих патогенов, улучшению приживаемости микрочеренков.

При уменьшении концентраций макросолей и витаминов в составе питательной среды улучшаются показатели развития растений, что способствует улучшению выхода (до 99-100%) и качества адаптированных растений и, в конечном итоге, ускорению процесса закладки базисных маточников для перевода виноградарства на сертифицированную основу.

Реферат патента 2005 года СПОСОБ ОПТИМИЗАЦИИ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ВИНОГРАДА IN VITRO

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к способам размножения винограда in vitro. Проводят микрочеренкование пробирочных растений и высадку их на жидкую питательную среду с уменьшенным количеством макроэлементов и витаминов с добавлением в ее состав индолилуксусной кислоты 0,1-0,3 мг/л и препарата эмистим в концентрации 10 -7 -10 -10 %. Изобретение позволяет эффективно размножить перспективные сорта винограда, оздоровленные от вирусной инфекции. 6 табл.

Формула изобретения RU 2 264 706 C2

Способ микроклонального размножения винограда in vitro, включающий микрочеренкование пробирочных растений, высадку их на питательную среду Мурасиге и Скуга без ростовых веществ и с уменьшенным количеством макроэлементов, отличающийся тем, что посадку и культивирование осуществляют на жидкой питательной среде с добавлением индолилуксусной кислоты 0,1-0,3 мг/л и эмистима в концентрации 10 -7 -10 -10 %.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к способам размножения растений, и может быть использовано в виноградстве для ускоренного размножения оздоровленных от вирусной инфекции перспективных сортов винограда путем снижения затрат на дорогостоящие препараты.

Известен способ размножения винограда, при котором проводят вычленение меристематических эксплантов, их высадку и культивирование (патент №2120739 от 27.10.1998 г. МПК A01H 4/00).

Однако в известном техническом решении для стимуляции микроэксплантов используют электромагнитное СВЧ-поле в комплексе с узкополосным лазерным лучом, что усложняет способ, повышает затраты.

Известен также способ микроклонального размножения, включающий расчленение пробирочных растений на питательной среде Мурасиге-Скуга с одновременным использованием биопрепаратов (патент №2265319 от 10.12.2005 г. МПК A01H 4/00).

Сложность известного технического решения заключается в том, что биопрепараты гиббереллиновой и цитокининовой пород выделяют из грибов, которые воздействуют на процессы роста и развития растений на этапе ввода меристем в культуру.

Однако экспланты для своего развития требуют дополнительного введения и других элементов для своего развития, что снижает эффективность способа и повышения затраты.

Наиболее близким техническим решением является способ, при котором проводят микроразмножение in vitro путем микрочеренкования пробирочных растений и высадку их на жидкую питательную среду с добавлением макроэлементов, витаминов и биопрепаратов (патент №2264706 от 27.112006 г. МПК A01H 4/00, A01N 25/00, C12N 5/00).

Однако в способе-прототипе для размножения микрочеренкования используют дорогостоящие препараты для формирования питательной среды, что усложняет способ, повышает себестоимость продукции.

Технический результат - снижение себестоимости продукции и повышение эффективности способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Опыт был заложен на сорте винограда Августин в 5-ти вариантах, табл.1. В каждом варианте по 3 повторности. В каждой повторности по 6 пробирок с микрочеренками. Изучали влияние модифицированных питательных сред на период роста и развития растения винограда в условиях in vitro.

Технология черенкования пробирочных растений обычная. Дата черенкования 1.08.2012 г. Наблюдения за растениями проводились в течение 41 дня до 11.09.2012 г. - ежедневно, отмечая дату появления корней и листьев. Измерения высоты растений, подсчет листьев и основных корней провели через 41 день после черенкования.

Отмечено, что рост корней в варианте 5 существенно увеличился и по количеству корней, которые превзошли контроль.

Образование листьев в варианте 5 началось на десятый день после черенкования, а на 13 день образование листьев началось на всех вариантах опыта.

Дальнейшие наблюдения за ростом и развитием растений показали, что экспланты в вариантах 2 и 3 на бедных питательных средах хотя и показали вначале неплохие результаты по укоренению, намного отставали в росте и развитии по сравнению с вариантами 1, 4, 5 (табл.2).

Существенные различия по количеству корней, листьев и по высоте растения наблюдаются в вариантах 4 и 5. У эксплантов, помещенных на эти среды, проходил более интенсивный рост растения в высоту и образование корней, по сравнению с контрольным вариантом (табл.2).

Данные результаты сведены в таблицу 2, из которой следует, что питательная среда №4 наиболее оптимальная, обеспечивая за сравнительно короткий период увеличение количества основных корней, листьев и высоту растений.

Следовательно, в предлагаемом способе снижаются затраты на питательную среду и повышается его эффективность.

Влияние различных, питательных сред на рост и развитие растений винограда при микрочеренковании (метод in vitro)