Амилолитическая активность микроорганизмов при посеве на плотные среды выявляется с использованием
Обновлено: 05.10.2024
На основании анализа литературных источников выявлено, что в настоящее время представляется актуальным поиск микроорганизмов продуцентов ферментов, в том числе амилазы. Одним из перспективных в этом плане биообъектов является природный микробный симбионт Medusomyces gisevii (чайный гриб), который благодаря неидентичности микробиологического состава и различным условиям выращивания может иметь различный компонентный состав метаболитов. Проведены исследования амилолитической активности культуральной жидкости Medusomyces gisevii на 10-е, 20-е и 30-е сутки культивирования. Выращивание гриба осуществлялось в лабораторных условиях по классической методике. Установлено, что данный микроорганизм начинает проявлять амилолитическую активность уже на 10-е сутки культивирования в стандартной питательной среде и сохраняет ее на всем протяжении эксперимента (30 суток). С течением времени амилолитическая активность повышается. Однако интенсивность метаболизма микроорганизмов, критерием которой является соотношение общей и экзогенной амилазы, наиболее выражена на ранних сроках культивации.
1. Бруслик Н.Л. Сравнительная характеристика амилолитической активности грамположительных бактерий / Н.Л. Бруслик, А.Р. Каюмов, М.И. Богачев, Д.Р. Яруллина // Вестник ВГУ, Серия: Химия. Биология. Фармация – 2014 – № 2 – С. 47–51.
4. Даниелян Л.Т. Чайный гриб (Kombucha) и его биологические особенности / Л.Т. Даниелян – М.: Медицина, 2005. — 176 с.
5. Колб В.Г., Камышников В.С. Справочник по клинической химии / В.Г. Колб, В.С. Камышников – Минск: Беларусь, 1982. – 234 с.
6. Костылева Е.В. Разработка биотехнологического процесса получения комплексных ферментных препаратов термостабильной α-амилазы и протеазы на основе нового мутантного штамма Bacilluslicheniformis: дис … канд. техн. наук: 05.18.07 / Костылева Елена Викторовна. – М., 2003 – 157 с.
Биокатализаторы использовались человеком на протяжении многих веков, и на сегодняшний день количество ферментов, применяемых в различных сферах жизни, постоянно растет. В настоящее время актуальным является поиск наиболее перспективных способов получения ферментов, так как производство препаратов на их основе занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии, а объемы продукции постоянно увеличиваются [3]. Столь широкое применение ферментов связано с их биологической ролью – способностью во много раз увеличивать скорость химических реакций, а также чрезвычайно высокой специфичностью по отношению к определенным веществам и типам реакций.
Достаточно широко и успешно применяются амилазы, которые делятся на альфа-, бета- и гамма-амилазу, что связано с их распространением в природе, а также с особой специфичностью по отношению к субстрату.
Существенна роль амилаз в живом организме. Данные ферменты относятся к классу гликозил-гидролаз и катализируют гидролиз крахмала, гликогена и родственных полисахаридов и олигосахаридов с образованием моносахаридов, играя, по нашему мнению, существенную роль в обеспечении механизма пребиотического действия. Амилазная активность микроорганизмов — симбионтов организма человека может иметь клиническое значение в таких процессах, как, например, гидролиз крахмала кишечной микрофлорой или ингибирование образования биопленок у патогенных бактерий [1].
Механизм действия амилаз обусловливает их применение в областях производства, использующих крахмалосодержащее сырье. К ним относится медицинская, текстильная, мясомолочная, спиртовая промышленность, тонкие химические технологии, пивоварение, хлебопечение, производство детергентов, кормовых добавок в сельском хозяйстве, переработка отходов мясной и птицеперерабатывающей промышленности [6].
В период, предшествующий интенсивному развитию ферментной промышленности, главнейшим источником амилазы в странах Европы был солод. Из животного сырья получали амилазы, применяющиеся в медицинских целях [3]. Общепринято, что одним из главных источников амилаз являются микроорганизмы. Для получения промышленных препаратов амилазы используют грибы – Aspergillus oryzae, Aspergillus niger и Aspergillus wentii. Среди бактерий к активным продуцентам амилаз относятся некоторые бациллы (Bacillus macerans, Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis), псевдомонады и различные виды стрептомицетов. Амилаза, выделяемая из культуры Bacillus stearothermophilus, не утрачивает своей активности даже при кратковременном нагревании до 1000С. Амилолитические ферменты синтезируют также некоторые дрожжи и дрожжеподобные грибы родов Saccharomyces, Candida, Endomycopsis и Endomyces [2].
На сегодняшний день не утрачивает актуальности изыскание новых микроорганизмов — продуцентов амилазы. По нашему мнению, в качестве приоритетных в этом плане могут выступать природные микробные симбионты, обладающие высокой ферментативной активностью. Одним из таких объектов является природный симбионт Medusomyces gisevii (чайный гриб), который представляет собой сложную микробную ассоциацию в виде массы (зооглеи) на поверхности жидкости и пылевидного осадка на дне сосуда [4]. Достоверно известно, что в состав симбиоза входит несколько видов уксуснокислых бактерий и дрожжей, однако многие авторы при описании этого организма отмечают неидентичность микробиологического состава образцов, отобранных из различных регионов культивирования. Этот факт в совокупности с неидентичностью воспроизведения условий выращивания может приводить к различному компонентному составу метаболитов чайного гриба. В литературных источниках имеются упоминания о содержании в культуральной жидкости чайного гриба фермента амилазы, но данные эти единичны и не содержат сведений о количестве этого фермента на разных этапах культивирования.
Цель работы
Материалы и методы исследования
В качестве исследуемого объекта выступала культуральная жидкость Medusomyces gisevii (чайный гриб), отобранная на разных этапах культивирования (10-е, 20-е и 30-е сутки), которое осуществляли в течение месяца при комнатной температуре по классической методике на питательной среде, состоящей из кипяченой водопроводной воды, сахарозы (10%), экстракта черного чая (0,1%).
Маркером интенсивности метаболизма бактериальных клеток, входящих в симбионт, послужило количество общей амилазы в нативной культуральной жидкости, содержащей, кроме жидкой части, фрагменты волокон гриба и микроорганизмы. Однако на практике в биотехнологических и медицинских целях не исключено использование свободного от различных примесей культурального фильтрата исследуемой субстанции. Кроме того, соотношение количества амилазы (общей) в нефильтрованной культуральной жидкости к данному показателю в фильтрате, по нашему мнению, в той или иной мере отражает интенсивность экзогенной метаболической активности микроорганизмов-продуцентов, что характеризует их биотехнологический потенциал.
В связи с вышеизложенным каждая проба культуральной жидкости подразделялась на 2 части. Одна часть подвергалась ультрамикрофильтрации через фильтр 0,22 мкм с целью освобождения исследуемого субстрата от присутствия в нем крупных примесей, нитей и микроорганизмов. Вторая часть пробы фильтрации не подвергалась. Все исследования проводились в десятикратном повторе.
Для определения амилолитической активности использовали метод Каравея [5] в нашей модификации. Принцип метода основан на колориметрическом определении концентрации амилодекстрина по степени интенсивности реакции с йодом и длине волны 650 нм до и после ферментативного гидролиза крахмала амилазой, содержащейся в культуральной среде. При этом нами были определены экспериментальным путем соотношения субстрата и ферментной составляющей. За единицу активности фермента принимали его количество, содержащееся в 1 мл исследуемого биологического раствора, которое расщепляет амилодекстрин (в мкг) за 1 мин при 37°С.
Удельную амилолитическую активность в пробах вычисляли по формуле:
Х= ,
где Х – удельная амилолитическая активность ферментного препарата культуральной жидкости чайного гриба (мкг/мин×мл); Дк – оптическая плотность контрольного раствора (нм); Дп – оптическая плотность опытного образца (нм); t – время инкубации фермент-субстратной смеси (мин); V – объем пробы (мл).
Результаты исследований
Результаты исследования, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что культуральная жидкость чайного гриба проявляет амилолитическую активность, которая закономерно возрастает с 10-х по 30-е сутки культивирования до 167,8±3,1мкг/мин×мл.
Средние показатели амилолитической активности культуральной жидкости чайного гриба на разные сутки культивирования, (М±m)*
ИЗУЧЕНИЕ АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ, ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ И ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММ ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS SUBTILIS ПРИ ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ
Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Введение. Ферменты - это специфические катализаторы белковой природы. Они вырабатываются клетками и тканями организмов, и которые играют центральную роль в каждом биохимическом процессе. Они катализируют сотни ступенчатых реакций по разрушению питательных веществ, сохранению и трансформации химической энергии и получении биологических макромолекул из простых предшественников. Исследование ферментов имеет огромное практическое значение в связи с применением, которое основано на их высокой каталитической активности и более высокой по сравнению с небиологическими каталитическими системами субстратной специфичностью [1,2].
Целью данного исследования является получение ферментов из Bacillus subtilis, используя в качестве субстрата экстракт пивной дробины.
Ранее авторами [3] приведен аминокислотный состав сухой пивной дробины, где показано, что при анализе особое внимание уделяется содержанию незаменимых аминокислот, которые обусловливают биологическую ценность белков.
Методы исследования. В работе проведен скрининг амилолитической активности B. Subtilis, где для его выявления использовали среду Лоурия-Бертони (LA), в который вносится 1%-ный раствор крахмала. После инкубирования микроорганизмов раствор Люголя был добавлен для идентификации окрашенной зоны. По наличию окрашивания и его диаметра, образованного после добавления раствора Люголя, устанавливают амилолитическую активность культуры [4,5].
Амилолитическая активность. Для выявления амилолитической активности использовали плотные питательные среды: MRS (Merck) - для лактобацилл и Лоурия-Бертони (LA) - для остальных бактерий, в которые вносили 1% во-дорастворимый картофельный крахмал. Исследуемые микроорганизмы высевали штрихом на чашки Петри и инкубировали при 37 о С в течение 2 – 5 суток. Гидролиз крахмала обнаруживали по бесцветным зонам вокруг штриха (колоний) после обработки агаровой пластинки раствором Люголя. Среда, содержащая крахмал, окрашивалась в синий цвет.
Состав питательной среды. В 1 литре дистиллированной воды растворяют 6 г. бактериологического пептона, 0,5 г. MgSO4.7H2O, 0,5 г. KCL, 1 г. субстрата. Затем 100 мл среды в конической колбе подогревается на плитке и стерилизуется в автоклаве при 120 0 С.
Определение протеолитической активности. Определение протеолитической активности проводили по гидролизу 1 % раствора казеина протеазами исследуемых штаммов. За единицу протеолитической активности принимали количество фермента, которое за 1 мин при 37°Си рН 7,2 повышает в неосаждаемых трихлоруксусной кислотой продуктах протеолиза содержание тирозина на 1 микроэквивалент или за 10 мин при той же температуре повышает оптическую плотность раствора при 280 нм на 1 единицу.
Исследование влияния рН на выход амилазы. Влияние рН было исследовано для значений рН от 6 до 9 для B. subtilis, выход амилазы исследован по методу ДНСК [6,7].
Определение редуцирующих сахаров по реакции с 3,5 – диннитросалициловой кислотой. При взаимодействии сахаров с 3, 5 – динитросалициловой кислотой последняя восстанавливается в 3-амино 5-нитросалициловую кислоту. В мерной колбе на 1 литр в дистиллированной воде растворяют 10 г. 3,5 динитросалициловой кислоты, 300 г. Сегнетовой соли, 16 г. Едкого натра и доводят до метки водой. Раствор выдерживают два дня в темном месте, затем фильтруют в склянку оранжевого цвета и хранят в темноте. К 1 мл испытуемого раствора приливают 2 мл динитросалицилового реактива, нагревают 5 мин. В кипящей водяной бане, охлаждают до комнатной температуры, доводят до объема 25 мл. Определение оптической плотности проводят при 530 нм (зеленый светофильтр).
Определение гидролитической активности. Гидролитическая активность определяется в надосадочной жидкости из культур, которую получают путем центрифугирования полного объема культуры. В реакционную смесь вводят 900 мл соответствующего полисахаридного субстрата и 100 мл надосадочной жидкости. Пробы по 50 мл отбирают в исходный момент и через каждые 30 мин в течение 1,5-3 ч. Для контроля к субстрату добавляют гомологичную надосадочную жидкость, прогретую в течение 10 мин при 80 0 С. Реакцию останавливают нагреванием проб при 95 0 С в течение 10 мин. Определяют активность путем определения концентрации глюкозы, используя колориметрический метод. Для этого измеряют оптическую плотность на фотоколориметре при длине волны 490 нм, и по градуированному графику определяют концентрацию моносахарозы. Гидролитическую активность ферментов выделенной глюкозы за 1 мин (мкмоль/мин) рассчитывают на 100 мл надосадочной жидкости исследуемых штаммов.
В качестве полисахаридных субстратов используется водорастворимый крахмал, а также экстракт пивной дробины.
Результаты и обсуждение. В данной работе представлены результаты по исследованию амилолитической, протеолитической и гидролитической активности выделенного штамма Bacillus subtilis при глубинном культивировании.
Выделенные штаммы Bacillus subtilis были исследованы на способность гидролизовать растительные полимерные углеводы, в качестве источника которых была использована пивная дробина.
Рисунок 1 показывает влияние рН на активность ферментов, вырабатываемых B. subtilis. Было установлено, что наиболее оптимальным рН для амилолитической и протеолитической активности является 9 при концентрациях 1,15 и 0,8 мг/мл/сек соответственно.
1 – амилаза; 2 - протеаза
Рисунок 1. Влияние рН на выход ферментов амилазы и протеазы, продуцируемых B.subtilis
В сравнении с глубинными стационарные культуры имели более низкий уровень гидролитических ферментов: максимальный уровень суммарной гидролитической активности штамма наблюдался на 4-й день инкубации. Сравнение значений гидролитической активности пленочных и глубинных культур показывает, что более эффективным является глубинное культивирование.
Более замедленная динамика нарастания активности ферментов гидролаз при стационарном культивировании может объясняться дополнительным временем (10-15 ч), которое требуется для формирования пленки.
Помимо суммарной гидролитической активности с использованием в качестве субстрата отвара пивной дробины была определена гидролитическая активность надосадочной жидкости штаммов в отношении крахмала (табл.1).
Таблица 1 - Активность внеклеточных гидролаз в глубинных и пленочных культурах штаммов
Скорость образования продуктов реакции (мкмоль/мин. при гидролизе различных субстратов)
Методы определения амилолитической активности
Enzyme preparations.
Methods for the determination of amylase activity
МКС 07.100.30
65.120
ОКСТУ 9291
Дата введения 1990-07-01
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Министерством медицинской и микробиологической промышленности СССР
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 24.03.89 N 677
Изменение N 1 принято Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 12 от 21.11.97)
За принятие изменения проголосовали:
Наименование национального органа стандартизации
Главная государственная инспекция Туркменистана
4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
Обозначение НТД, на который дана ссылка
Номер раздела, пункта
5. Ограничение срока действия снято по протоколу N 4-93 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 4-94)
6. ИЗДАНИЕ с Изменением N 1, утвержденным в октябре 1997 г. (ИУС 4-94)*
Настоящий стандарт распространяется на ферментные препараты и устанавливает методы определения активности амилолитического комплекса ферментных препаратов микробного происхождения.
1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ
Методы отбора проб - по ГОСТ 20264.0.
2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (АС)
2.1. Метод основан на гидролизе крахмала ферментами амилолитического комплекса до декстринов различной молекулярной массы.
Амилолитическая активность характеризует способность амилолитических ферментов катализировать гидролиз крахмала до декстринов различной молекулярной массы и выражается числом единиц указанных ферментов в 1 г препарата.
За единицу амилолитической активности () принята способность фермента при определенных значениях температуры, рН и времени действия катализировать до декстринов различной молекулярной массы 1 г крахмала, что составляет 30% крахмала, введенного в реакцию.
2.2. Аппаратура, материалы, реактивы
Весы лабораторные общего назначения не ниже 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104*.
* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001.
Колориметр фотоэлектрический лабораторный (фотоэлектроколориметр) по НТД обеспечивающий измерения в интервалах длин волн 434-450 нм и 630-670 нм с погрешностью ±1% абс. (по коэффициенту пропускания) или 0,01 (по оптической плотности) или спектрофотометр.
Прибор для измерения рН среды в диапазоне 0-14 с погрешностью измерения ±0,1 рН.
Термостат или ультратермостат, обеспечивающий температуру нагрева (30,0±0,2) °С.
Термометры по ГОСТ 28498 диапазоном измерения 0-100 °С и ценой деления шкалы не более 0,1 °С.
Стаканчики для взвешивания по ГОСТ 25336.
Стаканы вместимостью от 100 до 2000 см по ГОСТ 25336.
Колбы типа Кн вместимостью от 100 до 2000 см по ГОСТ 25336.
Колбы мерные наливные 1-го или 2-го исполнения вместимостью 100, 200, 250 и 1000 см по ГОСТ 1770.
Воронки типа В по ГОСТ 25336.
Пипетки 1-1-2-0,5; 1-1-2-1; 1-2-2-5; 1-2-2-10; 1-2-2-25 по ГОСТ 29227.
Пробирки П1-21-200 или П1-16-150, или П2-19-180, или П2-16-150(180) по ГОСТ 25336.
Секундомер по НТД.
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
Крахмал растворимый по ГОСТ 10163.
Ацетатный буферный раствор с рН 4,7, приготовленный по ГОСТ 4919.2.
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный по ГОСТ 4172, раствор молярной концентрации моль/дм.
Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, раствор молярной концентрации моль/дм.
Читайте также: