Хранение культуры и размножение посевного материала в лаборатории

Обновлено: 18.09.2024

8.1. Техника посева и выделения чистых культур микроорганизмов

Доставляемый в лабораторию материал подвергают бакте­риологическому исследованию в тот же день. Техника посева зависит от характера засеваемого материала, консистенции пи­тательной среды и цели исследования.

Для проведения посевов необходимы: подлежащий исследо­ванию материал, питательные среды, бактериологическая пет­ля, шпатели (стеклянные, металлические), пастеровские и градуированные пипетки, металлические кюветы или поднос для переноса засеянных чашек и металлические коробки для пере­носа пробирок, ведро или бачок с крышками для сброса отра­ботанного инфицированного материала, спиртовая или газовая горелка.

Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. При взятии петлей жидкость должна образовать в кольце петли тонкую прозрачную пленку – "зеркало". Пипетками пользу­ются в том случае, когда материал засевают в большом или точно отмеряемом объеме.

Способ взятия плотного материала определяется его кон­систенцией. При посевах чаще всего пользуются бактериоло­гической петлей.

Все манипуляции, связанные с посевом и выделением мик­робных культур, производят над пламенем горелки. Бактери­альную петлю перед взятием материала прокаливают в пламени горелки, затем ее остужают так, чтобы при соприкосновении с жидкой средой она не вызывала кипения жидкости, а при­косновение к агару не сопровождалось его плавлением. Для остуживания петли лучше всего погружать ее в конденсацион­ную жидкость пробирки со стерильной питательной средой или прикасаться к крышке чашки Петри со стерильной средой. Нельзя остужать петлю прикосновением к поверхности пи­тательной среды, даже свободной от микробного роста, так как на ней могут находиться колонии, не видимые простым глазом.

После окончания посева петлю прожигают повторно для уничтожения находящейся в ней микробной культуры или инфицированного микроорганизмами материала.

Пипетки и шпатели, использованные для посевов, опускают в дезинфицирующий раствор.

После посева на чашках Петри со стороны дна, на пробир­ках – в верхней трети надписывают название засеянного ма­териала или ставят номер анализа и дату посевов.

8.1.1. Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды

  • При посеве в жидкую питательную среду петлю с находя­щимся на ней материалом погружают в среду. Если мате­риал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду.
  • При посеве на скошенный мясопептонный агар пробирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают правой рукой IV и V пальцами, не прикасаясь к той ее части, которая входит внутрь пробирки. Остальные три пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериологической петли, посредством которой произво­дится посев. Петлю держат, как писчее перо. После выни­мания пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее по­сторонних микроорганизмов из воздуха.

При посеве на скошенный агар петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опус­кают плашмя на поверхность питательной среды и скользящи­ми движениями наносят штрихи снизу вверх от одной стенки пробирки к другой (рис. 8.1).

  • • При посеве на поверхность плотной питательной среды из пробирки в чашки Петри пробирку фиксируют II, III и V пальцами левой руки, а крышку чашки Петри приоткрыва­ют I и IV пальцами левой руки настолько, чтобы в образо­вавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель (рис. 8.2). Небольшое количество исследуемого материала, взятого из пробирки бактериологической петлей, втирают в поверхность питательной среды у края чашки. Затем пет­лю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала. Линию посева начинают с того места, в котором находится материал. Бактериологическую пет­лю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поца­рапать ее поверхность, и проводят штрихи по всей среде или по секторам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на 4, 8 или 16 равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые пет­лей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микробов в концевой ее части.
  • • Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользовать­ся вместо петли тампоном или шпателем.

При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной сре­ды. Такой характер микробного роста получил название сплошного или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одно­го вида.

  • Для посева материала в толщу плотной питательной среды готовят взвесь в стерильной водопроводной воде или в изо­тоническом растворе. Набирают 0,1–1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного за­грязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15–20 мл мясопептонного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40– 45 "С (при такой температуре пробирка со средой, прило­женная к щеке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распределения исследуемого материала в пи­тательной среде закрытую чашку с содержимым слегка вра­щают по поверхности стола.
  • Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней матери­алом.
  • Калиброванной бактериологической петлей (диаметр 2 мм, емкость 0,005 мл) производят посев мочи на сектор А чаш­ки Петри с простым агаром, сделав около 40 штрихов. Затем петлю прожигают и производят 4 штриховых посе­ва из сектора А в сектор I, из сектора I в сектор II и из сек­тора II в сектор III, каждый раз после прожигания петли (рис. 8.3).

Чашки инкубируют при температуре 37 °С в течение 18– 24 ч, после чего подсчитывают количество колоний, выросших в разных секторах, и определяют количество бактерий в 1,0 мл по приведенной табл. 8.1 (этот метод принят для определения степени бактериурии).

Таблица 8.1. Определение количества бактерий в 1 мл методом секторных посевов*

Количество колоний в секторах

Количество бактерий в 1 мл

*Приказ № 535 от 22 апреля 1985 г. "Об унификации микробиологи­ческих (бактериологических) методов исследования, применяемых в кли­нико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учрежде­ний" (Москва, 1985).

8.1.2. Методы выделения чистых культур

Чистой культурой принято называть совокупность однород­ных микроорганизмов, относящихся к одному виду, полученных из массы одной колонии, клетки которой идентичны по морфологическим, тинкториальным, культуральным, метабо­лическим и генетическим признакам, так как по существующим представлениям микробная колония является популяцией бактериальных клеток, возникшей в результате размножения единственной материнской клетки. Микробная колония являются аналогом клона.

Чистые культуры микроорганизмов одного вида, выделен­ные из различных источников, могут отличаться друг от друга незначительным отклонением морфологических, культуральных или биохимических признаков, не выходя за пределы своего вида или подвида. Такие культуры называют штаммами. Вместо ранее именованных типов в зависимости от характера изменившегося признака их обозначают морфоварами (отлич­ные по морфологическим признакам), сероварами (имеющие антигенные отличия), биоварами (отличающиеся биологичес­кими свойствами).

Чистая культура необходима для изучения морфологичес­ких, культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение полу­чил метод механического разъединения микроорганизмов, на­ходящихся в исследуемом материале, с целью получения изо­лированных колоний на поверхности или в глубине питатель­ной среды. Очень широко применяются селективные питатель­ные среды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить. Некоторые виды микробов обладают высокой чувствительностью к воз­действию определенных факторов внешней среды. Индивиду­альная устойчивость микробов к тому или иному фактору была использована для разработки методов выделения чистых куль­тур путем умерщвления сопутствующей микрофлоры. Этим способом производится выделение споровых форм микробов, устойчивых к действию высокой температуры, микобактерий туберкулеза, безразличных к действию концентрированных растворов минеральных кислот, в отличие от остальных мик­робов, содержащихся в мокроте.

При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней мик­рофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных жи­вотных, восприимчивых к тому виду микроба, который предполагается выделить из исследуемого материала. Биологичес­кий метод выделения чистой культуры применяется при иссле­довании мокроты на содержание в ней пневмококков, микобактерий туберкулеза.

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху). Три пробирки, содержащие по 15 мл мясопептонного агара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43–45 °С. В пробирку вносят одну бактериологическую петлю исследуе­мого материала. Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку вращают несколько раз, зажав между ладонями. После этого одну петлю (прокаленную и остуженную) содержимого 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в 3-ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам про­бирок.

После застудневания среды с исследуемым материалом чаш­ки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

Выделение чистой культуры по способу Дригальского. Рас­плавленную питательную среду разливают в три чашки Петри. Застывшую среду обязательно подсушивают, так как влажная поверхность ее способствует образованию сливного роста. В пер­вую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и сте­рильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды. Далее, не прожигая шпателя и не набирая нового ма­териала, шпатель переносят во 2-ю, а затем и 3-ю чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.

Метод рассева по поверхности, предложенный Дригальским, является наиболее употребительным для получения чис­той культуры микробов. Вместо шпателя можно пользоваться петлей. Материал на питательной среде распределяют парал­лельными штрихами по всей чашке в одном направлении. Затем, повернув чашку на 90°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посе­ва материал, находящийся в петле, расходуется постепенно, и по линиям штрихов, нанесенных в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

Выращивание и выделение чистых культур анаэробов. Для выращивания анаэробов необходимо создать определенные ус­ловия, сущность которых заключается в удалении молекуляр­ного кислорода из питательной среды и пространства, окружа­ющего эти культуры. Другим обязательным условием, обеспе­чивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду.

Единственным отличием питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, служит пониженное содержание в них свободного кислорода. Самым простым способом удале­ния растворенного кислорода является кипячение. Непосред­ственно перед посевом материала пробирки с питательными Средами кипятят на водяной бане в течение 10–20 мин. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, уда­ляется кислород. Свежепрокипяченную питательную среду бы­стро охлаждают, погружая в лед или подставляя под струю холодной воды, чтобы не дать ей насытиться кислородом воз­духа, и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху сте­рильным вазелиновым или парафиновым маслом (толщина слоя 1–1,5 см). Засев среды производят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки.

В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, ас­корбиновую кислоту, цистеин, гликокол, глутатион. Активно связываются с кислородом животные ткани паренхиматозных органов. На этом свойстве животных клеток основано приго­товление питательной среды Китта – Тароцци (рецепт 161), широко применяемой для выращивания анаэробов. В жидкие питательные среды помещают иногда пористые вещества: вату, пемзу, которые адсорбируют на своей поверхности пузырьки воздуха.

Для создания бескислородных условий используют физи­ческие, химические и биологические факторы.

Физические способы культивирования анаэробов:

  • • способ Виньяля – Вейона. Берут 4–5 пробирок с 0,5 % рас­плавленным и охлажденным до температуры 40–45 °С са­харным агаром. В содержимое одной из них вносят пипет­кой небольшое количество исследуемого материала и тща­тельно размешивают. Для уменьшения концентрации мате­риала с целью получения изолированных колоний засеян­ную среду в количестве, соответствующем объему внесен­ного материала, переносят из 1-й пробирки во 2-ю, из 2-й в 3-ю. Затем содержимым каждой пробирки заполняют ка­пилляры трех пастеровских пипеток.

Чтобы предупредить застывание питательной среды в мо­мент насасывания ее в пипетки, пока их кончик не обломлен, пипетки погружают на 3–5 мин в стерильную воду с темпера­турой 45–50 °С. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2–3 сут в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Выросшие колонии легко изо­лировать. Для этого капилляр надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию микро­ба, находящуюся в агаре, извлекают петлей и пересевают в свежую питательную среду;

  • • выращивание анаэробов в условиях вакуума. Вакуумные усло­вия для выращивания анаэробов создают в анаэростате или эксикаторе. Исследуемый материал или культуру микробов засевают в пробирки с жидкой средой или в чашки Пет­ри с плотной питательной средой. Посевы помещают в анаэростат, затем присоединяют его к насосу и выкачива­ют воздух. Степень разреженности воздуха определяют по показаниям вакуумметра. Колонии анаэробов в вакуум­ных условиях растут на поверхности плотной питательной среды.

Химические методы выращивания анаэробов (метод Аристовского). Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидро­сульфит натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор закры­вают крышкой и помещают в термостат при температуре 37 *С на 24–48 ч.

Биологический метод выращивания анаэробов (по Фортнеру). В чашку Петри наливают толстым слоем 5 % кровяной агар с 1–2 % глюкозы. Посередине чашки в питательной среде вы­резают стерильным скальпелем канавку шириной 1–1,5 см, которая делит питательную среду на две половины. Одну из них засевают культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом, другую половину – культурой аэробов: чудесной палочкой (Serratia marcescens) или кишечной палоч­кой (Escherichia coli). Перед посевом чашки подсушивают в термостате, чтобы аэробы вместе с капельками влаги не могли попасть на другую сторону чашки. Засеянные чашки закрыва­ют, а свободное пространство между дном и крышкой закле­ивают лейкопластырем, чтобы предупредить поступление в чашку кислорода извне. В термостате чашки устанавливают вверх дном. Быстро растущие аэробы, поглощая находящийся в чашке кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов.

Анаэростат для культивирования анаэробов. Анаэростат – прибор для выращивания микробов в анаэробных условиях – представляет собой толстостенную металлическую или пласти­ковую камеру с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакуумметр и два крана для присоединения к вакуум-насосу. Вместо кислорода в нем используются газо­вые смеси.

Штаммы микроорганизмов для производства биологических препаратов поступают на биопредприятие в виде чистых культур, законсервированными в ампулах. Каждая культура штамма имеет паспорт с описанием культурально-морфологических, биохимических и биологических свойств микроорганизма, характеристики сред и условий для их поддержания, выращивания, срока и условий хранения и транспортировки.

В основе хранения культур лежит охлаждение, замораживание или обезвоживание. Во всех этих случаях должен быть резко сокращен или полностью прекращен клеточный обмен веществ.

На практике культуры штаммов хранят с использованием следующих основных способов:

- на скошенном агаре при температуре -1 - -5 °С;

- замораживание со стабилизатором и хранение при температуре ниже -20 ° С. Недопустимо многократное оттаивание и замораживание;

- лиофилизация культуры и хранение в ампулах в течение нескольких лет.

Через определенное время, оптимальное для каждого способа хранения, культуру пересевают.

Перед началом технологических процессов культуру размножают в стерильных условиях.

Для приготовления посевного материала используют полноценную среду. Количество питательной среды в инокуляторе и биореакторе должно превышать 70% от общего объема. Если культуру в инокулятор вносят из колб, то количество посевного материала составляет примерно 0,1% объема питательной среды.

Для промышленных биореакторов обычно используют от 6 до 10% инокулянта. С плотной питательной среды выросшую культуру смывают стерильной питательной средой или физраствором и вносят в инокулятор в таком же объеме как и жидкую.

Тема 2. КЛАССИФИКАЦИЯ СПОСОБОВ И СИСТЕМ

КУЛЬТВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Для осуществления любого биотехнологического процесса мик-робного синтеза необходимы культура микроорганизмов, питательная

среда, аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций, средства контроля и управления.

Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства биопрепаратов.

На стадии культивирования осуществляется накопление, как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микроорганизмов.

Иногда (например, при производстве бактериальных препаратов) целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях - продукты, синтезируемые клеткой (антибиотики, ферменты, аминокислоты и др.). При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную жидкость.

Необходимые полезные свойства целевых продуктов (клеток или продуктов метаболизма) создаются, в основном, на стадии культивирования. Основная задача на последующих стадиях состоит в том, чтобы при выделении, сушке и других операциях максимально сохранить и стабилизировать эти полезные свойства.

Классификация способов и систем культивирования

Микроорганизмов

Культивирование микроорганизмов осуществляется следующими основными способами: поверхностное, глубинное, периодическое, отъемно-доливное и непрерывное.

При твердофазном поверхностном культивировании клетки растут на поверхности твердой (плотной) среды, содержащей достаточное количество влаги и питательных веществ.

При жидкофазном поверхностном культивировании микроорганизмы растут на поверхности жидкой питательной среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма.

При глубинном культивировании микроорганизмы распределяются по всему объему жидкой питательной среды, а источники газообразных продуктов питания (кислород, углекислый газ, азот) и компоненты питательной среды поступают к микроорганизмам в результате аэрации и перемешивания.

Глубинный способ культивирования микроорганизмов наиболее широко используется в производстве большинства биопрепаратов по следующим причинам:

1. Позволяет получить за более короткое время большее количество бактериальной массы или продуктов биосинтеза. Так, при культивировании микроорганизмов группы кишечной палочки в поверхностных условиях, количество микробов не превышает 1-2 млрд в мл применением глубинного культивирования, в зависимости от состава питательной среды и режимов культивирования, достигает 50-60 млрд. в мл.

2.Возможность осуществить управляемое культивирование, при котором основными управляющими воздействиями являются: аэрация, перемешивание, подача хладоагента или теплоносителя, титрантов для регулирования концентрации водородных ионов (рН), редуцентов для регулирования окислительно-восстановительного потенциала (еН) культуральной жидкости, пеногасителей для регулирования уровня пены в биореакторе, дозирования необходимых для оптимального роста культуры микроорганизмов азотных, углеводных, фосфорных и других субстратов, а также предшественников биосинтеза.

3.Возможность использования стандартного механизированного и автоматизированного технологического оборудования для культивирования (инокулятор, биореактор, что обеспечивает снижение подготовительных операций и операций съема биомассы) и повышения качества биопрепарата.

Для роста биомассы и биосинтеза продуктов метаболизма при культивировании необходимо соблюдение следующих условий:

- жизнеспособность посевного материала;

- наличие источника энергии;

- содержание в питательной среде компонентов, необходимых для синтеза биомассы;

- отсутствие в среде ингибиторов;

- поддержание в культуральной жидкости необходимых физико-химических условий жизнедеятельности культуры микроорганизмов.

Параметры роста

Основные факторы, влияющие на рост и развитие микроорганизмов, можно подразделить на две группы: внутриклеточные факторы, обусловленные структурой и специфическими особенностями организма, и внеклеточные факторы, т.е. условия внешней среды клетки. К внутриклеточным факторам относятся структура клетки, механизмы метаболизма и генетические характеристики, что является прерогативой цитологических, биологических и генетических исследований. Основной целью исследований в биотехнологии являются внеклеточные (внешние) факторы.

Для количественной характеристики роста микроорганизмов анализируются основные параметры роста.

Тема 3. ПЕРИОДИЧЕСКОЕ ГЛУБИННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Периодическое глубинное культивирование представляет собой закрытую систему, в которой скорость роста биомассы стремится к нулю из-за исчерпания субстрата и накопления ингибиторов. Такие системы всегда находятся в неустойчивом состоянии.

Фазы роста.

1. Лаг-фаза или индукционный период начинается после посева (инокуляции) в питательную среду микроорганизма и является периодом их адаптации. Во время этой фазы происходит реорганизация микро молекулярных и макромолекулярных составных частей микробной культуры, синтез или подавление ферментов или структурных компонентов клетки. Данная фаза, в зависимости от внешних условий, может быть короткой или довольно длинной. Во время этой фазы клеточная масса может изменяться без изменения числа клеток.

2. Лаг-фаза переходит в фазу экспоненциального роста. Это - период, быстрого накопления биомассы и продуктов реакции. Описывается экспоненциальной кривой.

3. Фаза линейного роста характеризуется сбалансированностью роста в установившемся состоянии, т.е. скорость роста остается постоянной на протяжении всего процесса культивирования, а химический состав культуральной жидкости изменяется, поскольку потребляются питательные вещества и вырабатываются продукты метаболизма. Как следствие этого, окружающая микроорганизмы среда непрерывно изменяется, но скорость роста в широком диапазоне концентраций питательных веществ не зависит от них.

4. Фаза линейного роста сменяется периодом, в течение которого скорость роста культуры снижается до нуля - это фаза замедления роста.

5. Далее рост культуры может переходить в достаточно устойчивую стационарную фазу, при этом скорость гибели микроорганизмов компенсируется скоростью прироста биомассы.

6. При полном истощении питательной среды (субстрата) и значительном накоплении ингибирующих рост продуктов происходят существенные физиологические изменения культуры (лизис) и наступает так называемая фаза отмирания культуры.

Закономерности размножения микроорганизмов при периодическом культивировании. Основные положения обратимого равновесного автокаталитического роста популяции микроорганизмом можно сформулировать следующим образом:

- размножение микроорганизмов определяется протеканием двух противоположных процессов - образования и гибели клеток, т.е. синтеза и деструкции;

- скорость образования микроорганизмов (синтеза биомассы) пропорциональна все увеличивающейся в процессе их культивирования концентрации X и уменьшается с уменьшением концентрации лимитирующего субстрата S;

- скорость отмирания клеток (деструкции биомассы) пропорциональна квадрату их концентрации;

- концентрация питательных веществ, необходимых для размножения микроорганизмов, определяется содержанием в питательной среде одного или нескольких лимитирующих компонентов;

- продукты лизиса погибших клеток (Sx) в кинетическом отношении (количественно, но не качественно) эквивалентны исходному субстрату;

- процесс размножения в условиях периодического способа культивирования заканчивается установлением равновесия, при котором скорости синтеза и деструкции биомассы равны, а поэтому концентрации микроорганизмов и субстрата не меняются во времени.

Компоненты питательной среды по характеру их превращения в процессе размножения и влиянию на кинетику роста популяции можно разделить на две группы:

- вещества, которые при включении в структуру клеток и последующем лизисе погибших клеток не претерпевают изменений, и не исключают возможность их повторного использования в метаболическом обмене при образовании новых микроорганизмов;

- вещества, которые в процессе синтеза биомассы претерпевают такие превращения, что их повторное использование микроорганизмами в качестве субстрата невозможно.

Таким образом, кинетическая эквивалентность исходного субстрата и продуктов лизиса погибших клеток в реальной системе клетка-среда может иметь место, если величина субстрата связана с концентрацией в питательной среде веществ, относящихся к первой группе, что и предполагалось при построении модели обратимого равновесного автокаталитического роста популяции.

Современные биотехнологические процессы характеризуются использованием аппаратов – ферментеров большого объема (50-500 м 3 ). Запуск процесса культивирования и выведение его на рабочий режим (достижение оптимальной плотности клеточной культуры) является одной из самых сложных и длительных процедур. Часто процесс приходится останавливать в самый последний момент и начинать все сначала из-за попадания в аппарат посторонней микрофлоры или потери клетками, по разным причинам, частично или полностью своих продуктивных свойств. Поэтому приготовления посевного материала является одним из самых сложных, длительных и ответственных этапов всего процесса.

Для любого микробиологического производства всегда необходима исходная культура продуцента, которая, как правило, не отличается высокой стабильностью при хранении. Поэтому, обычно, предприятие один раз в 2-3 месяца получает чистую культуру в количестве 3 пробирок из специальной лаборатории профильной фирмы или НИИ, либо в условиях собственной заводской лаборатории организует ее хранение и контроль микробиологической чистоты используемого штамма. При этом обычно одну пробирку с исходным продуцентом используют на размножение исходного штамма, вторую используют для организации микробиологического контроля за исходным штаммом-продуцентом, третью оставляют в резерве.

Объем пробирки и количество клеток микроорганизма в ней ничтожно мало по сравнению с объемом ферментера и поэтому прямой пересев культуры потребует очень длительного времени, пока не будет достигнута необходимая плотность культуры во всем аппарате. С целью сокращения времени на запуск процесса в производственных условиях наработку необходимого количества биомассы осуществляют, как правило, в несколько стадий (не более 4-х) в специальных аппаратах.

Подготовку биообъектов проводят согласно прилагаемым к регламентам инструкциям. В этих целях исходный штамм микроорганизма или споровый материал (для грибов или актиномицетов), сохраняемый в условиях, близких к анабиозу или анабиоза (высушенным в стерильной почве, песке, на пшене, путем лиофилизации, или сублимационной сушки), оживляют после добавления стерильной жидкой питательной среды с последующим высевом на уплотненную питательную среду (агар). Убедившись в подлинности и чистоте культуры (культураназывается чистой, если родительские и дочерние клетки в ней практически неразличимы и между ними нельзя установить родственные связи), операции по пересеву штамма на богатую питательными веществами среду возрастающих объемов (или площади) повторяют несколько раз в асептических условиях, переходя от пробирок к колбам различного объема, помещаемым на качалочные устройства (шюттель-аппараты).

Окончательную наработку биообъекта осуществляют в цехе, используя небольшие ферментаторы-инокуляторы (1-2 стадии), в которых наращивают посевной материал для промышленных ферментаций в количестве 5-20% от объема питательной среды в основном аппарате. При этом одноклеточные культуры чаще доводят до середины-окончания Log-фазы, что позволяет сильно сократить время адаптации клеток (Lag-фазу) при переносе их на питательную среду в производственный ферментер.

По своей конструкции и технологической оснастке инокулятор для аэробных микроорганизмов аналогичен основному ферментеру и снабжен системами аэрирования, перемешивания, термостатирования. В инокуляторах, как и в промышленных ферментерах целесообразно поддерживать незначительное избыточное давление воздуха, когда случайные утечки будут происходить только в направлении из системы, а не наоборот, что значительно облегчает поддержание асептических условий.

ОСНОВЫ ТЕХНОЛОГИИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ

Технология микробиологического синтеза обязательно включает в себя в качестве основной стадию промышленного культивирования соответству-ющего микроорганизма-продуцента (ферментация). В условиях промышленного производства такое культивирование проводят по одному из следующих двух способов:

1. культивирование на твердых питательных средах или на поверхности тонкого слоя жидкой питательной среды (поверхностный способ выра-щивания продуцента),

2. культивирование соответствующего продуцента в большом объеме жидкой фазы, содержащей все необходимые для нормального роста и развития микроорганизма питательные вещества (глубинный способ выращивания продуцента).

Техника посевов микроорганизмов на питательные среды


Для работы с микроорганизмами используют специальные бактериологические петли, иглы, шпатели, пипетки. Посевы всегда проводят около пламени горелки. Около работающего с чистой культурой нельзя делать резких движений, ходить, кашлять и т.п., так как движение воздуха увеличивает опасность попадания посторонних микроорганизмов в пробирку с культурой. Поэтому посевы и пересевы микроорганизмов рекомендуется проводить в боксе.

Рис. 19. Правила разливания питательной среды в чашки Петри

Посев в жидкую питательную среду. Посев производят петлей или градуированной пипеткой. Посевной материал бактериологической петлей осторожно вносят в пробирку и легко встряхивают в верхнем слое питательной среды или растирают по стенке, смывая его жидкой средой.

Стерильную пипетку фламбируют (обжигают) в пламени горелки, опускают в пробирку с культурой, отбирают определенное количество материала и переносят его в пробирку со свежей питательной средой, выпуская жидкость по стенке пробирки, или вносят пипетку вглубь среды и выдувают содержащийся в ней материал.

Посев штрихом в пробирку со скошенным агаром (рис.22). Пробирку с культурой и пробирку со скошенным питательным агаром берут в левую руку и держат в наклонном положении. В правую руку берут бактериологическую иглу и прокаливают ее в пламени спиртовки до покраснения, затем проносят сквозь пламя иглодержатель. Мизинцем правой руки вынимают пробки из обеих пробирок, обжигают края пробирок. Петлю вводят в пробирку с культурой, охлаждают ее о края пробирки и осторожно снимают небольшое количество микробной культуры. Петлю с посевным материалом быстро переносят в пробирку со стерильной средой и опускают почти до дна, где скапливается небольшое количество конденсационной влаги. Слегка касаясь агара, проводят зигзагообразную линию, при этом петлю не отрывают от поверхности питательной среды. После посева петлю вынимают из пробирки и обжигают вместе с остатками посевного материала.




Рис. 24. Посев на агар в чашки Петри шпателем Дригальского

Глубинный посев в чашку Петри. Определенное количество подготовленного к посеву исследуемого материала (1,0 или 0,1 см 3 ) вносят пипеткой в пустую чашку Петри. Из пробирки или колбы с расплавленной и остуженной до 45 °С питательной средой вынимают пробку, обжигают края в пламени горелки и, слегка приоткрыв крышку, выливают на дно чашки.

Пробирки и чашки с посевами помещают в термостат с температурой, оптимальной для конкретного микроорганизма. Как правило, мезофильные бактерии выращивают при температуре 37±1 °С, термофильные бактерии – при 40–55 °С, дрожжи и плесени – при 30±1 °С.
Культивирование и рост микроорганизмов
Выращивание микроорганизмов на питательных средах называется культивированием, а развившиеся в таких средах микроорганизмы – культурой. При культивировании происходит рост культуры – физиологический процесс, в результате которого увеличивается биомасса – масса клеточного вещества данного микроорганизма.

Чистой культурой микроорганизма называют культуру, которая представлена потомством одной клетки. Естественным путем получить чистую культуру почти невозможно, поэтому ее получают искусственно. Для выделения чистой культуры используют плотные питательные среды, на которых каждая клетка вырастает в виде изолированной колонии – популяции микроорганизмов одного вида.

Перед выделением чистой культуры из какого-либо пищевого продукта или природного субстрата (например: почвы, воды), в котором данный микроорганизм находится в небольших количествах, вначале получают накопительные культуры, проводя культивирование в элективных условиях.

Накопительные культуры состоят преимущественно из клеток микроорганизмов одного вида. Элективные (накопительные) условия – условия, способствующие развитию одной культуры и ограничивающие развитие сопутствующих микроорганизмов. Создать накопительные условия можно путем использования накопительных сред. Примером элективных условий может быть повышенная температура (для выделения термоустойчивых форм бактерий), повышенная кислотность, повышенная концентрация соли и т.д.

Инкубация – культивирование микроорганизмов при определенной температуре.

Хранят чистые культуры обычно на плотных питательных средах в пробирках. При этом постоянно необходимо делать пересевы на свежую питательную среду.

К другим способам хранения чистых культур относятся сохранение их на накопительной среде под слоем вазелинового масла и хранение в лиофилизованном состоянии (сушка под вакуумом замороженных клеток микроорганизмов).

В пищевой промышленности применяют чистые культуры дрожжей, молочнокислых, уксуснокислых, пропионовокислых бактерий, обладающих ценными свойствами для производства. В последнее время находят успешное применение многокомпонентные чистые культуры, состоящие из двух и более видов микроорганизмов.

Работа по получению и поддержанию чистых культур промышленных микроорганизмов осуществляется в научно-исследовательских лабораториях. Там они выделяются из различных субстратов, изучаются, и наиболее продуктивные, пригодные для производства, хранятся в коллекции музея чистых культур, откуда рассылаются отраслевыми научно-исследовательскими институтами на предприятия. В заводской лаборатории микробиолог подготавливает культуру для производственного цикла, проверяет ее биологическую чистоту, активность.

Способ культивирования зависит от конечной цели культивирования (целью является либо накопление биомассы, либо получение определенного продукта жизнедеятельности – метаболита).

Поверхностное культивирование заключается в выращивании аэробных микроорганизмов на поверхности жидких и сыпучих питательных сред. При этом микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. При поверхностном культивировании на жидких средах микроорганизмы растут в виде пленок. Осуществляется поверхностное культивирование в специальных ваннах – кюветах.

Глубинное культивирование проводится на жидких питательных средах, в которых микроорганизмы развиваются во всем объеме питательной среды. Сочетание питательной среды и растущих в ней микроорганизмов называют культуральной жидкостью. Осуществляется глубинное культивирование в специальных аппаратах – ферментаторах, снабженных мешалками и системой подвода стерильного воздуха для обеспечения роста аэробных микроорганизмов. Аэрирование – продувание стерильного воздуха через культуральную жидкость.

При периодическом культивировании весь объем питательной среды засевают чистой культурой, которую выращивают в оптимальных условиях определенный период времени до накопления нужного количества целевого продукта. Следует отметить, что, так как культивирование ведется на невозобновляемой питательной среде (в стационарных условиях), то клетки все время находятся в меняющихся условиях. Таким образом, периодическую систему можно рассматривать как замкнутую систему.

При непрерывном культивировании культура находится в специальном аппарате, куда постоянно притекает питательная среда и откуда с такой же скоростью отводится культуральная жидкость. Для микроорганизма создаются неизменные условия среды, поэтому непрерывную систему можно рассматривать как открытую систему.

Поверхностное культивирование может быть только периодическим, в то время как глубинное культивирование может осуществляться и периодическим, и непрерывным способом.

При периодическом способе культивирования популяция микроорганизмов проходит 7 стадий (фаз) роста (рис. 25).

1 2 3 4 5 6 7 
Рис. 25  Кривая роста статической культуры:

N – концентрация жизнеспособных клеток;

τ – продолжительность культивирования
1. Лагфаза. В этот период культура адаптируется к новой среде обитания. Активизируются ферментные системы, возрастает количество нуклеиновых кислот, клетка готовится к интенсивному синтезу белков и других соединений. Клетки не размножаются (скорость размножения равна нулю). Концентрация живых клеток постоянна и равна количеству внесенных клеток. Продолжительность этой фазы зависит от физиологических особенностей микроорганизма и от состава питательной среды.

2. Фаза ускорения роста. Эта фаза характеризуется началом деления клеток, увеличением общей массы и постоянным увеличением скорости роста культуры. Эта фаза обычно непродолжительна.

3. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста. В этот период микроорганизмы размножаются с постоянной максимальной скоростью. При этом логарифм числа клеток линейно зависит от времени. К концу этой фазы среда истощается вследствие катаболических и анаболических процессов, в среде накапливаются продукты жизнедеятельности микроорганизмов. Возникает и пространственная ограниченность, так как клетки мешают друг другу.

4. Фаза замедления роста. В этот период снижается скорость роста, небольшая часть клеток гибнет. Скорость роста выше скорости отмирания.

5. Стационарная фаза. Количество живых клеток достигает максимума. Скорость роста равна скорости отмирания клеток, поэтому концентрация жизнеспособных клеток остается постоянной.

6. Фаза ускорения отмирания. Количество отмерших клеток (скорость отмирания) становится больше количества образовавшихся клеток.

7. Фаза отмирания. Масса живых клеток значительно уменьшается, так как в среде нет питательных веществ, а запасные вещества клетки исчерпываются.

При непрерывном способе культивирования культура поддерживается в какой-то фазе роста.

Если цель культивирования – получение биомассы продуцента, процесс целесообразно вести в режиме логарифмической фазы, когда микроорганизм способен обеспечить максимальную скорость роста популяции.

Для поддержания культуры в логарифмической фазе культивирование микробной популяции проводят в условиях хемостата или турбидостата.

Рост в хемостате. Хемостат состоит из сосуда, в который вводят с постоянной скоростью питательный раствор. По мере поступления питательного раствора из него вытекает суспензия микроорганизмов с той же скоростью. При культивировании в условиях хемостата поддерживается постоянная концентрация одного из компонентов среды (например, углерода). Благодаря этому в условиях хемостата поддерживается постоянная скорость роста культуры. Культура микроорганизма находится в условиях динамического равновесия.

Рост в турбидостате. Работа турбидостата основана на поддержании постоянной концентрации живых клеток. В сосуде для культивирования все питательные вещества содержатся в избытке, а скорость роста бактерий приближается к максимальной.

Если же целью культивирования является получение метаболита (например, этилового спирта), выход которого в среду обитания не соответствует логарифмической фазе роста, применяется способ непрерывного выращивания в двух или нескольких последовательно соединенных аппаратах, что позволяет как бы расчленить процесс на несколько стадий.

Читайте также: