Криоконсервация это хранение клеток тканей и органов растений

Обновлено: 05.10.2024

Криоконсервация - процесс хранения органов, тканей или отдельных клеток при пониженной температуре. Наилучшие условия для криоконсервации создаются при температуре жидкого азота, минус 196 градусов Цельсия. Криоконсервация позволяет создать клеточный "банк запасных частей", необходимых для восстановления жизненных функций организма, нарушенных в результате заболевания или в процессе его лечения. Криоконсервации могут быть подвергнуты и стволовые клетки пуповинной крови, полученные при рождении человека. В этих условиях стволовые клетки могут храниться десятилетиями. В последующие годы они могут быть извлечены из криогенного хранилища, разморожены и использованы для новых способов лечения заболеваний.

Сохранение разнообразия форм жизни — важнейшая проблема, с которой столкнулось современное человечество. Еще Г. Ф. Гаузе доказал, что устойчивость сообщества тем выше, чем больше число составляющих его видов. Следовательно, сохранение биоразнообразия — один из важнейших механизмов стабильности жизни на Земле. Кроме того, для обеспечения питанием растущей численности населения нашей планеты необходимо выведение новых, более продуктивных сортов сельскохозяйственных растений, а для успешной селекции важен постоянный приток генов из новых источников. Традиционным источником генетического материала служат дикие виды растений. Однако в связи с увеличением числа городов, расширением сельскохозяйственных угодий, вырубкой лесов, ухудшением экологии эти виды постепенно вытесняются, а многие из них находятся на грани вымирания, поэтому их необходимо сохранить.

СПОСОБЫ СОХРАНЕНИЯ ГЕНОФОНДА

Существует несколько способов сохранения генофонда живых организмов: заповедники, национальные парки, зоопарки. Заповедники и национальные парки — наиболее совершенная форма резерватов. Основной недостаток этих формирований состоит в том, что они требуют значительных территорий. Для сохранения 90—95 % существующих видов живых организмов территория заповедников должна занимать около 30 % всей площади суши, отдать которые при современной плотности населения и потребности в сельскохозяйственных угодьях просто невозможно. Зоопарки и питомники требуют меньших территорий. Однако возвратить выращенных там животных в дикую природу удается достаточно редко. В последнее время большое внимание уделяется созданию и развитию новых способов: пересадочных коллекций каллусных клеток, депонированию культур клеток и, наконец, криосохранению, т.е. хранению объектов при очень низкой температуре, обычно это температура жидкого азота (-196 С).

Криосохранение имеет существенные преимущества по сравнению с остальными методами. При сохранении в глубоко замороженном состоянии полностью прекращается обмен веществ, отсутствуют значительные физико-химические молекулярные изменения не только в клетке, но и в окружающей водной среде. Таким образом, сохраняется генофонд, а следовательно, все свойства замороженного объекта.

В 1992 г. в Рио-де-Жанейро большинством государств мира была принята Медународная конвенция по сохранению биологического разнообразия, созданы Национальные программы по сохранению природных генетических ресурсов. Одно из обязательных условий этих программ — создание банков зародышевой плазмы: семян, меристем, пыльцы, зародышей, культур тканей, клеток и другого генетического материала. Такие банки долговременного хранения геномов позволяют:

собирать и сохранять редкие и исчезающие виды;
сохранять морфологическое, физиологическое и адаптационное разнообразие внутривидовой изменчивости по культурным и дикорастущим видам;
служить незаменимыми источниками материала для селекции культурных растений;
обеспечивать размножение редких и исчезающих видов дикорастущих растений и возвращение их в природу;
создавать искусственные популяции и фитоценозы.

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ СЕМЯН РАСТЕНИЙ

Семена всех растений в зависимости от продолжительности их жизни делят на три группы:

микробиотики, сохраняющие жизнеспособность до 3 лет;
мезобиотики — от 3 до 15 лет;
макробиотики — от 15 лет и более.

Для продления жизни семян разработано достаточно много технологий. В первую очередь это касается семян культурных растений. Время их жизни увеличивают благодаря снижению температуры хранения (низкие положительные температуры), снижению влажности окружающей среды, герметизации при хранении, применению искусственных газовых сред и, наконец, криосохранению. Очень важно разработать технологии долговременного хранения семян, относящихся к группе микробиотиков, среди которых немало хозяйственно важных (цитрусовые), декоративных (каштан, гербера) и лекарственных (дуб, каштан) растений.

В настоящее время для продления жизни семян любых растений чаще всего применяют хранение при пониженных температурах:

низкие положительные температуры (4 ± 1 С);
неглубокое замораживание (от -10 до -20 С);
глубокое замораживание (криоконсервация) в жидком азоте при температуре -196 вС или в парах над ним -160 С.

Семена и некоторые другие элементы зародышевой плазы хранят, используя в большей или меньшей степени все три температурных режима, в специализированных банках, сеть которых за последнее время сильно увеличилась. Если в середине 70-х годов XX в. таких банков насчитывалось немногим более 50, то сейчас их более 1300. В банках хранится более 6 млн образцов: 48 % — новые сорта и селекционные линии; 30 % — старые сорта; 15 % — дикорастущие родичи культурных растений и сорные виды. Например, в Швейцарии, в 24 государственных и частных банках сохранено 17 тыс. образцов семян кормовых, плодовых, лекарственных и ароматических растений. Большое внимание сбору и хранению лекарственных растений уделяют в Австрии и Китае. Создаются специализированные банки зародышевой плазы по древесным видам.

Самым дешевым и экологически безопасным было признано хранение семян в шахтах в вечной мерзлоте. Такие эксперименты проводились в Якутске в подземной лаборатории Института мерзлотоведения Сибирского отделения РАН. Хранение в герметичных сосудах в течение трех лет семян пшеницы, ячменя, овса, ржи, овощных растений, кормовых трав при температуре -2,7 С не снижало их жизнеспособности. Однако вечная мерзлота есть не везде, поэтому глубокое замораживание и замораживание до сверхнизких температур (-200 °С и ниже) удобнее всего в техническом отношении. Кроме того, при этих температурах практически прекращаются все метаболитические процессы, что позволяет хранить растительный материал очень долго без существенных изменений. Сейчас изучена всхожесть семян после глубокого замораживания у более чем 400 видов растений, и уже эти результаты показывают, что устойчивость семян к низким и сверхнизким температурам видоспецифична, а также может зависеть от времени и места сбора. Разные растения неодинаково реагируют

на температурный фактор. Только недавно удалось добиться успешного криосохранения семян шести форм наземных и эпифитных тропических орхидей, что открывает возможность создания криобанка сеян этих исчезающих растений (Т. В. Никишина и др., 2001). Криоконсервация семян некоторых культурных бобовых растений рекомендуется для повышения их всхожести. Глубокое замораживание семян вишни и черешни запатентовано как способ их долговременного хранения. Реакция на низкие температуры у представителей семейства лилейных немного различалась: у ландыша после криосохранения увеличивалась частота хромосомных аберраций и снижалась жизнеспособность; у семян растений рода купена жизнеспособность также снижалась, но частота хромосомных аберраций не изменялась. У некоторых растений повышение частоты хромосомных аберраций наблюдалось даже при неглубоком замораживании. Семена таких растений, как жимолость, пиретрум, золотарник обыкновенный, частично погибают при любом замораживании (В. J1. Тихонова, 1999). Поэтому перед внедрением криоконсервации необходимо проводить всесторонние исследования ее всевозможных последствий, так как они могут быть весьма разнообразны.

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ

Сущность метода криосохранения сводится к замораживанию специально подготовленных растительных клеток при использовании криопротекторов — веществ, ослабляющих повреждения клеток при замораживании и оттаивании. В настоящее время известны два метода криосохранения: программное и сверхбыстрое замораживание. Программное замораживание изучалось уже давно, поэтому оно довольно широко применяется для сохранения животных и растительных клеток. Разработка сверхбыстрого замораживания началась сравнительно недавно, однако считается, что именно этот метод со временем станет наиболее перспективным.

Избежать кристаллизации льда помогла бы витрификация воды, т.е. затвердение ее в аморфном состоянии. Получить витрификацию чистой воды практически невозможно. Но в коллоидных растворах скорость образования центров кристаллизации и роста кристаллов льда снижается и повышается температура, при которой их рост прекращается. Все это облегчает витрификацию. Добавление криопротекторов также затрудняет кристаллизацию льда и способствует витрификации.

Наиболее известны такие криопротекторы, как диметилсульфоксид (ДМСО), различные сахара, глицерин, этиленгликоль и их производные. Действие криопротекторов состоит в снижении количества свободной воды, повышении вязкости раствора. Все криопротекторы делят на две группы: проникающие и непроникающие. Это разделение достаточно условно. Так, глицерин — первое вещество, определенное как криопротектор, может проникать в клетку, если его добавлять при комнатной температуре, или выступать как непроникающее соединение, если его добавлять при температуре 0 С. Принято считать, что непроникающие криопротекторы специфически влияют на мембрану, повышая ее проницаемость. Применение сильных, проникающих в клетку криопротекторов ограничено их токсичностью. Обычно используют смеси криопротекторов, так как в них токсичность одного из веществ снижается за счет присутствия другого.

Жизнеспособность клеток после замораживания зависит не только от предупреждения образования льда, но и от их состояния. Крупные вакуолизированные клетки погибают гораздо чаще, чем мелкие меристемоидные. Поэтому на этапе подготовки культуры к замораживанию ее культивируют в условиях, способствующих образованию мелких клеток и синхронизации их деления. Кроме того, концентрирование клеток в культуре, т. е. увеличение ее плотности, способствует повышению выживаемости клеток после замораживания.

Таким образом, криосохранение достаточно надежно обеспечивает сохранение генофонда. Перспективность этого метода подтверждается возобновлением после хранения в жидком азоте суспензионных культур моркови, явора, кукурузы, риса, сахарного тростника; каллусных культур тополя, маршанции, сахарного тростника; андрогенных эмбриоидов — беладонны, табака и др. Из восстановленных после замораживания культур моркови и табака удалось регенерировать целые растения. После быстрого замораживания сохранили жизнеспособность меристемы земляники, малины, гвоздики, томатов, картофеля и ряда других растений. Однако для криосохранения требуется сложная работа по подбору условий, обеспечивающих выживание клеток и, следовательно, возможность последующей регенерации из них целых растений. Необходимо учитывать генетические и морфофизиологические особенности клеток, способность к закаливанию, уровень проницаемости клеточных мембран, подбор криопротекторов, скорость снижения температуры при замораживании, условия оттаивания.

Криосохранение – один из наиболее перспективных способов сохранения генофонда высших растений и животных. Оно позволяет хранить органы, ткани и клетки в замороженном состоянии при температуре жидкого азота (-196°С). Хранимый в этих условиях материал остается генетически стабильным и не подвержен изменениям, которые происходят с организмами при хранении обычными способами.

Развитие криобиологии (науки о действии низких температур на живые организмы) началось в 1900 году, когда К. Линде и Дж. Дьюар получили в значительных количествах жидкий воздух, состоящий из азота и водорода. Выдерживаемые в нём бактерии в дальнейшем не только оживали, но и сохраняли свои свойства.

Основными критическими моментами криосохранения являются образование льда внутри и вне клеток организма и их дегидратация (обезвоживание).

Образование внеклеточного и внутриклеточного льда заключается в том, что снижение температуры окружающей среды ниже точки замерзания раствора приводит к его переохлаждению, образованию льда вокруг клеток и возникновению центров кристаллизации. Вода выходит из клеток и замерзает на поверхности внешнего льда.

Образование внутриклеточного льда обычно повреждает клетки, и только в случае формирования очень мелких (стеклообразных) кристаллов льда они могут дальше развиваться.

Клетки растений являются более трудным объектом для криоконсервации, чем клетки животных. Это связано с их более крупными размерами: размер растительной клетки 15-1000 мкм, а размер клеток животных 7-25 мкм. Кроме того, растительные клетки содержат специальные органоиды – прочную целлюлозную стенку. Особенно осложняет обезвоживание наличие системы вакуолей. Центральная вакуоль в клетках растений может занимать до 90% от их общего объёма, что затрудняет их обезвоживание.

Технология криосохранения базируется на закономерности, что при криосохранении (криоконсервации) клетки переходят в состояние глубокого анабиоза и после длительного пребывания в нем возвращаются в обычное (нормальное) состояние.

Основные этапы криосохранения.

Предварительное культивирование клеток или организмов. При этом учитывают устойчивость их к воздействию состава среды культивирования, а также соответствие возраста, стадии роста и количества клеток перед извлечением.
Расфасовка подготовленного материала в контейнеры. При этом для замораживания и хранения подготовленных клеток или организмов используют разнообразные типы контейнеров. Расфасовку проводят в стерильных условиях.

Более совершенным методом хранения генофонда является криосохранение (в жидком азоте), где полностью прекращаются все метаболические процессы. Он гарантирует стабильное сохранение генетических характеристик объектов в течение практически любого срока. Его можно применять для сохранения генофонда широкого диапазона объектов - от изолированных протопластов до зародышей и семян.

В настоящее время метод замораживания и хранения разработан не более чем для 60 видов растений. Так, в криобанке Института физиологии растений РАИ хранятся в жидком азоте культивируемые клетки ряда линий и мутантов различных растений, в том числе уже более 20 лет культура моркови. Сотрудниками этого института совместно с ПИИ картофельного хозяйства разработаны методы криосохранения меристем многих сортов картофеля. В среднем из 20 % хранящихся меристем регенерируют растения, которые при высадке в поле по всем признакам не отличаются от обычных пробирочных растений.

Наиболее проста техника криосохранения пыльцы. Подсушенную пыльцу помещают в полиэтиленовые ампулы и прямо переносят в пеналы, находящиеся в сосуде Дьюара с жидким азотом. У 5 сортов картофеля пыльца, размороженная после 1, 2 и 3 лет хранения, имела высокую жизнеспособность, фертильность и была эффективно использована при скрещивании.

Более сложной является технология криосохранения культивируемых клеток, меристем, кончиков побегов, зародышей, так как необходимо защитить замораживаемые клетки и ткани от осмотического стресса и механического разрушения структур кристаллами льда, а также обеспечить жизнеспособность при опаивании и рекультивации. Глубокое замораживание - хранение - оттаивание являются экстремальным воздействием.

Технология включает следующие этапы:

подготовка культуры (специальное предварительное культивирование),
добавление криопротектора,
программное замораживание,
хранение в жидком азоте,
быстрое оттаивание,
удаление криопротектора,
рекультивирование и регенерация растений.

Криопротекторы - это вещества, которые при замораживании должны уменьшить повреждения клеток от осмотического и механического стрессов. Криопротекторами служат:

диметилсульфоксид,
глицерин,
поливинилпирролидон,
полиэтиленгликоль,
декстран и др.

Предобработка клеток осмотически активными веществами (маннитом, сорбитом, пролином и другими аминокислотами) также помогает защитить их от стрессов, повышая выживаемость после глубокого замораживания и оттаивания.

Режим замораживаиия на этапе от 0 до -40 °С может быть медленным (0,5-1,0 °С/мин) или сверхбыстрым (непосредственное погружение в жидкий азот объекта размером до 0,5 мм). При этом замораживание в медленном режиме дает более успешные результаты, но требует специального оборудования (программный замораживатель).

Оттаивание и восстановление роста культур часто представляет собой критический этап процесса. Для ряда видов разработаны свои методики, включающие определенную скорость, температуру и другие характеристики. Уже сейчас криобанки могут облегчить работу селекционеров, предоставив им возможность широко использовать пул генов сортов и диких видов. При этом можно сохранить без генетических изменений уникальные гибридные, мутантные и трансформированные линии.

Семенной банк — это надежный и не требующий много места способ хранения зародышевой плазмы. Исходно речь шла о коллекциях семян продовольственных сортов и их дикорастущих родичей, но сейчас так принято консервировать и генофонды многих исчезающих видов, не имеющих непосредственного практического значения.

Семена многих растений (их называют ортодоксальными) могут сохранять свежесть, оставаясь в состоянии покоя, тысячи лет, если находятся в условиях низкой влажности (5—10%) и температуры (—20 °С). К этой группе относятся основные культуры — зерновые, соя, хлопчатник и различные овощи. В Уэйкфилд-Хаусе, главном хранилише семян Королевского ботанического сада Кью в Лондоне, весь поступающий материал сначала рентгеноскопируется на наличие зародыша. Регулярно проводится тестирование образцов на всхожесть, и, если она падает ниже допустимого уровня (до примерно 85%), то партию обновляют, проращивая запасенные семена и получая новый урожай. Это наиболее сложная и дорогостоящая часть процесса. Даже если она проходит успешно в количественном плане, неизбежен инбридинг, который чреват снижением качества обновленных запасов.

Криоконсервация

Полевые генные банки

Полевые генные банки — это постоянные живые коллекции растений, причем не только деревьев, как в дендрариях, но и саванновых злаков, разных сортов пшеницы, риса, хлопчатника и т. д. Они могут создаваться при ботанических садах, но не в виде декоративно оформленных экспозиций, а на небольших делянках или грядках, не предназначенных для осмотра публикой. Например, Международный генный банк какао на Тринидаде, специализирующийся на латиноамериканских сортах этой культуры, разводит по 16 деревьев каждого из 2500 разновидностей Theobroma cacao. Эти делянки дают полезную информацию относительно свойств растений, в частности продукции и всхожести семян, что жизненно необходимо для создания семенных банков. Главный недостаток такого подхода — большое пространство, занимаемое коллекцией и ее неизбежная уязвимость для вредителей, пожаров, ураганов и других стихийных бедствий.

В 1989 г. группа ведущих международных агентств, занимающихся сохранением биологического разнообразия, разработала природоохранную стратегию ботанических садов. Ее цель — обеспечить взаимодействие местных, национальных и глобальных проектов и стандартизировать способы сохранения таксонов ex situ. Стратегия признана стимулировать обмен материалом и научными данными между коллекциями, а также участие ботанических садов в борьбе с незаконной торговлей исчезающими видами.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Читайте также: