Культивирование растений in vitro

Обновлено: 05.07.2024

Для семенных растений характерно два способа размножения: семенной и вегетативный. Оба эти способа имеют как преимущества, так и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести, в первую очередь, генетическую пестроту получаемого посадочного материалa и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной.

Это обусловлено следующими причинами:

- не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.);

- практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10—15 лет;

- не всегда удается получать стандартный посадочный материал (возможность накопления и передачи инфекции);

- трудоемкостью и сложностью операций при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок;

- неэффективностью разработанных технологий для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года.

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

Этот метод, несомненно, имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:

- получение генетически однородного посадочного материала;

- освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;

- высокий коэффициент размножения (105—106 — для травянистых, цветочных растений, 104—105 — для кустарниковых древесных, 104 — для хвойных);

- сокращение продолжительности селекционного процесса;

- ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;

- размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;

- возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;

Первые достижения в области клонального микроразмножения были получены в конце 50-х годов XX столетия французским ученым Жоржем Морелем, которому удалось получить первые растения-регенеранты орхидей. Успеху Ж. Мореля в микроразмножении способствовала уже разработанная к тому времени техника культивирования апикальной меристемы растений в условиях in vitro. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы, одуванчика, салата и изучали влияние состава питательной среды на процессы регенерации и формирования растений. Ж. Морель в своих работах также использовал верхушку цимбидиума (сем. орхидные) состоящую из конуса нарастания и двух-трех листовых зачатков, из которой при определенных условиях наблюдал образование сферических сфер — протокормов. Сформировавшиеся протокормы можно было делить и затем культивировать самостоятельно на вновь приготовленной питательной среде до образования листовых примордиев и корней. В результате им было обнаружено, что этот процесс бесконечен и можно было получать в большом количестве высококачественный и генетически однородный, безвирусный посадочный материал.

В России работы по клональному микроразмножению были начаты в 60-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Под руководством чл.-корр. РАН, академика РАСХН Бутенко Р. Г. были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы, фрезии и некоторых других растений и предложены промышленные технологии. Таким образом, первые успехи в клональном микроразмножении связаны с культивированием апикальных меристем травянистых растений на соответствующих питательных средах, обеспечивающих в конечном итоге получение растений-регенерантов.

Однако область применения микроразмножения разнообразна и имеет тенденцию к постоянному расширению. Это в первую очередь относится к размножению in vitro взрослых древесных пород, особенно хвойных, и использование техники in vitro для сохранения редких и исчезающих видов лекарственных растений. В настоящее время в этом направлении наметился положительный сдвиг.

Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов XX столетия и связаны с именем французского ученого Готре.

В них сообщалось о способности камбиальных тканей некоторых видов вяза и сосны к каллусогенезу in vitro. В последующих работах 40-х годов было выяснено о способности различных тканей вяза листового к образованию адвентивных почек. Однако дальнейший рост и формирование побегов авторами не были получены. Лишь к середине 60-х годов Матесу удалось получить первые растения-регенеранты осины, которые были доведены до почвенной культуры. Культивирование тканей хвойных город in vitro долгое время использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования ювенильных и тем более взрослых тканей, изолированных с растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные, характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и другие вещества), которые в изолированных тканях окисляются различными фенолазами. В свою очередь, продукты окисления фенолов обычно ингибируют деление и рост клеток что ведет к гибели первичного экспланта или к уменьшению способности тканей древесных пород к регенерации адвентивных почек которая с возрастом растения-донора постепенно исчезает полностью. Однако, несмотря на все трудности, ученые все чаще используют в качестве объектов исследований различные ткани и органы древесных растений В настоящее время насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, осина, гибриды тополей с осиной, сосна, ель, секвойя и др.), а работы в этом направлении ведутся в научных учреждениях Москвы, Санкт-Петербурга, Воронежа, Уфы, Новосибирска, Архангельска, Киева, Одессы, Ялты и др.

Этапы микроклонального размножения растений

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.

3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2оС, +10оС).

4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100—200 мг/л. Это в первую очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается тенденция к накоплению внутренней инфекции.

На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. В тех случаях, когда наблюдается ингибирование роста первичного экспланта, за счет выделения им в питательную среду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), снять его можно, используя антиоксиданты. Это возможно двумя способами: либо омывкой экспланта слабым его раствором в течение 4—24 ч, либо непосредственным добавлением в питательную среду. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую кислоту (1 мг/л), глютатион (4—5 мг/л), дитиотриэтол (1—3 мг/л), диэтилдитиокарбомат (2—5 мг/л), поливинилпирролидон (5000—10000 мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент - древесный активированный уголь в концентрации 0,5—1%. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.

2 этап — собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.

Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов—ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.

При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5—10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Вместе с тем, возможно наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Н.В. Катаевой и Р.Г. Бутенко, путем использования питательных сред с минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающих стабильный коэффициент микроразмножения, или путем чередования циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов.

3 и 4 этапы — укоренение микропобегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5—1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют β-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК.

Укоренение микропобегов проводят двумя способами:

1) выдерживание микропобегов в течение нескольких часов (2—24 ч) в стерильном концентрированном растворе ауксина (20—50 мг/л) и последующее их культивирование на агаризованной среде без гормонов или непосредственно в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка);

2) непосредственное культивирование микропобегов в течение 3—4 недель на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1—5 мг/л в зависимости от исследуемого объекта). В последнее время предложен метод укоренения пробирочных растений в условиях гидропоники. Этот метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям. Для картофеля возможно использовать безсубстратную гидропонику для получения мини-клубней. Затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной материей или добавление в питательную среду активированного угля способствует укоренению микропобегов.

Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений — весна или начало лета.

Растения с двумя-тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85—90° С в течение 1—2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1); торф, дерновую почву, перлит (1:1:1); торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют семейство орхидных, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1).

Приготовленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20—22° С), освещенностью не более 5 тыс. лк и влажностью 65—90%. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений.

Через 20—30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения подкармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасига и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным минеральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизированных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для каждого индивидуального вида растений.

Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Эти явления связаны, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтому целесообразно на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите растений от патогенов.

Индийскими учеными предложен простой метод предотвращения быстрого обезвоживания листьев растений, выращенных in vitro, во время их пересадки в полевые условия. Метод заключается в том, что листья в течение всего акклиматизационного периода следует опрыскивать 50%-ным водным раствором глицерина или смесью парафина, или жира в диэтиловом эфире (1:1). Применение этого метода помогает избежать длинных и затруднительных процессов закаливания пробирочных растений и обеспечивает 100%-ную их приживаемость.

Методы клонального микроразмножения

Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году, процесс можно осуществлять следующими путями:

1. Активация пазушных меристем.

2. Образование адвентивных побегов тканями экспланта.

3. Возникновение адвентивных побегов в каллусе.

4. Индукция соматического эмбриогенеза в клетках экспланта.

5. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани.

6. Формирование придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (деление первичных эмбриоидов).

Н.В. Катаева и Р.Г. Бутенко (1983) выделяют два принципиально различных типа клонального микроразмножения:

1. Активация уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля).

2. Индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo :

а) образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта;

б) индукция соматического эмбриогенеза;

в) дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Основной метод, использующийся при клональном микроразмножении растений - активация развития уже существующих в растении меристем. Он основан на снятии апикального доминирования.

Этого можно достичь двумя путями: а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной среде; б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин) и зеатин.

Размножение in vitro – cовременная технология и технология будущего

Четры прогрессивных cпособов размножения:

Как материнский, так и размноженный материал является свободным от какихнибудь болезней и вредителей.
Размноженные растения являются точной копией материнских растений.
Метод дозволяет быстро вывести на рынок новые сорта растений.
Размноженный материал хорошо хранится во время продолжительной транспортировки и карантина.
Цена размноженного материала должна быть принята рынком.
Черты размноженных растений cоответствует международным фитосанитарным, юридическим и торговым стандардам.

1. Материнские растения

Растения с потверждением личности, свободны от болезней и вредителей, готовы
к размножению растут в cпециальных охраняемых помещениях или холодильниках.

2. Инициация культур in vitro (в стекле)

Из определенных выбранных из единичных материнских растений принимаем отрезки побегов (длиной около 20 см).

Боковые почки развиваются в стерильных культурах.

3. Cтабилизация стерильных культур

Маленький отрывок, верхушку, содержащую меристемы, отрезаем от побега, вырастающего из боковой почки. Он является фактическим началом культур.

Боковые побеги – самые требуемые и ценные побеги для микроразмножения, культуры готовы к массовому размножению.

4. Массовое размножение in vitro

Растущие и разветвляющиеся пучки растений после достижения нескольких сантиметров заново разделяем – пока не получим ожиданного количества размноженного материала.

После получения определенного количества материала in vitro, единичные растения переносим в пиательный раствор (растения не выпускают корня, получают фитогормональный импульс).

Растущие и разветвляющиеся пучки растений после достижения нескольких сантиметров заново разделяем – пока не получим ожиданного количества размноженного материала. Все действия проводим в стерильных условиях.

5. Удлинение побегов и подготовка к условиям in vivo (нестерильным)

6. Акклиматизация и укоренение в многослойных культурах

Растения вынутые из стерильного раствора переносим в нестерильные условия и высажаем в бумажные микрогоршки, 360 растений в рассадной кассете.

Многослойные культуры размножены in vitro.

7. Адаптация к тепличным условиям – закалка

Укорененные растения переносим в теплицы. Температура день/ночь -22/17ºC, свет 12/24h, RH – 100% с начала, постепенно снижается, интенсивность освещения

8. Микросаженцы

После 4–6 недель растения достигают высотой как минимум 5 см. Можно извлечь микросаженцы. К ним относятся как к растительному материалу полученному из размножения in vitro.

9. Cортировка, пересаживание в большие горшки

Укорененные и акклимизированные мериклоны и микросаженцы механически, при помощи трансплантеров, высаживаем из М-360 в рассадные кассеты М-90, М-84 и М-40.

10. Адаптация – приспособление к внешним условиям

Растения в рассадной кассете M-90. После пересаживания, весной и летом, укоренившиеся саженцы голубики переносим в фольговый туннель или в питомник где они остаются до поздней осени.

Растения в горшках р9 – 0,5 л.

После пересаживания, весной и летом, укоренившиеся саженцы голубики переносим в фольговый туннель или в питомник где они остаются до поздней осени.

Растения в горшках 1,5 л.

11. Наша продукция – сортировка, упаковка

Наша продукция – укорененное растение в микрогоршке из рассадной кассеты M-360. Перед поставкой качество материала всегда проверяется, а растения подвергаются профилактическому опрысканию. Материал на продажу весной.

Наша продукция – укорененные растения голубики в рассадной кассете M-90 растущие, на продажу с весны до ранней осени. Перед поставкой качество материала всегда проверяется, а растения подвергаются профилактическому опрысканию.

Наша продукция – укорененные растения голубики в рассадной кассете M-90, зимующие, беслистные, на продажу с осени до ранней весны. Перед поставкой качество материала всегда проверяется, а растения подвергаются профилактическому опрысканию.

Наша продукция – укорененные растения голубики в рассадной кассете M-84,

зимующие, беслистные, на продажу с осени до ранней весны. Перед поставкой качество материала всегда проверяется, а растения подвергаются профилактическому опрысканию.

Наша продукция – растение в горшке р9 – 0,5 л, на продажу осенью или после зимовкки весной в следующем году. Перед поставкой качество материала всегда проверяется, а растения подвергаются профилактическому опрысканию.

Наша продукция – растение в горшке 1,5 л, на продажу осенью или после зимовкки весной в следующем году. Перед поставкой качество материала всегда проверяется, а растения подвергаются профилактическому опрысканию.

Наша продукция – растение в горшке 3 л, на продажу осенью или после зимовкки весной в следующем году. Перед поставкой качество материала всегда проверяется, а растения подвергаются профилактическому опрысканию.

Наша продукция – для обеспечения поставок зимой и ранней весной растения хранятся в поддонах, заморожены.

Луковичные растения–красивоцветущие декоративные растения, которые издавна использовались для озеленения. К наиболее популярным декоративным растениям формирующим луковицы относятся тюльпаны, нарциссы, лилии, рябчик и др. В данной статье мы рассматриваем введение в культуру in vitro двух видов луковичных растений – Рябчик бледноцветковый и Зефирантес.

Рябчик бледноцветковый (Fritillaria pallidiflora) относится к семейству Liliaceae, достаточно высокорослый азиатский вид, достигающий в высоту до 40-50 см. Листья относительно крупные, до 2 см в ширину, матово-зеленые, собраны в мутовки. Стебель с большим числом листьев, из верхней пазухи которых в мае появляются 3-9 желтоватых цветков с зеленым рисунком внутри, похожих по форме на крупные колокольчики. В зависимости от разновидности, их цвет может быть также сметанно-белым или зеленовато-желтым [1]. Луковицы рябчика широко используют в китайской, тибетской и корейской традиционной медицине. Содержащиеся в луковицах растений алкалоиды, в малых дозах, оказывают лечебное действие, а в больших дозах – опасны для здоровья. В китайской медицине на основе содержащихся в луковицах алкалоидов изготавливают отхаркивающие и успокаивающие средства. Для любителей альпинариев рябчики являются красивыми декоративными растениями, а для аборигенов Камчатки их луковицы служили источником пищи. Чешуи луковиц сушили, нанизывали на веревки и продавали индейцам, которые называли их северо-западным рисом. В Казахстане из луковиц рябчика бледноцветкового делают средство, которое применяется при лечении гипертонии [2].

В естественных условиях произрастания, а также в интродукции скорость вегетативного размножения данных растений невысока, и от одной луковицы можно получить только две за год. Такой низкий потенциал не позволяет размножать виды луковичных растений традиционным делением луковицы. Семенное воспроизводство очень длительное и составляет в среднем 3 – 5 лет. Размножение в условиях in vitro является эффективным и альтернативным способом воспроизведения данных растений и позволяет получить болшое количество растений в короткие сроки [6]. В связи с этим нами начаты исследования по размножению луковичных растений Зефирантесиз сем. Amaryllidaceaeи исчезающего вида– Рябчик сем. Liliaceae и в условиях in vitro .

Материалы и методы.

Объектами исследования служили Рябчик бледноцветковый Fritillaria pallidiflora из семейства Liliaceae и Зефирантес розовый Zephyranthes rosea из семейства Amaryllidaceae. Оба вида относятся к луковичным растениям. В качестве исходного материала (экспланта) использовали отрезки пазушных почек, донца луковицы (видоизмененный стебель) и луковичных чешуй данных растений.

Для введения в культуру invitro исходныеэкспланты стерилизовали в следующих дезинфицирующих растворах: 70% этанол и 0,5% гипохлорит натрия. Этапы стерилизации растительного материала для получения стерильныхэксплантов: 1) почистить растение от грязи; 2) помыть мыльной водой; 3) прполоскать проточной водой; 4) простерилизовть этонолом 70%-ым – 5 мин; 5) простерилизовать раствором гипохлорита натрия 0,5%-ым – 7-10 мин; 6) промыть дистиллированной водой 3-5 раз. После стерилизации экспланты: чешуи, пазушные почки, донце луковицы разрезали на мелкие отрезки, которые помещали на питательную среду Мурасиге и Скуга (МС) [7] с разным соотношением фитогормонов. Использовали среды МС, содержащие 6-бензиламинопурин (БАП) и нафтилуксусную кислоту (НУК) в следующих соотношениях: 10,0 мг/л БАП и 1,0 мг/л НУК; 2,5 мг/л БАП и 0,5 мг/л НУК. Полученные растения-регенеранты поместили в закрытую чашку с небольшим колличеством воды на неделю, при этом воду меняли каждый день. Затем растения переместили в заранее подготовленный грунт.

Результаты исследования и их обсуждение.

Стерилизация эксплантов 0,5%-ным раствором гипохлорита натрия (7 мин.), 70% раствором этанола (5 мин.) и трехкратным промыванием в дистиллированной воде с последующим высушиванием на стерильной фильтровальной бумаге показала выскокий процент стерильности высаженных эксплантов (70-80%).

Каллусогенез луковичных растений в культуре ткани in vitro . На всех испольованных нами эксплантах через 3 недели было обнаружено образование каллусных тканей. Характеристика каллусных тканей: гетерогенные каллусы беловато-прозрачного цвета с иголчатыми выступами на поверхности ткани (Рисунок 1).

Рисунок 1 – Каллусогенез луковичных растений: (а) – из зеленых пазушных почек луковичных растений; (б) – из луковичных чешуй.

В культуре пазушных почек, использованных в качестве экспланта, частота каллусогенеза составила –84,6% на питательной среде МС с фитогормонами в соотношении 10,0 мг/л БАП и 1,0 мг/л НУК. Из чешуек луковицы частота каллусогенеза составила – 46,6% на аналогичной среде. На среде МС, содержащего фитогормоны в соотношении 2,5 мг/л БАП и 0,5 мг/л НУК, индукция каллусных тканей из отрезков зеленых пазушных почек составила – 100% (Таблица 1).

Таблица 1 – Влияние компонентов питательной среды на каллусогенез и морфогенез

Размножение растений в культурах ин-витро (микроразмножение) означает способ размножения в искусственных, асептических условиях (в стекле). Представления микроразмножения является теория заложенная, когда каждая клетка растения покрытосеменных скрывает переданные через ядро и цитоплазму свойства, которые в определенных условиях делает возможным восстановление целого организма, отвечающему целому материнскому растению. Размножение ин-витро растений садовых, древесных, проходит примерно как растений зеленых, однако достижение свойств размножение является более сложным. В процессе розмнажения можно выделить четыре этапа.

Этап первый и второй. Оздоровление и размножение.

Материалом для размножения, используются растения свободные от болезней, зачастую с помощью термотерапии, после зимнего отдыха берут верхушечный побег растения. Стерилизацию поверхности проводят с помощью смеси из (50% алкоголя и 0,1% хлорки (хлорид ртути) ). Для размножения используют верхушечный побег 0,3-0,8 мм, для смеси чаще всего используют работы Мурашига и Кога, с добавлением цитокинина BAP (бензиламинопурина), стимулятора роста и образователя новых побегов. В первом этапе растения содержаться 3-4 недели, создаются несколько дополнительных побегов. Состав Мурашига и Кога таков: (в мг/л)

NH4NO3 -1650
KNO3 -1900
CaCl2 * 2H20 -440
MgSO4 *7H20 -370
KH2PO4 -170

Na2EDTA * 2H20 -37,2
FeSO4 * 7H20 -27,8
MnSO4 * 4H20 -22,3
сахароза -20 000
глицин -2,0

гидролизат казеина – 1000
мезо-инозитол -100
кислота никотиновая -0,5
перидоксина-HCl -0,5
тиамин-HCl -0,1

Субтракция пробуждает рост и образование боковых побегов. Для получения хороших приростов размножения нужно использовать хорошие термично-освещенные условия. Интенсивность осветления должна быть около 1000 люксов (1000 люмий на квадратный метр), а температура воздуха от 21 до 25 градусов Цельсия саженцы одесса. Температура выше 30 гр приводит к быстому старению материала и уменьшению продуктивности.

Этап второй. Укоренение.

Для укоренения в пробирках используют молодое растения с хорошо образовавшимися листьями, длиной около 2 см. Для укоренения используют стимуляторы корнеобразования на основе ауксина.

Типы использования различных ауксинов (NAA, IAA или IBA) считается самым лучшим раствором с содержанием от 0,5 до 2 мг на литр раствора. Перебор укоренителя вызывает образование калиуса и затруднение образование корней. Хорошему укоренению растений способствует интенсивность света и уменьшение минеральных солей, добавление витаминов, B1, B2, B6, кислоты никотиновой и аскорбиновой.

Этап четвертый. Адаптация растений из пробирки в теплицу.

Этап этот является решающим при микроразмножении. Перенесение растений из стекла в теплицу означает изменение роста. Следует обеспечить им высокую влажность, требуемую температуру. Растения размножаемые в ин-витро следует защитить от паразитов, и скачков температуры. Грунт для посадки должен быть легким и свободным от болезней. Для субстрата лучше использовать торф верховой с необходимой кислотностью, освободить его от микроорганизмов можно с помощью термической обработки. Для дезинфекции лучше использовать фунгицид Топсин с добавлением Алиет. Рост растений можно ускорить с помощью опрыскивания препаратором цитокинина 0,5-2 мг на литр непосредственно по посадке, а второй этап можно повторить через две недели. Спустя 8 недель растения вырастают на высоту от 10 до 20 см, после этого их можно садить в питомник (однако не позже чем второй половины июля), или оставить их в теплице в горшках до второй половины весны.

Размножение растений в ин-витро, есть в практике несколько десятков лет. Большое значение в этом способе является быстрое размножение растений за короткое время, а также выращивание их без вирусов. С одной почки растения можно вырастить несколько тысяч растений.

Добавить комментарий Отменить ответ

Mariupol Pitomnik "AZOV" > Статьи > Без рубрики > Размножение растений в пробирках ин-витро (in-vitro), укоренение, адаптация, время, раствор

Читайте также: