Культивирование стерильных проростков растений in vitro
Обновлено: 05.10.2024
В настоящее время перед биотехнологией как наукой и отраслью промышленности стоит актуальная задача поиска альтернативных источников и разработки методов получения биологически активных веществ (БАВ) растительного происхождения, применяемых в медицине. На сегодняшний день из растений получают более трети всех лекарственных веществ, используемых в медицинской практике. Структура многих из них настолько сложна, что растения ещё долго будут являться их единственным источником. В связи с этим идёт активный поиск новых альтернативных источников получения БАВ растительного происхождения. Одним из таких источников являются культуры клеток растений, преимущества использования которых заключаются в получении биомассы с заданными характеристиками независимо от сезона, погодных и климатических условий; высокой скорости получения биомассы; отсутствии в биомассе пестицидов, гербицидов, радиоактивных соединений и других поллютантов.
Цель
Введение в культуру in vitro растений Digitalis трёх видов: Digitalis ciliata Trautv., Digitalis grandiflora Lam., Digitalis lanata Ehrh. и анализ состава вторичных метаболитов в полученных культурах.
Задачи
1) Отработать методику проращивания семян в стерильных условиях – стерилизацию семян, подбор оптимальных сред.
2) Получить каллусные культуры клеток d. Lanata, d. Grandiflora, d. Ciliata.
3) Выявить особенности каллусогенеза у digitalis sp. В зависимости от вида растения и органа, из которого был получен эксплант.
4) Проанализировать содержание биологически активных веществ в полученных культурах с помощью тсх у digitalis grandiflora lam.
5) Провести количественный анализ вторичных метаболитов методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.
Содержание работы
Затем простерилизованные семена переносили на стерильные чашки Петри со средой Мурасиге – Скуга. Причём, половину семян каждого вида посадили на среду с гидролизатом казеина, половину – без него (казеин является источником органического азота), так как в стандартной среде содержится гидролизат казеина, а в литературе имеются данные, что гидролизат казеина может отрицательно влиять на прорастание семян Digitalis. На каждую чашку высаживали 4−9 семян, по 10 чашек для каждого вида. Чашки Петри с семенами находились на стеллажах под люминесцентными лампами дневного света на 16-часовом световом дне. После прорастания семян переносили отобранные, вырезанные скальпелем растительные экспланты (фрагменты тканей или органов растений). Экспланты были двух типов: листовые и гипокотильные. Экспланты переносили на другие стерильные чашки Петри со средой Мурасиге – Скуга, содержащей 2 мг/л альфа-нафтилуксусной кислоты (НУК) − относится к классу ауксинов и 1 мг/л кинетина – относится к классу цитокининов (Smolenskaya et al, 2007), или со средой Мурасиге – Скуга, содержащей 6 мг/л альфа-нафтилуксусной кислоты (НУК) и 3 мг/л кинетина. Также в ходе проекта проводились несколько раз фотосъёмки полученных каллусов с помощью цифровой камеры для микроскопа Levenhuk C800 N6 8M pixels под бинокуляром Микромед MC2 Zoom.
Анализ содержания сердечных гликозидов проводили методом тонкослойной хроматографии.
Удалось прорастить семена всех трёх видов Digitalis в стерильных условиях. Всхожесть семян Digitalis lanata Ehrh. оказалась выше, чем у других видов. Оказалось, что на всхожесть семян Digitalis grandiflora Lam. казеин оказывает отрицательное влияние в условиях проведения данной работы, так как всхожесть становится заметно ниже на среде с казеином, чем на среде без его использования. На всхожесть семян Digitalis ciliata Trautv. и Digitalis lanata Ehrh. в условиях проведения данной работы казеин не влияет: всхожесть остаётся одинаковой как на среде с казеином, так и на среде без использования его.
Перенесённые растительные экспланты в стерильных условиях переходили к процессу дедифференциации, теряли присущую им структурную организацию и специфические функции и начинали делиться, образуя первичный каллус. Также было проведено сравнение каллусов листового и гипокотильного происхождения.
Выводы
1. Казеин оказывает отрицательное влияние на всхожесть семян Digitalis grandiflora Lam. На всхожесть семян Digitalis ciliata Trautv.
и Digitalis lanata Ehrh. в условиях проведения данной работы казеин не влияет.
2. Все три вида Digitalis обладают способностью к каллусообразованию.
3. Образование различных типов каллусов объясняется видоспецифичностью.
4. Полученная культура Digitalis grandiflora Lam. обладает способностью к синтезу сердечных гликозидов.
5. У Digitalis grandiflora Lam. и Digitalis ciliata Trautv. отмечен сходный состав вторичных метаболитов.
6. В полученных культурах присутствуют фенилэтаноидные и фуростаноловые гликозиды.
Читайте также: