Метод посева на полиуглеводные среды

Обновлено: 05.10.2024

1.1. Степень разведения навески продукта для посева на плотные среды выбирают так, чтобы общее количество колоний, выросших нa чашке Петри, колебалось в пределах 15—300; количество колоний специфических групп бактерий (например, колиформных) – 15-150; плесеней 5-50.

1.2. Степень разведения навески продукта для посева в жидкие среды выбирают так, чтобы хотя бы в одной пробирке наибольшего разведения отсутствовали микроорганизмы.

Количество продукта, которое необходимо профильтровать для получения изолированных колоний на фильтре, должно быть указано в нормативно-технической документации на методы анализа соответствующих групп, свойств, родов или видов микроорганизмов.

2. Объем навески продукта или его разведения для посева.

2.1. При посеве глубинным методом 1 см 3 жидкого продукта или разведения навески продукта смешивают с расплавленной питательной средой.

2.2. При посеве поверхностным методом 0,1 или 0,2 см 3 жидкого продукта или разведения навески продукта вносят на поверхность плотной среды.

2.3. Для выявления присутствия (отсутствия) микроорганизмов и определения их таксономических свойств в жидкие среды вносят до 50 г (см 3 ) продукта; при определении количества микроорганизмов в жидкие среды вносят до 100 см 3 жидкого продукта или разведения навески.

Проведение анализа

Глубинный метод посева в плотные среды

1.1. Жидкий продукт или разведение навески вносят параллельно в две чашки Петри и заливают не позднее чем через 15 мин расплавленной и охлажденной до температуры 45±1 о С питательной средой. Высота слоя питательной среды должна быть 4-5 мм.

1.2. Среду немедленно равномерно перемешивают с посевным материалом круговыми движениями чашки так, чтобы среда не вытекла из чашки и не загрязняла крышку. После застывания среды чашки с посевами вверх дном помещают в термостат.

Поверхностный метод посева на плотные среды

2.2.На подсушенную среду наносят жидкий продукт или разведение навески и немедленно равномерно растирают по поверхности шпателем – изогнутой стеклянной палочкой.

2.3.Засеянную поверхность подсушивают, выдерживая чашки в горизонтальном положении в течение 15 мин.

Глубинный метод посева в плотные среды. Жидкий продукт или разведение навески вносят параллельно в две чашки Петри и заливают не позднее чем через 15 мин расплавленной и охлажденной до температуры 45±0,5 °С питательной средой. Высота слоя питательной среды должна быть 4–5 мм.

Среду немедленно равномерно перемешивают с посевным материалом круговыми движениями чашки так, чтобы среда не вытекла из чашки и не загрязнила крышку. После застывания среды чашки с посевами вверх дном помещают в термостат.

На подсушенную среду наносят жидкий продукт или разве­дение навески и равномерно растирают по поверхности шпа­телем – изогнутой стеклянной палочкой.

Засеянную поверхность подсушивают, выдерживая чашки в горизонтальном положении в течение 15 мин.

Метод посева в жидкие среды. В колбу или пробирки с питательной средой вносят навеску продукта или разведения навески. При определении количества микроорганизмов пита­тельные среды засевают продуктом и(или) разведениями наве­сок так, чтобы последовательно выдерживалась заданная крат­ность количества посевного материала.

Метод мембранных фильтров. Мембранные фильтры приме­няют для анализа легко фильтруемых жидких продуктов или продуктов, дающих растворы с высоким осмотическим давле­нием. При фильтрации раствора с высоким осмотическим дав­лением раствор предварительно разводят дистиллированной или пептонной водой в соотношении, позволяющем легко профильтровать разведенные растворы.

Жидкий продукт, содержащий небольшое число взвешен­ных частиц, фильтруют в два этапа. Для освобождения от частиц его фильтруют через фильтр со средним диаметром пор 4 мкм, а затем – через фильтр, диаметр и размеры пор кото­рого выбраны в соответствии с группой или видом выявляемых микроорганизмов. Оба фильтра культивируют в аналогичных условиях.

После осаждения микроорганизмов на фильтре из растворов с высоким осмотическим давлением или из растворов, содер­жащих антимикробные вещества, его промывают дистиллиро­ванной водой или пептонно-солевым раствором.

Фильтрацию заканчивают в момент исчезновения влаги на поверхности фильтра. Немедленно после окончания фильтра­ции фильтр переносят на плотные или в жидкие питательные среды. На плотную среду фильтр накладывают нижней сторо­ной так, чтобы она полностью соприкасалась с поверхностью среды. Посевы термостатируют в условиях, благоприятных для роста определяемых микроорганизмов.

Обработка результатов. После термостатирования, установ­ленного соответствующим стандартом на конкретный метод испытания, подсчитывают количество колоний на каждой чашке, содержащей менее 300 колоний (или менее другого количества, установленного соответствующим стандартом на конкретный метод испытания).

В некоторых случаях подсчет колоний может быть затруднен (например, в присутствии инвазивных микроорганизмов). Эти случаи рассматриваются в соответствующих стандартах на кон­кретные методы испытаний.

Пример метода расчета (общий случай). Для получения до­стоверных результатов при подсчете количества колоний необ­ходимо, чтобы хотя бы в одной чашке содержалось не менее 15 колоний. Количество микроорганизмов N в 1 г (см 3 ) пробы вычисляют как средневзвешенное значение из подсчетов на двух последовательных разведениях по формуле

где ΣС – сумма колоний, подсчитанных на всех чашках в двух последовательных разведениях, из которых хотя бы одна чашка содержит не менее 15 колоний; V– объем посевного материа­ла, внесенного в каждую чашку, см 3 ; n1 – количество отобран­ных для подсчета чашек в первом разведении; n2 – количество отобранных для подсчета чашек во втором разведении; d – коэффициент разбавления, соответствующий первому разведе­нию.

Результат вычисления округляют до двух значащих цифр. Для этого, если последняя цифра меньше 5, предшествующую цифру не изменяют; если последняя цифра равна или более 5, предшествующую увеличивают на единицу. Округление прово­дят поэтапно до получения двух значащих цифр.

За результат принимают количество микроорганизмов в 1 см 3 (жидкие продукты) или в 1 г (прочие продукты), выраженное в виде числа от 1,1 до 9,9, умноженного на 10 в соответствую­щей степени.

Округление результата дает 19 000, или 1,9·10 4 микроорга­низмов в грамме продукта.

Метод расчета при проведении идентификации. Если исполь­зуемый метод требует идентификации, определенное количе­ство колоний (обычно 5) пересевают с каждой чашки, ото­бранной для подсчета колоний. После идентификации рассчи­тывают для каждой чашки количество идентифицированных микроорганизмов а по формуле

где А – количество колоний, отобранных для идентификации; b – количество колоний, соответствующих критериям иденти­фикации; С – общее количество колоний.

Результат вычисления округляют до целого числа.

Количество N идентифицированных микроорганизмов, присутствующих в 1 г (см 3 ) испытуемой пробы, рассчитывают как средневзвешенное значение, заменив ΣС на Σa.

Прямой подсчет жидкого продукта дал следующие резуль­таты:

  • в первом выбранном разведении (10 -3 ) в двух чашках вы­явлено соответственно 66 и 80 колоний;
  • во втором выбранном разведении (10 -4 ) – 4 и 7 колоний.
  • из чашки с 66 колониями для идентификации отобрано 8 колоний, из которых 6 соответствовали критериям; следо­вательно, а = 50;
  • из чашки с 80 колониями отобрано 9 колоний, из которых 6 соответствовали критериям; следовательно, а = 53;
  • из чашки с 7 колониями отобрано 5 колоний, из которых 4 соответствовали критериям; следовательно, а = 6;
  • из чашки с 4 колониями все 4 идентифицированы положи­тельно; следовательно а = 4.

Таким образом, количество обнаруженных в пробе микро­организмов составляет 5,1·10 4 в 1 см 3 .

Приближенные оценки количества микроорганизмов.

Если в каждой из двух чашек содержится менее 15 колоний на уровне исходной пробы (жидкие продукты) или исходной суспензии (прочие продукты), то рассчитывают среднее ариф­метическое у колоний, подсчитанных на этих чашках.

Результат выражают следующим образом:

  • для жидких продуктов – приближенное количество микро­организмов в 1 см 3 NE= Υ,
  • для прочих продуктов – приближенное количество микро­организмов в 1 г Ng = Υ/d, где d – коэффициент разбавления исходной суспензии.

Если две чашки не содержат колоний на уровне исходной пробы (жидкие продукты) или исходной суспензии (прочие продукты), то результаты выражают следующим образом:

  • менее 1 микроорганизма в 1 см 3 (жидкие продукты);
  • менее 1/d микроорганизмов в 1 г (прочие продукты), где d – коэффициент разбавления исходной суспензии.

Метод подсчета с использованием жидкой среды. Метод наи­более вероятного числа (НВЧ). Возможны два способа посева.

В наиболее часто используемом способе, называемом "симмет­ричным", применяется одинаковое количество пробирок в каж­дом разведении, объемы соседних разведений обычно соотно­сятся как 1:10. Этот способ используют, если нужно определить не только превышение определенных предельных норм, но и количество присутствующих микроорганизмов.

Используют также способ, называемый "асимметричным", который предусматривает разное количество пробирок в от­дельных разведениях.

В действующих стандартах рассматривается только "сим­метричный" способ с десятикратными разведениями.

В зависимости от требуемой точности результатов засевают необходимое количество флаконов или пробирок одним и тем же разведением (например, три, пять или десять). Как правило, применяемые методы требуют трех пробирок или флаконов на разведение.

Значения индекса НВЧ для приемлемых сочетаний находят по табл. 22.1. С помощью индекса НВЧ определяют наиболее вероятное количество микроорганизмов СS в заданном объеме VS по Формуле

где М – индекс НВЧ, взятый из табл. 22.1 для базового разве­дения V0; F – число, обратное коэффициенту разбавления ис­ходной пробы. Это разведение (1,0) использовано в табл. 22.1 как базовое разведение (обычно F = 10,100 и т.д.); VS – задан­ный объем, выбранный для выражения содержания микроор­ганизмов; V0 - объем, использованный для посева базового разведения.

Если наименьшее разведение из отобранных соответствует пробирке, приготовленной из среды двойной концентрации (посев 10 см 3 ), индекс НВС, взятый из табл. 22.1, делят на 10.

Если НВЧ меньше 0,3 микроорганизма в 1 см 3 (жидкие продукты) или в 1 г (другие продукты) и если была использо­вана методика, предназначенная для малых количеств микро­организмов, результаты должны выражаться следующим обра­зом: менее 1 микроорганизма в 1 см 3 для жидких продуктов или 1 г для прочих продуктов.

Для твердого продукта установлен индекс НВС, равный 24; первая выбранная пробирка соответствует посеву 1 см 3 исход­ной суспензии (F = 10), отсюда СS в 1 г составляет

Холерные вибрионы очень чувствительны к дезинфицирующим веществам, поэтому в посуде, куда помещают исследуемый материал, не должно содержаться даже следов дезинфицирующих веществ. Время от взятия материала до проведения посевов не должно превышать 3 ч. Лучше материал сразу брать в 1% пептонную воду, являющуюся средой накопления (можно использовать другие среды накопления - щелочную консервированную жидкость с морской солью и др.).

Цель исследования: выявление холерного вибриона и определение его серовара.

Материал для исследования

2. Рвотные массы.

3. Секционный материал.

Кроме того, обязательно исследуют воду, пищевые продукты и смывы с объектов внешней среды.

Способы сбора материала



Способы сбора материала

При массовых обследованиях по эпидпоказаниям для выявления носительства можно делать групповые посевы. Материал от 4-5 обследуемых засевают в одну колбу с 100 мл 1% пептонной воды (исследование ведут как один анализ). При положительном ответе материал снова берут и засевают индивидуально.

При пересылке исследуемого материала банки с материалом плотно укладывают в металлическую посуду (бюкс, кастрюлю), прилагают сопроводительный документ с перечислением отправляемых материалов, указанием предполагаемого диагноза, времени и места взятия материала и фамилией собиравшего материал.

Основные методы исследования

Исследование проводят поэтапно. Интервалы между этапами должны быть максимально короткими. Пересевы на жидкие среды проводят через 6-8 ч, а на плотные - через 12-18 ч (поэтапное исследование требует круглосуточной работы).

Ход исследования



Этап I

Через 6-8 ч посевы на 1% пептонной воде вынимают из термостата. Пленку или материал с поверхности среды засевают на вторую пептонную воду и делают мазок, фиксируют, окрашивают карболовым фуксином и по Граму. Микроскопируют. Если в мазках обнаруживают сходные с холерным вибрионом подвижные бактерии, то ставят ориентировочную реакцию агглютинации с сывороткой. Для этого на обезжиренное предметное стекло наносят одну каплю О-сыворотки, разведенной в 100 раз. Контролем служит капля изотонического раствора натрия хлорида. В обе капли вносят материал из пленки и тщательно эмульгируют. При наличии в капле сыворотки агглютинации и отсутствии ее в контроле пленку засевают на щелочной агар и инкубируют в термостате.

Через 12-14 ч вынимают посевы из термостата. Изучают рост посевов на плотной питательной среде. При наличии подозрительных колоний отбирают не менее пяти и ставят реакцию агглютинации с О-сывороткой, разведенной 1:100, при наличии положительной реакции агглютинации можно поставить ориентировочную реакцию агглютинации с типовыми сыворотками Огава и Инаба (в разведении 1:50). Наличие положительной агглютинации при типичной морфологии и культуральных свойствах дает право дать предварительный положительный ответ.

Кроме этого материал из типичных колоний (давших положительную реакцию агглютинации) высевают на полиуглеводную среду (содержит 2-3 сахара) для выделения чистой культуры, а также в бульон.

Бульон инкубируют 3-4 ч при 37° С. С молодой бульонной культурой ставят развернутую реакцию агглютинации.

Через 12-14 ч вынимают посевы из термостата. На полиуглеводной среде изменяется цвет столбика (расщепление сахарозы). Скошенная часть не изменяется. Полученную культуру идентифицируют.

Идентификация культуры

Идентификация культуры производится по следующим тестам.

1. Изучение морфологических свойств, подвижности висячей и раздавленной капле).

2. Изучение культуральных свойств.

3. Изучение антигенных свойств (в реакции агглютинации).

4. Изучение сахаролитических свойств.

5. Определение протеолитических свойств.

6. Определение гемолитических свойств.

7. Определение уреазной активности.

8. Изучение восстановительных свойств (реакция холера-рот).

9. Изучение диастатической активности.

10. Постановка реакции Фогеса - Проскауэра.

11. Проба на оксидазу.

12. Определение чувствительности к фагам.

13. Определение чувствительности к полимиксину.

Изучение морфологических свойств, подвижности и культуральных свойств проводят с первых этапов исследования.

Определение антигенных свойств. Ставят развернутую реакцию агглютинации с видоспецифической холерной О-сывороткой и типоспецифическими сыворотками Огава и Инаба.

Ферментацию углеводов определяют на средах Гисса. Результаты учитывают через 6-14 ч. Расщепление глюкозы, сахарозы, маннита, мальтозы и манозы при отсутствии ферментации арабинозы является диагностическим показателем.

Протеолитические свойства определяют путем посева выделенной культуры в столбик желатина; инкубируют при 22° С 2-3 дня. Положительная реакция выражается в воронкообразном разжижении желатина.

Гемолитические свойства определяют путем добавления к 1 мл 24-часовой бульонной культуры 1 мл 1% взвеси эритроцитов барана. Контролем служит 1 мл бульона + 1 мл 1% взвеси эритроцитов. Обе пробирки инкубируют 2 ч при 37° С. Затем переносят на холод.

Учет производят через 16 ч. При положительном результате в опытной пробирке (V. eltor) эритроциты гемолизируются (лаковая кровь), в контрольной - неизмененная взвесь эритроцитов. V. cholerae гемолиза не вызывает.

Уреазную активность определяют посевом выделенной культуры на среду с мочевиной. Положительный результат характеризуется изменением желтого цвета среды в красный.

Изучение восстановительных свойств (реакция холера-рот). Холерные вибрионы восстанавливают нитраты в нитриты. При добавлении к 24-часовой культуре концентрированной серной кислоты из расчета 2-3 капли на 1 мл культуры освобождается азотистая кислота, которая, связываясь к индолом, образует новое соединение (нитрозоиндол). Среда окрашивается в рубиново-красный цвет.

Диастатическую активность определяют на среде Кодама, содержащей растворимый крахмал. Индикатором служит раствор Люголя. Холерные вибрионы расщепляют крахмал, поэтому цвет среды после прибавления раствора Люголя не изменяется.

Реакция Фогеса - Проскауэра. Исследуемую культуру засевают в среду Кларка. Посев ставят в термостат. После 2-3 дней инкубации посевы вынимают из термостата и к 1 мл выросшей культуры добавляют 0,6 мл α-нафтола и 0,2 мл 40% раствора гидроксида натрия. Положительная реакция характеризуется появлением красного окрашивания (за счет ацетилметилкарбинола).

Определение чувствительности к фагам. Исследуемую культуру засевают на щелочной агар и наносят бактериофаг С Мукерджи IV типа и бактериофаг Эль-Тор. Реакцию учитывают через 14-16 ч (см. главу 8; табл. 40).



Таблица 40. Чувствительность к холерным фагам

Примечание. + лизируется; - не лизируется.



Таблица 41. Дифференциальные свойства V. cholerae, V. eltor и нехолерных вибрионов

1.2. Методические рекомендации предназначены для специалистов микробиологических лабораторий, проводящих соответствующие исследования.

2. Список сокращений

АБП - антибактериальный препарат

ВСА - висмут-сульфит агар

ЛПУ - лечебно-профилактическое учреждение

МПК - минимальная подавляющая концентрация

РИФ - реакция иммунофлюоресценции

ЦНС - центральная нервная система

"+" - положительная реакция в первые сутки;

"-" - отрицательная реакция на 4-20 сутки;

"(+)" - замедленная положительная реакция на 2-20 сутки;

d - различные ферментативные реакции.

Возможна дифференциация на ферментативные варианты.

3. Общие положения

3.1. Брюшной тиф и паратифы А, В и С являются антропонозными кишечными инфекциями, вызываемыми микроорганизмами Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A, Salmonella Paratyphi В и Salmonella Paratyphi С. В настоящее время чаще регистрируется брюшной тиф, реже - паратиф В, редко - паратиф А и крайне редко - паратиф С.

3.2. Заболевания характеризуются язвенным поражением лимфатической системы тонкой кишки, бактериемией, лихорадкой, циклическим клиническим течением с выраженной интоксикацией, розеолезной сыпью на кожных покровах туловища, гепато- и спленомегалией. Более характерен запор, нежели диарея. Изъязвление пейеровых бляшек подвздошной кишки примерно в 1% случаев приводит к кишечному кровотечению и прободению кишечника с самыми неблагоприятными последствиями для больного.

3.3. Диагноз брюшного тифа и паратифов А, В и С ставится на основании клинических признаков болезни с учетом эпидемиологического анамнеза и данных комплексного лабораторного обследования, которое включает классические бактериологический и серологический методы. Бактериологическая диагностика имеет приоритетное значение, т.к. в этом случае удается получить наиболее полную информацию о биологических свойствах возбудителя, включая его чувствительность к антибактериальным препаратам.

3.4. Применение антимикробных препаратов для этиотропной терапии брюшного тифа и паратифов позволило, с одной стороны, снизить летальность с 10-20% до уровня менее 1%, а с другой стороны, - осложнило лабораторную диагностику, т.к. нередко забор материала для лабораторного исследования осуществляется уже после начала антибиотикотерапии. Этот факт заставляет более тщательно подходить к вопросу выбора материала для исследования, взятия исследуемого материала, техники исследования.

3.5. Современной особенностью эпидемиологии брюшного тифа является резкое увеличение частоты завоза (заноса) инфекции с эндемичных по этому заболеванию территорий, стран ближнего и дальнего зарубежья, а также заражение жителей России при выезде в эти страны и в процессе миграции внутри страны. Другой особенностью является наличие обширного контингента высокого эпидемиологического риска в виде лиц без определенного места жительства, среди которых регистрируется высокая заболеваемость брюшным тифом.

3.6. Данные методические рекомендации составлены с целью унификации методов бактериологической диагностики брюшного тифа и паратифов А, В и С, а также правильной интерпретации результатов лабораторного исследования с учетом современных особенностей клиники, лечения и эпидемиологической обстановки на конкретных территориях.

4. Показания к проведению бактериологической диагностики

Показанием к проведению бактериологического исследования биологического материала на наличие возбудителей брюшного тифа и паратифов А, В и С является необходимость обследования:

4.1) больных с подозрением на тифопаратифозное заболевание, а также с лихорадкой неясной этиологии, продолжающейся 5 и более дней;

4.2) лиц, общавшихся с больными брюшным тифом и паратифами А, В, С;

4.3) работников отдельных профессий, производств и организаций при поступлении на работу и по эпидемиологическим показаниям;

4.4) лиц перед поступлением в стационары и специализированные санатории по клиническим и эпидемиологическим показаниям;

4.5) лиц при оформлении на стационарное лечение в больницы (отделения) психоневрологического (психосоматического) профиля, дома престарелых, интернаты для лиц с хроническими психическими заболеваниями и поражениями ЦНС, в другие типы закрытых учреждений с круглосуточным пребыванием;

4.6) больных брюшным тифом и паратифами после исчезновения клинических симптомов перенесенного заболевания перед выпиской из стационара;

4.7) лиц, переболевших брюшным тифом и паратифами, во время диспансерного наблюдения;

4.8) хронических бактерионосителей, выявленных среди работников отдельных профессий, производств и организаций, при повторном поступлении на работу на указанные предприятия и объекты;

4.9) секционного материала при подозрении на заболевание брюшным тифом и паратифами.

5. Материально-техническое обеспечение метода

5.1. Стандартное испытательное и вспомогательное оборудование, средства измерения для микробиологических лабораторий.

5.2. Питательные среды, диагностические сыворотки и химические реагенты для культивирования, выделения, идентификации и определения чувствительности к антибактериальным препаратам возбудителей брюшного тифа и паратифов А, В и С.

5.3. Для лабораторной диагностики тифо-паратифозных заболеваний и выявления бактерионосителей должны использоваться питательные среды и реагенты, разрешенные к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке.

6. Лабораторная диагностика брюшного тифа и паратифов

6.1. Принцип бактериологического метода основан на обнаружении живых микроорганизмов в различных биологических субстратах (кровь, моча, кал, желчь, костный мозг, розеолы) в зависимости от стадии заболевания. Для этого производят посев определенного количества биологического материала на специальные питательные среды с последующей инкубацией в термостате и идентификацией выросших колоний микроорганизмов, характерных для S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi В и S. Paratyphi С, по культурально-ферментативным свойствам и антигенной характеристике.

6.2. Только бактериологическое исследование может обеспечить точную постановку этиологического диагноза и контроль освобождения организма от возбудителя. В отношении дифференциальной диагностики брюшного тифа и паратифов единственным методом является лабораторное исследование биологического материала с выделением возбудителя и идентификация его до уровня серологического варианта, т.к. клиническое течение инфекционного процесса не всегда позволяет различить эти нозологические формы.

7. Бактериологическое исследование

7.1. Выделение возбудителей брюшного тифа и паратифов А, В и С проводят по одной и той же схеме бактериологического исследования биоматериалов.

7.2. Порядок сбора материала для лабораторных исследований на тифо-паратифозные заболевания определен СП 3.1.1.2137-06.

7.3. Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории описана в МУ 4.2.2039-05.

7.4. Материалом для бактериологического исследования с целью диагностики брюшного тифа и паратифов являются:

- желчь (дуоденальное содержимое).

Возбудители могут быть также выделены из:

Материалом для бактериологического исследования с целью выявления бактерионосителей, согласно СП 3.1.1.2137-06, являются:

- желчь (дуоденальное содержимое).

7.5. Исследование секционного материала проводится с целью уточнения диагноза.

7.6. Сбор биологического материала для лабораторных исследований осуществляется до начала этиотропного лечения: медицинским работником, заподозрившим тифо-паратифозную инфекцию; при групповой и вспышечной заболеваемости - специалистами учреждений Роспотребнадзора и персоналом лечебно-профилактических учреждений. От госпитализируемых больных материал для бактериологического исследования забирается в приемном отделении стационара.

7.7. От лиц, общавшихся с больными или носителями (контактными), сбор материала проводится медицинскими работниками ЛПУ и других организаций и учреждений по месту выявления больных.

7.8. Биоматериал для лабораторного исследования сопровождают специальным направлением. Доставка материала самими обследуемыми не допускается. При невозможности своевременной доставки материала используют консерванты и транспортные среды (табл. 1).

8. Бактериологическое исследование крови

Показанием к исследованию крови является подозрение на тифо-паратифозные заболевания или лихорадочное состояние невыясненного происхождения (лихорадка неясного генеза), наблюдающееся в течение 5 и более дней (СП 3.1.1.2137-06).

Соотношение кровь - питательная среда должно быть 1:10 - 1:60. Количество независимо отбираемых проб крови и время их взятия определяется лечащим врачом согласно МУ 4.2.2039-05 при лихорадке неясного генеза или согласно МУ 04-723/3 МЗ СССР (1984) при подозрении на тифо-паратифозные заболевания. У больных, получающих антибактериальные препараты, пробы необходимо собирать непосредственно перед введением (приемом) следующей дозы препарата.

При наличии лихорадки оптимальным является взятие крови на фоне повышения температуры тела (но не на пике температуры!). Посев на питательные среды проводят непосредственно у постели больного.

При подозрении на тифо-паратифозные заболевания для посева крови можно использовать среду Рапопорт, 20%-й желчный бульон, мясопептонный бульон с добавлением 1%-й глюкозы (во флаконах по 100 мл). Ранее использовали посев крови в стерильную дистиллированную (водопроводную) воду. Однако предпочтительнее использовать специальные среды для посева крови.

Количество засеваемой крови в разгар лихорадки может составлять 10 мл, в более поздние сроки - до 20 мл (у детей - до 5 мл).

При лихорадке неясного генеза продолжительностью более 5 дней, как правило, должны исследоваться несколько проб крови. Взятие крови из вены проводят согласно МУ 4.2.2039-05. Это необходимо для дифференциации истинной бактериемии от случайной контаминации крови при венопункции (вероятность загрязнения пробы вследствие случайного прокола сальной или потовой железы составляет 3%). Для посева крови в этом случае используют две среды: 1) среду для аэробов и факультативных анаэробов и 2) среду для облигатных анаэробов (например, "двойная" среда + тиогликолевая среда согласно приказу МЗ СССР от 12.04.85 N 535) или универсальную среду для аэробов и анаэробов.

Предпочтительно использовать промышленно произведенные среды, разрешенные к применению в России.

Посевы инкубируют при 37°С в течение 10 суток с ежедневным просмотром. При этом флаконы с "двойной" средой наклоняют, омывая плотную часть среды.

При отсутствии признаков роста на 10-й день выдается отрицательный ответ.

При наличии признаков роста (помутнение, покраснение среды Рапопорт, появление видимых колоний на плотной части "двойной" среды) проводят высев параллельно на полиуглеводную среду и плотную среду в чашках Петри (кровяной агар в случае лихорадки неясного генеза и среда Эндо при подозрении на тифо-паратифозные заболевания).

Прямой высев на полиуглеводные среды проводят для сокращения сроков исследования, исходя из предположения, что при посеве крови с высокой вероятностью будет наблюдаться рост монокультуры возбудителя. Для контроля этого предположения и выделения чистой культуры путем откола отдельных колоний необходим параллельный высев на среду Эндо или кровяной агар.

Если на этих средах наблюдается рост монокультуры, то можно учитывать биохимические свойства по полиуглеводной среде. Для контроля чистоты культуры необходимо провести микроскопию мазка с полиуглеводной среды, окрашенного по Граму. На этом этапе возможна также постановка реакции агглютинации на стекле с соответствующими агглютинирующими О- и Н-сальмонеллезными сыворотками и выдача предварительного ответа.

Схема бактериологического исследования крови пациентов с подозрением на брюшной тиф и паратифы представлена на рис. 1.

Схема бактериологического исследования крови пациентов при лихорадке неясного генеза представлена на рис. 2.

Ход дальнейшей идентификации культуры по культурально-морфологическим, ферментативным свойствам и серологической характеристике изложен далее в соответствующих разделах.

9. Бактериологическое исследование испражнений

Пробы испражнений отбирают сразу после дефекации из дезинфицированного и тщательно вымытого судна, на дно которого был помещен лист плотной чистой бумаги. Материал собирается с помощью ложки-шпателя, вмонтированного в крышку стерильного контейнера. В отсутствие контейнера со шпателем для отбора материала используют любой стерильный инструмент (стерильный деревянный шпатель, проволочная петля, ложечка и т.п.). При наличии патологических примесей необходимо выбрать участки, содержащие слизь, гной, хлопья, но свободные от крови. Образцы жидких испражнений отбирают с помощью стерильной пластиковой пастеровской пипетки с замкнутым резервуаром.

Объем забираемого материала должен быть не менее 2 г. Оптимальным является взятие материала в случае оформленного стула - в объеме грецкого ореха; в случае жидкого стула его слой в контейнере должен быть не менее 1,5-2,0 см. Материал, помещенный в стерильный контейнер, доставляется в лабораторию в течение 2 ч.

Если материал невозможно доставить в лабораторию в течение 2 ч, его собирают в консервант (транспортную систему со средой). Объем материала не должен превышать 1/3 объема среды.

Рис. 1. Схема бактериологического исследования крови пациентов с подозрением на брюшной тиф и паратифы

Рис. 2. Схема бактериологического исследования крови пациентов с лихорадкой неясного генеза

Испражнения должны быть тщательно гомогенизированы в среде. Образцы могут храниться до начала исследования в течение суток в условиях холодильника (4-6°С).

Транспортные среды и консерванты, используемые для выделения возбудителей брюшного тифа и паратифов А, В и С, а также других возбудителей острых кишечных инфекций, представлены в табл. 1.

Транспортные среды и консерванты, наиболее часто используемые для транспортирования испражнений

Читайте также: