Образование конечных продуктов распада белков определяют посевом

Обновлено: 05.10.2024

Учебно-методическое пособие для внеаудиторной и кружковой работы по дисциплине "Основы микробиологии и иммунологии" для специальностей 060501 Сестринское дело и 060102 Акушерское дело.

В лабораторной диагностике инфекционных болезней изучение ферментативной активности бактерий имеет огромное значение в ходе бактериологического метода исследования. Изучая биохимическую активность микроорганизмов, студенты не только глубоко познают особенности жизнедеятельности бактерий, но и знакомятся с одним из важнейших методов лабораторной диагностики инфекционных болезней.

Изучение данной темы предполагает использование активных методов обучения в сочетании с традиционными:

в занятии предусмотрены этапы активизации базисных знаний (в данном случае по химии и теории микробиологии),

демонстрация преподавателем результатов опытов с ферментами бактерий, самоподготовка с использованием УМП,

самостоятельное решение проблемы в конкретной ситуационной задаче.

В ходе занятия студенты овладевают навыками исследовательской работы. Решение ряда теоретических вопросов позволяет студентам достичь конкретных практических целей в ходе бактериологического метода исследования.

Процесс работы над темой организован таким образом, что студент вынужден осмыслить основную проблему темы, найти ключ к её решению, изучив опорный конспект, и сделать вывод на основе логического обобщения результатов исследования. Работа студентов над данной темой не только даёт определённый объём информации, но и решает важнейшую педагогическую задачу – учит активно мыслить, обобщать результаты исследований, делать выводы. Важно, что наряду с коллективной формой обучения учебно-методическое пособие предполагает также индивидуальную самостоятельную работу каждого обучающегося в ходе решения конкретных ситуационных задач.

P.S. К сожалению, при публикации утрачены цветные иллюстрации в пособии. Полную версию работы можно получить при контаткте непосредственно с автором.

Вложение	Размер
izuchenie_bioh_akt_bakt.docx	287.11 КБ

Предварительный просмотр:

Государственное бюджетное образовательное учреждение

среднего профессионального образования

«Московское медицинское училище № 15

Учебно - методическое пособие

для проведения внеаудиторной работы и кружковой работы

"Изучение биохимической активности бактерий"

Составлено в соответствии

с Государственными требованиями

к минимуму содержания и уровню

по специальностям: Сестринское дело 060501

Акушерское дело 060102

РАССМОТРЕНО И ОДОБРЕНО УТВЕРЖДАЮ

НА ЗАСЕДАНИИ ПЦК №3 ЗАМЕСТИТЕЛЬ ДИРЕКТОРА

ПРОТОКОЛ № _______ ПО УЧЕБНОЙ РАБОТЕ

_____________/Парфёнова Л. Ф./

Биохимическая, или ферментативная, активность микроорганизмов лежит в основе тех изменений, которые происходят под влиянием метаболизма бактерий как во внешней среде, так и в организме человека. Ферментативная деятельность бактерий используется в пищевой и фармацевтической промышленности, сельском хозяйстве и генной инженерии. Ферменты патогенных бактерий участвуют в формировании патологических процессов в органах и тканях при инфекционной болезни. В лабораторной диагностике инфекционных болезней изучение ферментативной активности бактерий имеет огромное значение в ходе бактериологического метода исследования. Изучая биохимическую активность микроорганизмов, студенты не только глубоко познают особенности жизнедеятельности бактерий, но и знакомятся с одним из важнейших методов лабораторной диагностики инфекционных болезней.

Изучение данной темы предполагает использование активных методов обучения в сочетании с традиционными:

в занятии предусмотрены этапы активизации базисных знаний (в данном случае по химии и теории микробиологии),

самостоятельное решение проблемы в конкретной ситуационной задаче.

Процесс работы над темой организован таким образом, что студент вынужден осмыслить основную проблему темы, найти ключ к её решению, изучив опорный конспект, и сделать вывод на основе логического обобщения результатов исследования. Работа студентов над данной темой не только даёт определённый объём информации, но и решает важнейшую педагогическую задачу – учит активно мыслить, обобщать результаты исследований, делать выводы . Важно, что наряду с коллективной формой обучения учебно-методическое пособие предполагает также индивидуальную самостоятельную работу каждого обучающегося в ходе решения конкретных ситуационных задач.

Уметь 1) обнаружить ферменты бактерий с помощью специальных питательных сред;

2) использовать результаты исследования биохимической активности бактерий для определения вида патогенных микроорганизмов.

особенности белкового и углеводного обмена патогенных бактерий;
значение изучения биохимической активности патогенных бактерий в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний.

Активизация базисных знаний

Освоение теории биохимии бактерий.

Самостоятельная практическая работа с УМП.

Общее время занятия

Методическое:

Учебно-методическое пособие "Изучение биохимической активности микроорганизмов".
Учебники: "Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии" под ред.А.А.Воробьёва и Ю.С. Кривошеина. Изд. "Мастерство". Москва, 2012 г.

Материальное:

Слайды для интерактивной доски.
Цветные карандаши.

Имитация чистых культур микроорганизмов - взвесь в физиологическом растворе; малый цветной ряд Гисса до посева и тот же ряд после суточного культивирования в термостате после посева.

2.3.Пробирки с мясо-пептонным бульоном и индикаторными бумажками для определе-

ния индола и сероводорода до посева чистой культуры и то же после посева через

сутки культивирования в термостате (имитация) .

Освоение теории биохимии бактерий.

Письменно ответьте на вопросы, используя опорный конспект:

Демонстрация углеводных и белковых сред с посевами микроорганизмов.

Устно ответьте на вопросы:

Как изменяются углеводные среды под воздействием микробов?
Почему изменяются углеводные среды под воздействием микробов?
Как изменяются белковые среды под воздействием микробов?
Почему изменяются белковые среды под воздействием микробов?
Как обнаруживают изменения в углеводных средах под воздействием бактерий?
Как обнаруживают изменения в белковых средах под воздействием бактерий?
Как используют данные о сахаролитической и протеолитической активности бактерий в диагностике инфекционного заболевания?

Решите ситуационную задачу, используя полученную на занятии информацию, данные задачи и справочную таблицу.

Произвели посев культуры бактерий, выделенных у больного, на среды Гисса и на пептонную воду.Через 24 часа культивирования обнаружено: в средах с глюкозой, лактозой, маннитом и мальтозой цвет среды изменился с жёлтого на ярко – розовый и выделились пузырьки газа; в среде с сахарозой произошло помутнение без изменения цвета среды. Реактивная бумажка на сероводород почернела, а реактивная бумажка на индол стала малиновой.

Задание: 1. Зарисуйте результат проведённого исследования (2 –ой день). Расставьте под пробирками значки, обозначающие сахаролитическую и протеолитическую активность бактерий.

2. Используя данные своего исследования и справочную таблицу, определите вид патогенных бактерий, выделенных у больного.

ГРАФИЧЕСКАЯ СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

МИКРООРГАНИЗМОВ (1 вариант)

Первый день – посев микроорганизмов на среды Гисса и мясо – пептонный бульон для определения сахаролитической и протеолитической активности.

Глюкоза Лактоза Маннит Мальтоза Сахароза МПБ

Второй день: учёт результатов исследования. Зарисовать согласно условию задачи.

Произвели посев культуры бактерий, выделенных у больного, на среды Гисса и на пептонную воду. Через 24 часа культивирования обнаружено: в средах с глюкозой, маннитом и мальтозой цвет среды изменился с жёлтого на ярко – розовый и выделились пузырьки газа; в среде с лактозой и сахарозой произошло помутнение без изменения цвета среды. Реактивные бумажки для определения сероводорода и индола не изменились.

ГРАФИЧЕСКАЯ СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ (2 вариант)

Глюкоза Лактоза Маннит Мальтоза Сахароза МПБ

Второй день: учёт результатов исследования. Зарисовать согласно условию задачи.

Произвели посев культуры бактерий, выделенных у больного, на среды Гисса и на пептонную воду. Через 24 часа культивирования обнаружено: в средах с глюкозой, маннитом и мальтозой цвет среды изменился с жёлтого на ярко – розовый и выделились пузырьки газа; в среде с лактозой и сахарозой произошло помутнение без изменения цвета среды. Реактивная бумажка для определения сероводорода почернела, а реактивная бумажка для определения индола не изменилась.

1. Зарисуйте результат проведённого исследования (2 –ой день). Расставьте под пробирками значки, обозначающие сахаролитическую и протеолитическую активность бактерий.

ГРАФИЧЕСКАЯ СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

МИКРООРГАНИЗМОВ (3 вриант)

Глюкоза Лактоза Маннит Мальтоза Сахароза МПБ

Второй день: учёт результатов исследования. Зарисовать согласно условию задачи.

I. Определение сахаролитических ферментов бактерий.

Сахаролитическая активность микроорганизмов – это способность бактерий с помощью ферментов разлагать сахара до более простых соединений – кислоты, газа, альдегидов. Эти вещества можно обнаружить в питательной среде с помощью специальных химических веществ – индикаторов.

II. Определение протеолитических ферментов бактерий.

Протеолитическая активность микроорганизмов – это способность бактерий с помощью протеолитических ферментов расщеплять молекулы белка до аминокислот и простых веществ – сероводорода, индола и др.

Для обнаружения протеолитических ферментов исследуемую культуру засевают на мясо – пептонный бульон или пептонную воду. Под пробки пробирок вводят индикаторные бумажки, пропитанные реактивными растворами.

Если бактерии разлагают белок с образованием сероводорода , то реактивная бумажка окрашивается в чёрный цвет. Некоторые бактерии разлагают белок с накоплением в окружающей среде индола. В этом случае индикаторная бумажка окрашивается в малиновый цвет. Присутствие продуктов распада белка в пробирке - сероводорода и индола - свидетельствует о протеолитической активности бактерий и обозначается на схеме H 2 S (+) и индол (+) соответственно .

III. Протеалитическую активность бактерий можно изучать на желатиновой среде. При посеве на желатин бактерии с сильной протеолитической активностью разжижают его. Форма разжижения желатина характерна для некоторых видов бактерий и используется как видовой признак в лабораторной диагностике инфекций.

Состав ферментов бактерий определяется геномом и поэтому характерен для тех или иных видов, т.е. является видовым признаком. Поэтому изучение ферментативных или биохимических свойств очень важно для дифференциации (отличия) и идентификации (определения вида) бактерий. Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз.

Среди ферментов оксидоредуктаз для идентификации микроорганизмов используют такие ферменты, как каталаза и цитохромоксидаза (ЦО).

Каталаза – фермент, расщепляющий Н₂О₂ с образованием водорода и кислорода. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться после смешивания микробных клеток с 1 % р-ром Н₂О₂.

Цитохромоксидазу обнаруживают так: смачивают реактивом бумажку и наносят суточную культуру микроорганизмов. Получается синее окрашивание.

Среди ферментов гидролаз изучаются ферменты, расщепляющие углеводы (или сахара) и ферменты, расщепляющие белки (или протеины). Способность бактерий расщеплять углеводы называется сахаролитическими свойствами, а способность расщеплять белки - протеолитическими свойствами.

Эти свойства выявляются по конечным продуктам расщепления после посева на определенные среды.. При распаде сахаров определяют образование кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газов (СО₂ или Н₂ ), а при распаде белков - образование щелочей, H₂S, NH₃.

Совокупность сахаролитических, протеолитических и других ферментативных свойств бактерий называется биохимическими свойствами бактерий.

Изучение сахаролитических свойств.

Для определения сахаролитических свойств используются среды: плотные среды Эндо, Левина и Плоскирева,а такжежидкие и полужидкие среды Гисса.

Среды Эндо, Левина, Плоскирева содержат лактозу и определенный индикатор.

Эти среды позволяют отличить патогенные бактерии от кишечной палочки - E. coli. E. coli способна расщеплять лактозу, т.к. имеет фермент галактозидазу. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора. Поэтому E. coli образует на средах окрашенные колонии: на среде Эндо - красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы не имеют фермента галактозидазу, они не расщепляют лактозу, и цвет среды не изменяется. Поэтому сальмонеллы и шигеллы образуют на средах Эндо, Левина и Плоскирева бесцветные колонии.

Таким образом, на одной и той же среде наблюдается различный характер роста разных видов бактерий, т.к. они имеют различные ферменты. Это позволяет отличить один вид от другого.

Среды Гисса содержат лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит и различные индикаторы. Если бактерии расщепляют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – наблюдают появление газообразных продуктов.

Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенно-желтый. При расщеплении углевода цвет среды становится ярко-розовым (красным). Если образуется газ, он накапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется.

Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % мясо-пептонного агара (МПА), 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды - розовато-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а если образуется газ, наблюдаются разрывы в среде.

Определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, поэтому в одних пробирках цвет изменяется, а в других – не изменяется, и получается "пестрый ряд". Каждый вид бактерий характеризуется своим "пестрым рядом".

Изучение протеолитических свойств.

Протеолитические свойства бактерий изучают:

а) по способности разжижать желатин: разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина; S. aureus – в виде воронки; Bac. antracis – в виде опрокинутой елки; Vibrio cholerae – в виде гвоздя и т.д. Разжижают желатин бактерии, имеющие фермент - коллагеназа;

б) по конечным продуктам распада белков после посева на мясо-пептонный бульон (МПБ). Могут быть следующие конечные продукты: индол, Н₂S, NH₃.

Для обнаружения этих продуктов используют бумажки с индикаторами. Индикатор для индола - щавелевая кислота (бумажка окрашивается в розовый цвет). Для Н₂S – ацетат свинца (черный цвет). Для NH₃ – лакмусовая бумажка (синий цвет).

Дополнительно изучаются такие свойства, как восстановление нитратов в нитриты, бутандиоловое брожения на среде Кларка, расщепление крахмала и др.

Индол образуется при расщеплении сложной гетероциклической аминокислоты — триптофана. Для выявления индолообразования петлю исследуемой культуры засевают в среду Строгова или другие среды, рекомендуемые для обнаружения индола. Тотчас после посева в пробирку вносят полоску индикаторной бумаги, пропитанную раствором щавелевой кислоты, так, чтобы индикаторная бумага не касалась питательной среды. Для этого верхнюю треть бумажной полоски прижимают пробкой к стенке пробирки. Посевы инкубируют 24—48 ч при температуре 37°С. Образование индола определяют по окрашиванию нижнего конца индикаторной бумаги в бледно-розовый цвет, хорошо заметный в проходящем свете.

Определение сероводорода

Сероводород является конечным продуктом расщепления аминокислот: цистина, цистеина и метионина, содержащих серу. Петлю исследуемой культуры микробов засевают в пробирку с мясо-пептонным бульоном или бульоном Хоттингера. Тотчас после посева в пробирку вносят пропитанную ацетатом свинца полоску индикаторной бумаги на определение сероводорода. В положительных случаях образующийся в культуре сероводород вступает в соединение с бесцветным ацетатом свинца и превращается в сульфид свинца, который придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание.

Окончательный учет результатов на образование индола и сероводорода проводят на 7—10‑й день после посева, так как процесс ферментативного расщепления белка и образования конечных продуктов распада происходит иногда в течение длительного времени.

Окислительно-восстановительные свойства микроорганизмов

В культуре микробов могут быть обнаружены окислительно-восстановительные ферменты, связанные главным образом с дыхательной функцией микроорганизма.

Как известно, процесс окисления субстрата может происходить посредством присоединения к нему кислорода с участием ферментов оксидаз или в результате отщепления от него водорода с участием ферментов дегидрогеназ. Для этого типа реакции характерно то, что окисление какого-либо одного вещества всегда сопровождается восстановлением (редукцией) другого органического вещества. Первое вещество, от которого отщепляется водород, называют донатором, а то вещество, к которому он присоединяется, — акцептором.

Акцептором водорода чаще всего является кислород воздуха, однако им могут быть также многие органические соединения, способные легко окисляться и восстанавливаться.

С целью выявления ферментов дегидрогеназ и определения их активности в практике микробиологических исследований предложен метод, основанный на введении в питательную среду органической краски, выполняющей роль акцептора водорода. В результате присоединения водорода краситель восстанавливается, превращаясь в бесцветное соединение, называемое лейкобазой. При обильном доступе кислорода оно может вновь окислиться и приобрести прежний цвет.

В качестве акцептора водорода используют метиленовый синий, лакмусовую настойку, малахитовый зеленый, индигокармин, нейтральный красный и др.

Для выявления редуцирующих свойств микроорганизмов указанные красители добавляют к обычным питательным средам: мясо-пептонному бульону, мясо-пептонному агару, молоку.

Один и тот же вид микроба ведет себя неодинаково по отношению к краскам разного состава. Это свойство микроба использовано в микробиологической практике в качестве дифференциального признака. Бактерии брюшного тифа редуцируют метиленовый синий, но не редуцируют лакмуса и не изменяют нейтрального красного в противоположность кишечной палочке, которая остается нейтральной в отношении метиленового синего, но восстанавливает лакмус и нейтральный красный.

Цель занятия:изучить ферментативные (сахаролитические и протеолитические, гемолитические и редуцирующие) свойства микробов и другие методы обязательные для идентификации возбудителя; продолжить выделение чистой культуры аэробов и анаэробов (3 и 4 день)

Вопросы для обсуждения

1. Ферменты микроорганизмов. Классы ферментов.

2. Секреция продуктов жизнедеятельности микробной клетки: пигменты, аромат, газообразование, светящиеся микроорганизмы, микробные токсины.

3. Идентификация бактерий по биохимическим свойствам: сахаролитические, протеолитические, гемолитические, липолитические свойства. Редуцирующие (окислительно-восстановительные) свойства микробов.

4. Современные методы биохимической идентификации бактерий.

5. Выделение чистой культуры (3-4 дни: аэробы; 3-5 дни: анаэробы).

Оформление протокола практического занятия (сделать дома)

1) Проверить записи по самостоятельной работе, выполненной на занятиях № 7 и 8. Сделать описание хода и результатов самостоятельной работы (первый день микробиологического исследования:…; второй день микробиологического исследования:…).

3) Записать понятия и зарисовать примеры определения следующих свойств:

- сахаролитических свойств на жидких средах Гисса (рис 9.1) и среде Олькеницкого (рис 9.3) (какие свойства и по изменению какой части среды определяются на среде Олькеницкого);

- протеолитических свойств – определение образования индола, сероводорода и аммиака, и формы разжижения желатина (рис 9.4 и 9.5);

3) Подготовить Таблицу 9.1. для заполнения на занятии.

Задания для выполнения практической работы

1. По демонстрационным препаратам:

- определить способность микроорганизмов вырабатывать ферменты: каталазу, оксидазу, плазмокоагулазу, гиалуронидазу;

- заполнить таблицу 9.1

2. Сделать фото всех демонстрационных препаратов для оформления в протокол самостоятельной работы.

МАТЕРИАЛ К ИЗУЧЕНИЮ.

Ферменты микробов.Ферменты состоят из белковой (апофермент) и небелковой частей (простетическая группа). Простетическая группа обеспечивает специфичность действия каждому ферменту, поэтому он взаимодействует только с одним субстратом.

Ферменты классифицируются:

а) по характеру вызываемых превращений: гидролазы, оксидоредуктазы, трансферазы, лиазы, изомеразы, лигазы;

б) по локализации и месту действия: эндо- и экзоферменты;

в) по времени образования: конститутивные, индуцибельные;

г) по расщепляемому субстрату: сахаролитические, протеолитические, липолитические.

При биохимической дифференциации микробов определяют их свойства:

1 - сахаролитические – способность сбраживать углеводы и многоатомные спирты с образованием кислоты и газа или только кислоты;

2 - протеолитические – способность разлагать белковые продукты с образованием сероводорода, индола и других веществ;

3- гемолитические – способность лизировать эритроциты на кровяном агаре (КА) или на бульоне с отмытыми эритроцитами;

4 - редуцирующие – способность восстанавливать некоторые химические вещества (краски и др.).

Рис. 9.1. Изучение сахаролитической активности микроорганизмов.

Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, Левина, Плоскирева. Микроорганизмы, сбраживая до кислоты находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу), образуют окрашенные колонии — кислота изменяет цвет имеющегося в среде индикатора. Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны.

Рис.9.2. Рост энтнробактерий на среде Эндо: 1 – лактозонегативные; 2 – лактозопозитивные.

Рис 9.3. Рост на трехсахарном железосодержащем агаре (среде Олькеницкого):

1. Контроль (незасеянная среда)

3. род Escherichia

5. род Salmonella

Молоко при росте микробов, сбраживающих лактозу, свертывается.

При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщепление. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя — цвет среды не изменяется. Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

Определение протеолитических свойств микробов проводят на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном.

Пептон – промежуточный продукт распада белков, представляет собой смесь полипептидов и аминокислот. Хорошо растворяется в воде и не свертывается при нагревании. Получают пептон из рубцов крупного и мелкого рогатого скота.

Желатин – животный клей, состоящий из белка сухожилий, костей, хрящей. Светло-коричневого цвета, без запаха и вкуса. Плавится при температуре 32–34 о С, застывает при температуре 16 о С. При посеве уколом в столбик желатиновой среды микробы, разлагающие желатин, разжижают среду.

Действие микроорганизмов, разлагающих казеин (молочный белок), проявляется в пептонизации молока, которое приобретает вид молочной сыворотки.

В процессе ферментации пептонов микроорганизмы образуют индол (С₈Н₇N), сероводород (Н₂S), аммиак (NH₃) и другие соединения.

Рис. 9.4. Определение протеолитических свойств бактерий - формы разжижения желатина: 1- в форме гвоздя; 2- в форме чашечки; 3 – воронкообразное; 4 – в форме треугольника; 5 – послойное; 6 – мешкообразное.

Методика определения сероводорода.Над культурой исследуемых микробов помещают полоску фильтровальной бумаги, смоченную раствором уксуснокислого свинца или сульфатом железа (бумага закрепляется между пробкой и стенкой пробирки). Пробирки помещают до трех суток в термостат. Почернение бумаги происходит при выделении сероводорода, который превращает уксуснокислый свинец в сернокислый или в нерастворимый сульфид железа. Продукцию сероводорода можно определить также путем посева исследуемой культуры микробов уколом в столбик с питательной средой, содержащей различные соли (сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфит натрия). При образовании Н₂S среда окрашивается в черный цвет за счет образования сульфида железа (FeS).

Методика определения индола.Определение индола по методу Морелли осуществляют с помощью полоски фильтровальной бумаги, обработанной горячим насыщенным 12 % водным раствором щавелевой кислоты и высушенной в термостате. Бумагу закрепляют между пробкой и стенкой пробирки. Пробирки с исследуемой культурой помещают в термостат на трое суток. Порозовение нижней части индикаторной бумаги указывает на наличие индола. Также индол можно определить по методу Эрлиха. Для этого в пробирку с исследуемой культурой микробов добавляют 2-3 мл эрифа, энергично перемешивают и прибавляют несколько капель реактива Эрлиха (спиртовой раствор параметиламидобензальдегид с хлористоводородной кислотой). При наличии индола наблюдается розовое окрашивание или розовое кольцо.

Методика определения аммиака. Над культурой исследуемых микробов помещают полоску увлажненной красной лакмусовой бумаги (бумага закрепляется между пробкой и стенкой пробирки). Пробирки помещают в термостат. В присутствии аммиака бумага синеет.

В бактериологической практике иногда ограничиваются изучением сахаролитических и протеолитических свойств исследуемых бактерий, если этого достаточно для их идентификации.

Рис 9.5. Определение протеолитических свойств бактерий: II – определение сероводорода; III - определение индола; IV – определение аммиака. 1- контроль, 2 - положительный результат.

Редуцирующие свойства микробов.Редукцией или восстановлением того или иного вещества называется химический процесс, состоящий в отнятии кислорода от данного вещества или замене его водородом. Имеются вещества, которые при редукции легко обесцвечиваются.

Тест на оксидаза - используются для дифференциации представителей родов Neisseria, Alcaligenes, Aeromonas, Vibrio, Campylobacter и Pseudomonas (обладают оксидазной активностью) от энтеробактерий (оксидазоотрицательные). Для постановки этого теста, например, используется флакончик, в котором находятся стерильные диски из фильтровальной бумаги, пропитанные оксалатом N,N-диметил-парафенилендиамина, аскорбиновой кислотой и a -нафтолом.

Для осуществления дыхания (биологического окисления с целью получения энергии) у некоторых бактерий имеется цитохромоксидаза, либо индофенолоксидаза – железосодержащий белок, гемопротеин, который катализирует перенос электронов от вещества-донора (например, НАД-Н) к веществам-реципиентам (обычно О₂). Бесцветный N,N-диметил-парафенилендиамин служит искусственным реципиентом электронов. В ходе оксидазного теста из него в результате окислительно-восстановительных реакций с участием микробной оксидазы образуется индофенол – вещество синего цвета. В случае положительной реакции (наличие цитохромоксидазы) из оксалата N,N-диметил-парафенилендиамина и a -нафтола образуется синий индофенол.

Оксидазный тест проводят путем снятия микробной колонии и растирания ее по оксидазному диску. Учет реакции ведут в течение 5–10 секунд при 25–30°С. Замедленные положительные реакции появляются через 10–60 секунд. Отсутствие изменения цвета на диске или развитие окраски через 60 и более секунд расценивают, как отрицательную реакцию.

Важным признаком у микробов является способность к образованию фермента каталазы. Для ее обнаружения на предметное стекло наносят каплю 1-3% раствора перекиси водорода и в нее вносят бактериологической петлей исследуемую культуру микробов. При положительном результате наблюдают выделение пузырьков газа в результате разложения Н₂О₂ на кислород и воду.

При необходимости исследуют другие признаки, например способность восстанавливать нитраты в нитриты, карбоксилировать аминокилоты, образовывать оксидазу, плазмокоагулазу, фибринолизин и другие ферменты.

Ряд ферментов (нейраминидаза, гиалуронидаза, коагулаза и др.) способствуют проявлению патогенных свойств у возбудителей некоторых инфекционных заболеваний, поскольку субстратом их действия являются вещества, входящие в состав клеток и тканей организма человека.

Плазмокоагулаза — выявляется в пробирочном опыте путем определения скорости свертывания испытуемым микробом цитратной кроличьей или человеческой плазмы.

Гемотоксин— вызывает лизис эритроцитов. Определяется при посеве испытуемых микробов на кровяной агар. Вокруг колонии наблюдается зона просветления среды.

Лецитиназа— разрушает лецитовителлин яичного желтка. Обнаруживается при посеве испытуемых микробов на желточно-солевой агар (ЖСА) по образованию вокруг колоний зоны помутнения с радужным венчиком.

Гиалуронидаза — расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав соединительной ткани. В пробирку с испытуемой культурой вносится гиалуроновая кислота и после 30-минутной экспозиции при 37 °С добавляется 2 капли крепкой уксусной кислоты. При наличии фермента гиалуроновая кислота утрачивает способность образовывать сгусток.

Фибринолизин — растворяет фибрин плазмы крови, добавленной к питательной среде.

Современные методы биохимической идентификации бактерий

Для ускоренной идентификации выделенных чистых культур применяются наборы коммерческих тест-систем. Они позволяют быстро и надежно определить ферментативные свойства микроорганизмов. Тест-системы представляют собой наборы микропробирок или микроконтейнеров с определенными субстратами, дисками или полосками бумаги, пропитанными различными ингредиентами, наборы индикаторных карандашей и др. Такие системы значительно сокращает время анализа. Ниже приводятся некоторые из наиболее часто используемых в практике микробиологических исследований микросистем.

2. Система АР1-20Е — пластиковая полоска с 20 микроконтейнерами, в которых имеется набор сухих индикаторных питательных сред. В их составе дифференцирующие аминокислоты, углеводы, желатин, мочевина, реактивы на сероводород, индол, ацетоин и др.

3. Система Micro Id включает 15 биохимических тестов для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae и представляет собой набор бумажных индикаторных дисков,размещенных в лунках пластикового лотка.

4. Набор Patho Tec Rapid ID состоит из бумажных полосок, снабженных индикаторными поясками для выявления ферментов или конечных продуктов обмена веществ. Этот набор позволяет определить до 10 признаков в течение 1-4 ч.

5. Системы индикаторные бумажные (СИБ) используются для ускоренной диагностики энтеробактерий и холерных вибрионов. Это диски или полоски бумаги, пропитанные различными субстратами (углеводами, аминокислотами) и индикаторами. Наша промышленность выпускает несколько таких систем разного целевого назначения. Например, набор № 2А (малый) включает 9 тестов и предназначен для межвидовой дифференциации энтеробактерий. Набор № 2Б (расширенный) состоит из 25 субстратов с индикаторами для видовой дифференциации энтеробактерий.

Читайте также: