Оплодотворение in vitro растений

Обновлено: 07.07.2024

растений – регенерантов к почвенным условиям, а также получить более высокий процент безвирусных маточных растений.

Еще один способ, применяемый для освобождения растений от вирусов – хемотерапия. Он заключается в добавлении в питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, аналога гуанозина (коммерческое название вирозол) в концентрации 20—50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. При использовании вирозола процент безвирусных растений, полученных методом культуры меристем, увеличивался до 80–100 % по сравнению с 0–41 % в контроле. Положительные результаты хемотерапии были получены при оздоровлении сливы, черешни, малины, некоторых цветочных и других растений.

Оздоровленные применением меристемной культуры растения размножают далее обычными методами клонального микроразмножения. Важное место в этой работе принадлежит диагностике зараженных растений. Наиболее чувствительным методом тестирования является иммуноферментный анализ, для которого требуется минимальное количество материала из любого органа растения.

Технология получения свободного от фитопатогенной инфекции посадочного материала разработана для целого ряда овощных и кормовых, плодово-ягодных, декоративных и древесных растений.

6.4. Культура изолированных клеток и тканей в селекции

и генной инженерии растений

Селекционная практика основывается на двух принципиальных подходах: создание генетического разнообразия и отбор желаемых генотипов. Клеточные технологии предлагают принципиально новые пути для увеличения генетического разнообразия и скрининга форм с искомыми признаками.

Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей растений in vitro можно разделить на две группы по их использованию с целью создания растений с новыми полезными признаками (табл. 6.1). Первая группа методов – это технологии для облегчения и ускорения селекционного процесса. Они не подменяют обычную селекцию, а служат ей. Вторая группа – технологии, предназначенные для создания генетического разнообразия исходных форм для селекции. Использование данных методов ведет к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений.

Клеточные технологии в селекции растений

Для облегчения и ускорения селекционного

Для создания генетического разнообразия и

скрининга генотипов с важными признаками

Оплодотворение in vitro

Получение индуцированных мутантов

на клеточном уровне

Гибридизация соматических клеток

Клональное микроразмножение новых

сортов, гибридов, линий

создание искусственных семян)

Адресованный перенос ядерных генов

Особое место, как в селекции, так и в генетике занимает отдаленная гибридизация. Скрещивание представителей культурных и дикорастущих видов, позволяет не только улучшать существующие сорта, расширять ареал их возделывания, но и создавать совершенно новые, высокоценные формы, сорта и даже виды растений. Ни один другой метод не позволяет так обогащать генофонд культурных растений как отдаленная гибридизация. Однако при использовании данного метода экспериментатор сталкивается с проблемой нескрещиваемости из-за прогамной и постгамной несовместимости.

Прогамная несовместимость – физиологическая несовместимость партнеров при отдаленном скрещивании, проявляющаяся на этапе до оплодотворения. Она может быть обусловлена физиологическими (несоответствие во времени созревания пыльцы отцовского растения или отсутствие секрета рыльца пестика материнского растения), а также морфологическими причинами (различие партнеров по длине столбика пестика и пыльцевой трубки; блокирование роста трубки на разных этапах ее пути от рыльца пестика до микропиле семяпочки вследствие тканевой несовместимости партнеров).

Основной способ преодоления прогамной несовместимости – оплодотворение in vitro. Метод заключается в совместном культивировании пыльцы и неоплодотворенных семяпочек, которое может осуществляться двумя различными способами. В первом случае столбик пестика срезается, завязь помещается на питательную среду, и на нее наносят готовую пыльцу. Второй вариант данного метода предполагает вскрывание завязи и перенос на питательную среду кусочков плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно

на их поверности культивируется готовая пыльца. Визуально определить прошло ли оплодотворение in vitro можно по быстрому увеличению размеров семяпочек. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Опыление in vitro хорошо удается для растений семейства маковых, гвоздичных, пасленовых (табак, петуния), у которых в завязях имеются многочисленные семяпочки.

Постгамная несовместимость – несовместимость таксономически отдаленных партнеров, которая наблюдается после оплодотворения, и приводит к образованию щуплых невсхожих семян.

Физиологические причины постгамной несовместимости заключаются в несоответствии темпов развития зародыша и эндосперма либо непригодности (токсичности) метаболитов тканей материнского растения для питания зародыша. Способ их преодоления – культивирование незрелых гибридных зародышей на питательной среде.

Постгамная несовместимость может быть обусловлена и генетическими причинами, которые выражаются в аномалиях развития органов зародыша или молодого проростка. Для их преодоления используется шунтирование нормального развития, его замена получением гибридной каллусной ткани из живых тканей проростка или зародыша и регенерация растений из каллусных клеток.

Выращивание зародышей на искусственной питательной среде называется эмбриокультурой. В зависимости от стадии развития могут быть изолированы недостаточно дифференцированные или вполне сформировавшиеся зародыши. Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок физиологически активных веществ. Для культивирования недифференцированных зародышей требуются более сложные питательные среды, содержащие не только витамины и стимуляторы роста, но и дополнительные трофические факторы (набор аминокислот, необходимые сахара, осмотики типа сорбита и маннита, растительные экстракты неопределенного состава).

Преодоление постгамной несовместимости, обусловленной генетическими причинами, как уже отмечалось, осуществляется путем введения промежуточного этапа получения гибридного каллуса и растений–регенерантов на его основе. Этот подход впервые был применен для получения гибридных растений табака при межвидовом скрещивании Nicotiana tabacum с диким видом Nicotiana occidentalis. В результате этого скрещивания удалось получить гибридные семена, но проростки гибли на стадии семядолей из-за отмирания первичного корня и остановки роста. Индукция образования каллусной ткани из семядолей

и гипокотилей гибридных проростков, а затем и органогенеза в каллусах позволила получить сотни гибридных растений.

Каллусная ткань из гибридных растений может также служить для получения вариантных форм. Так, из одного гибридного зародыша, возникшего при скрещивании ячменя и пшеницы, было получено более сотни регенерантов. У половины из них отмечались различия по морфологии и окраске колоса, длине остей и другим признакам, что дало основания считать их сомаклональными вариантами.

Таким образом, практические аспекты использования метода эмбриокультуры заключаются в следующем:

возможности получения межвидовых и межродовых гибридов;

сохранении важного для селекции материала путем культивирования in vitro изолированных семяпочек и потерявших всхожесть семян;

сокращении длительного селекционного процесса путем ускорения in vitro прохождения жизненного цикла растения;

получении из гибридной каллусной ткани сомаклональных вариантов.

Экспериментальная гаплоидия. Роль гаплоидных растений в генетических исследованиях очень велика. Применение их позволяет легче обнаружить рецессивные мутации, редкие рекомбинации, экспрессию введенного извне генетического материала. Гаплоидия может широко применяться при количественном генетическом анализе сельскохозяйственных растений. Такой анализ включает изучение взаимодействия генов и генетической изменчивости, определения групп сцепления, установления числа генов, действующих на количественные признаки, установление локализации полигенов.

Гаплоиды также широко используются в селекционном процессе (рис. 6.4). Одно из важнейших направлений их применения заключается

в возможности получения из гаплоидных клеток путем их обработкми колхицином полностью гомозиготных диплоидных растений. Такие изогенные линии на основе удвоенных гаплоидов можно создать в течение года, тогда как метод имбридинга требует более 4–6 лет. Гомозиготность широко используется в селекционном процессе. Изогенные линии облегчают селекционеру оценку и отбор новых признаков и позволяют ускорить процесс создания нового сорта в 2–3 раза.

Одно из направлений клеточных технологий — это использование их в селекции, которое облегчает и ускоряет традиционный селекционный процесс в создании новых форм и сортов растений. Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro условно можно разделить на две группы.

Первая группа — это вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную селекцию, а служат ей. К ним можно отнести: оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости), культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей (преодоление постгамной несовместимости), получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, криосохранение изолированных клеток, тканей и органов, клональное микроразмножение отдаленных гибридов.

Вторая группа методов ведет к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений: клеточная селекция с использованием каллусной ткани, соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов и получение неполовых гибридов), применение методов генной инженерии.

В отдаленной гибридизации находят применение такие методы культуры изолированных тканей, как оплодотворение in vitro, эмбриокультура (выращивание изолированных зародышей на искусственных питательных средах), клональное микроразмножение ценных гибридов, а также получение гаплоидов in vitro и криосохранение.

Оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение между выбранными парами в естественных условиях. Это вызвано несколькими причинами: 1) физиологические (несоответствие во времени созревания пыльцы и т. д.); 2) морфологические (короткая пыльцевая трубка или блокирование роста ее на разных этапах развития и т. д.).

Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами: а) культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой; б) завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца. Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстро увеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Плацентарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в скрещивании сортов культурного табака N. tabacum с дикими видами N. rosulata и N. debneyi и сделало возможным получение межвидовых гибридов табака в опытах М.Ф. Терновского и др. (1976), Шинкаревой (1986).

Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосперма. Из-за слабого развития эндосперма зародыш бывает неспособен к нормальному прорастанию. В таких случаях из зрелой щуплой зерновки изолируют зародыш и выращивают его в питательной среде.

Выращивание зародышей в искусственной питательной среде называется эмбриокультурой. Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок физиологически активных веществ (например, среда Уайта) или любая другая, содержащая минеральные соли и сахарозу. При более отдаленных скрещиваниях нарушения в развитии зародыша могут наблюдаться уже на ранних этапах, что выражается в отсутствии дифференцировки, замедленном росте. В этом случае культура зародыша состоит из двух этапов — эмбрионального роста зародыша, во время которого продолжается его дифференцировка, и прорастания подросшего зародыша. Для первого этапа требуется более сложная по составу среда с повышенным содержанием сахарозы, с добавками различных аминокислот, витаминов и гормонов.

Применение эмбриокультуры в селекции приобретает в последнее время большое значение для получения отдаленных гибридов зерновых, злаковых и других сельскохозяйственных культур. Показана возможность увеличения выхода пшенично-ржаных гибридов путем доращивания незрелых зародышей, а также использования эмбриокультуры для преодоления постгамной несовместимости при гибридизации пшеницы с колосняком.

Метод эмбриокультуры находит все более широкое применение в межвидовой гибридизации овощных растений. Для лука разработаны приемы выращивания in vitro абортивных зародышей от гибридных семян с разных этапов эмбриогенеза, выращивание зародышей от частично фертильных межвидовых гибридов. Культура изолированных зародышей используется в селекции томатов и других овощных растений.

Исследована гормональная регуляция роста и развития зародышей томата in vitro . Обсуждается возможность применения эмбриокультуры для получения отдаленных гибридов подсолнечника, изучаются факторы, контролирующие рост и развитие in vitro зародышей подсолнечника, выделенных в разные сроки после опыления.

Культура изолированных зародышей как вспомогательный метод при отдаленной гибридизации применяется не только для преодоления постгамной несовместимости, но также с целью микроразмножения ценных гибридов. В этом случае микроразмножение идет путем каллусогенеза, индукции морфогенеза и получения растений-регенерантов из каллусной ткани. Техника клонирования незрелых зародышей позволяет размножать ценные генотипы растений на ранних стадиях жизненного цикла. Еще одна возможность применения культуры зародышей — использование ее в клеточной селекции.

36. Оплодотворение in vitro

Оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение между выбранными парами в естественных условиях. Это вызвано несколькими причинами:

физиологические (несоответствие во времени созревания пыльцы и т. д.);
морфологические (короткая пыльцевая трубка или блокирование роста ее на разных этапах развития и т. д.).

Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами:

культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой;
завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца.

Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстро увеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Плацентарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в скрещивании сортов культурного табака N. tabacum с дикими видами N. rosulata и N. debneyi и сделало возможным получение межвидовых гибридов табака в опытах М.Ф. Терновского и др. (1976), Шинкаревой (1986).

Физиологическая, или прогамная, несовместимость партнеров при отдаленном скрещивании может зависеть от следующих причин:

генетически детерминированное несоответствие рыльца пестика материнского растения и пыльцы отцовского (это тормозит рост пыльцевых трубок еще на рыльце пестика);
гетеростилия (различия партнеров по длине столбика пестика и пыльцевой трубки);
блокирование роста пыльцевой трубки на разных этапах ее пути от рыльца до микропиле семяпочки вследствие тканевой несовместимости.

Способ преодоления прогамной несовместимости - оплодотворение in vitro. Известны два основных варианта:

материнское растение кастрируют за 2-3 дня до цветения, затем столбик пестика в асептических условиях укорачивают (или срезают полностью), а завязь помещают на питательную среду;
семяпочками, готовыми к оплодотворению; в день цветения бутоны отцовского растения поверхностно стерилизуют, пыльники асептически извлекают, переносят в бокс или чашки Петри и подсушивают до состояния высыпания пыльцы. Пыльцу наносят на срез завязи (в первом варианте) или переносят на питательную среду вблизи плаценты с семяпочками или прямо на ткани плаценты (во втором варианте).

Оплодотворенные семяпочки быстро увеличиваются в размерах, в отличие от неоплодотворенных. Часто при плацентарном оплодотворении зародыш не переходит в состояние покоя и проростки появляются здесь же in vitro (гибридное растение). Плацентарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в скрещивании N. tabacum х N. Rosulata и N. debneyi; с его помощью получены межвидовые гибриды табака.

Размножение in vitro – cовременная технология и технология будущего

Четры прогрессивных cпособов размножения:

Как материнский, так и размноженный материал является свободным от какихнибудь болезней и вредителей.
Размноженные растения являются точной копией материнских растений.
Метод дозволяет быстро вывести на рынок новые сорта растений.
Размноженный материал хорошо хранится во время продолжительной транспортировки и карантина.
Цена размноженного материала должна быть принята рынком.
Черты размноженных растений cоответствует международным фитосанитарным, юридическим и торговым стандардам.

1. Материнские растения

Растения с потверждением личности, свободны от болезней и вредителей, готовы
к размножению растут в cпециальных охраняемых помещениях или холодильниках.

2. Инициация культур in vitro (в стекле)

Из определенных выбранных из единичных материнских растений принимаем отрезки побегов (длиной около 20 см).

Боковые почки развиваются в стерильных культурах.

3. Cтабилизация стерильных культур

Маленький отрывок, верхушку, содержащую меристемы, отрезаем от побега, вырастающего из боковой почки. Он является фактическим началом культур.

Боковые побеги – самые требуемые и ценные побеги для микроразмножения, культуры готовы к массовому размножению.

4. Массовое размножение in vitro

Растущие и разветвляющиеся пучки растений после достижения нескольких сантиметров заново разделяем – пока не получим ожиданного количества размноженного материала.

После получения определенного количества материала in vitro, единичные растения переносим в пиательный раствор (растения не выпускают корня, получают фитогормональный импульс).

Растущие и разветвляющиеся пучки растений после достижения нескольких сантиметров заново разделяем – пока не получим ожиданного количества размноженного материала. Все действия проводим в стерильных условиях.

5. Удлинение побегов и подготовка к условиям in vivo (нестерильным)

6. Акклиматизация и укоренение в многослойных культурах

Растения вынутые из стерильного раствора переносим в нестерильные условия и высажаем в бумажные микрогоршки, 360 растений в рассадной кассете.

Многослойные культуры размножены in vitro.

7. Адаптация к тепличным условиям – закалка

Укорененные растения переносим в теплицы. Температура день/ночь -22/17ºC, свет 12/24h, RH – 100% с начала, постепенно снижается, интенсивность освещения

8. Микросаженцы

После 4–6 недель растения достигают высотой как минимум 5 см. Можно извлечь микросаженцы. К ним относятся как к растительному материалу полученному из размножения in vitro.

9. Cортировка, пересаживание в большие горшки

Укорененные и акклимизированные мериклоны и микросаженцы механически, при помощи трансплантеров, высаживаем из М-360 в рассадные кассеты М-90, М-84 и М-40.

10. Адаптация – приспособление к внешним условиям

Растения в рассадной кассете M-90. После пересаживания, весной и летом, укоренившиеся саженцы голубики переносим в фольговый туннель или в питомник где они остаются до поздней осени.

Растения в горшках р9 – 0,5 л.

После пересаживания, весной и летом, укоренившиеся саженцы голубики переносим в фольговый туннель или в питомник где они остаются до поздней осени.

Растения в горшках 1,5 л.

11. Наша продукция – сортировка, упаковка

Наша продукция – укорененное растение в микрогоршке из рассадной кассеты M-360. Перед поставкой качество материала всегда проверяется, а растения подвергаются профилактическому опрысканию. Материал на продажу весной.

Наша продукция – укорененные растения голубики в рассадной кассете M-90 растущие, на продажу с весны до ранней осени. Перед поставкой качество материала всегда проверяется, а растения подвергаются профилактическому опрысканию.

Наша продукция – укорененные растения голубики в рассадной кассете M-90, зимующие, беслистные, на продажу с осени до ранней весны. Перед поставкой качество материала всегда проверяется, а растения подвергаются профилактическому опрысканию.

Наша продукция – укорененные растения голубики в рассадной кассете M-84,

зимующие, беслистные, на продажу с осени до ранней весны. Перед поставкой качество материала всегда проверяется, а растения подвергаются профилактическому опрысканию.

Наша продукция – растение в горшке р9 – 0,5 л, на продажу осенью или после зимовкки весной в следующем году. Перед поставкой качество материала всегда проверяется, а растения подвергаются профилактическому опрысканию.

Наша продукция – растение в горшке 1,5 л, на продажу осенью или после зимовкки весной в следующем году. Перед поставкой качество материала всегда проверяется, а растения подвергаются профилактическому опрысканию.

Наша продукция – растение в горшке 3 л, на продажу осенью или после зимовкки весной в следующем году. Перед поставкой качество материала всегда проверяется, а растения подвергаются профилактическому опрысканию.

Наша продукция – для обеспечения поставок зимой и ранней весной растения хранятся в поддонах, заморожены.

Особенности роста и развития растений. Культура и морфогенетические особенности каллусных тканей. Клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Применение культур растительной ткани. Вспомогательное использование методов in vitro в селекции растений.

Рубрика	Биология и естествознание
Вид	реферат
Язык	русский
Дата добавления	22.09.2009
Размер файла	7,0 M

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Вспомогательное использование методов in vitro в селекции растений

В отдаленной гибридизации находят применение такие методы культуры изолированных тканей, как оплодотворение in vitro, эмбриокультура (выращивание изолированных зародышей на искусственных питательных средах), клональное микроразмножение ценных гибридов, а также получение гаплоидов in vitro и криосохранение.

Оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение между выбранными парами в естественных условиях. Это вызвано несколькими причинами:

I) физиологические (несоответствие во времени созревания пыльцы и т. д.); 2) морфологические (короткая пыльцевая трубка или блокирование роста ее на разных этапах развития и т. д.). Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами:

а) культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой;

б) завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца. Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстро увеличивающимся

в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению.

Преодоление постгамной несовместимости

Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосперма. Из-за слабого развития эндосперма зародыш часто неспособен к нормальному прорастанию. В таких случаях из зрелой зерновки изолируют зародыш и выращивают его в питательной среде.

Выращивание зародышей в искусственной питательной среде называется эмбриокультурой.

Техника клонирования незрелых зародышей позволяет размножать ценные генотипы растений на ранних стадиях жизненного цикла. Еще одна возможность применения культуры зародышей -- использование ее в клеточной селекции.

Клональное микроразмножение отдаленных гибридов

Эмбриокультура дает возможность вырастить гибридные растения из неполноценных зародышей.

Размножают гибриды путем активации развития меристемы пазушных почек (черенкованием стерильных побегов), адвентивными почками или регенерацией растений из каллусной ткани, в частности полученной при культивировании зародышей.

Метод культуры изолированных клеток, тканей и органов растений in vitro, широко используемый для решения многих фундаментальных вопросов клеточной биологии, физиологии и генетики растений, в настоящее время находит все большее применение и при создании новых биотехнологий. Начиная с первых работ по культивированию растительных клеток, тканей и органов особый интерес у исследователей вызвал вопрос о том, какие клеточные изменения могут происходить в изолированных клетках, растущих на искусственных питательных средах, и причины, их вызывающие. С разработкой техники получения растений - регенерантов из каллусной ткани появилась возможность получать новые формы растений, отличающиеся как по фенотипическим, так и по генетическим признакам от исходных растений. Сомаклональные варианты имеют, несомненно, практическое применение в сельскохозяйственной практике, в силу появления форм, отличающихся от родительских по различным биохимическим, качественным и количественным признакам, а также цитогенетическим характеристикам. Например, получены сомаклоны картофеля, отличающиеся высокой урожайностью, повышенной устойчивостью к заболеваниям, более высоким содержанием в клубнях протеина и крахмала. Причем наследование важных признаков при размножении клубнями сохранялось в течение трех лет полевых испытаний. Для растений табака через каллусную культуру получены сомаклоны, устойчивые к вирусу табачной мозаики, а для сахарного тростника получен новый сорт, характеризующийся высокой урожайностью и повышенной устойчивостью к заболеваниям (данные 1998 года).

Селекция растений на клеточном уровне. Значительный интерес представляет вопрос об использовании клеточной селекции в комплексе с получением сомаклонов. Одна из наиболее сильных сторон культуры in vitro в создании технологий для сельского хозяйства -- возможность на основе сомаклональных вариаций или индуцированных мутаций отбирать в жестких селективных условиях клетки, характеризующиеся искомыми признаками.

Для проведения работ по клеточной селекции растений в условиях in vitro в качестве объекта исследования могут быть использованы каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопласты. Выбор объекта зависит от наличия разработанных технологий применительно к различным видам растений, а также от конечных целей исследования. Наряду с перечисленными выше объектами (каллусная, суспензионная культура, изолированные протопласты), в качестве исходного материала для селекции могут быть использованы культуры соматических или андрогенных эмбриоидов, такие органогенные экспланты, как сегменты листьев или различные меристематические и стеблевые части растений, а также культура изолированных зародышей.

Гибридизация соматических клеток

Следующий метод клеточной селекции -- создание неполовых гибридов путем слияния изолированных протопластов, полученных из соматических клеток. Этот метод позволяет скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем, вызывать слияние трех и более родительских клеток, получать асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами или генами, или только органеллами и цитоплазмой другого. Гибридизация соматических клеток дает возможность не только соединить в одном ядре гены далеких видов растений, но и сочетать в гибридной клетке цитоплазматические гены партнеров.

Слияние изолированных протопластов

Использование данного метода в селекции растений не ограничивается возможностью их индуцированного слияния и получения соматических гибридов. Изолированные протопласты способны поглощать из окружающей среды макромолекулы и органеллы, следовательно, в них можно вводить

чужеродную информацию, не пересаживая ДНК или органеллы других клеток. Уже проведена успешная трансплантация изолированных ядер в протопласты петунии и табака. Вместе с тем поглощение протопластами чужеродных ядер не всегда ведет к образованию гибридов. Кроме ядер в изолированные протопласты удалось трансплантировать чужеродные хлоропласты. В целом использование изолированных протопластов в генетической реконструкции клетки открывает богатые перспективы перед клеточной селекцией.

Разработки клеточных систем с высоким регенерационным потенциалом и методов оптимальной инициации каллусной ткани и растений - регенерантов для получения большого количества однородного материала за небольшое время.

Помимо этого, культура каллусных тканей является одним из наиболее удобных и наглядных объектов фундаментальных исследований. Она используется в различных по своей направленности экспериментах. Это и выявление общих закономерностей развития изолированных биологических систем, и на основе этих данных получение представлений о морфофизиологических и биохимических механизмах в природе.

Использование культур клеток и тканей во многих работах позволяет проводить параллели между процессами in vitro и in vivo, моделировать и изучать метаболические процессы вне организменного контроля. Эти системы могут быть использованы как альтернатива природным источникам получения практически ценных соединений, в частности как модель биосинтеза и биогенетических связей в ряду вторичных метаболитов. Много работ проводилось в сфере изучения влияния различных факторов и химических агентов на биохимические и морфологические процессы в культуре тканей и клеток, с последующим переносом этих знаний на природные объекты. С помощью моделей in vitro возможно исследование геномных и хромосомных аббераций, изучение роли экзо- и эндофитогормонов (эксперименты по изменению и подбору питательных сред) на характеристики роста и развития растений.

Таким образом, культура клеток растений имеет огромное как практическое, так и фундаметально-научное значение. Безусловно, данный метод будет использоваться и модифицироваться, как удобный инструмент биотехнологической, биохимической и других категорий исследовательской деятельности.

Техника культивирования растительного материала на искусственных питательных средах

Организация биотехнологической лаборатории

Для организации биотехнологической лаборатории необходимы просторные изолированные помещения, а также современное оборудование и высококачественные реактивы.

Для удобства проведения дезинфекции полы и стены в помещениях должны иметь кафельное покрытие, а потолок должен быть побелен.

Оборудование моечной комнаты: мойки с горячей и холодной водой; дистиллированная вода; дистилляторы и бидистилляторы; сушильные шкафы с режимом работы для сушки посуды - до 100-130 о С, для инструментов - до 170 о С; шкафы для хранения чистой посуды и инструментов, емкости для хранения моющих средств, вытяжные шкафы с эксикаторами. Оборудование комнаты для приготовления питательных сред: лабораторные столы; холодильники для хранения маточных растворов солей, гормонов и витаминов; аналитические и торсионные весы; иономер; магнитные мешалки; плитки, газовые горелки; набор посуды (колбы, стаканы, мерные цилиндры, мензурки, пробирки и др.), необходимый набор химических реактивов надлежащей степени чистоты (ХЧ, Ч, ЧДА).

Оборудование помещения для стерилизации: автоклавы с режимом работы - давление 1-2 атмосферы и температура 120 о С; стеллажи для штативов с питательными средами; шкафы для хранения стерильных материалов. Данное помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и иметь канализационный слив для отвода конденсата из автоклава.

Оборудование комнаты для инокуляции (перенесение) растительных эксплантов на питательные среды: ламинар-боксы, лабораторные столы, стеллажи, бактерицидные лампы, шкафы для материалов и оборудования.

Оборудование культуральных комнат: световое отделение - источники освещения со спектром близким к спектру дневного света (от 3 до 10 kLx), кондиционер для регуляции температуры (25+ - 2 о С) и влажности воздуха (70 %), стеллажи для штативов с культивируемым материалом; темновое отделение - с тем же оборудованием, исключая источники освещения. Для культивирования эксплантов на питательной среде желательно использовать термостаты или хладотермостаты, способные с высокой точностью поддерживать задаваемые режимы температуры и влажности воздуха.

Необходимый набор посуды, инструментов и материалов в биотехнологической лаборатории: мерные колбы, колбы Эрленмейера, химические стаканы, мерные цилиндры, чашки Петри, пробирки, бутылки, пипетки, стеклянные палочки, стеклянные и мембранные фильтры, ланцеты (в том числе глазные, хирургические, анатомические), ножницы, пинцеты, ножи, бритвенные лезвия, препарировальные иглы, шпатели, бумага (оберточная, пергаментная, фильтровальная), фольга алюминиевая, вата, марля, шпагат.

Приготовление питательных сред для культивирования клеток и тканей in vitro.

Компоненты среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, источники железа, витамины, источники углерода, фитогормоны.

Основой для всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора - в виде фосфатов; серы - в виде сульфатов; а также растворимых солей К + , Na + , Са 2+ , Мg 2+ . Железо используется в виде хелатов [FeО₄ или Fe₂O₄ + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или её натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] - наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.

Азот, фосфор, сера входят в состав органических соединений: белков, жиров, нуклеиновых кислот. Железо, цинк, марганец, молибден, кобальт в сочетании с порфиринами образуют макромолекулы пигментов фотосинтеза (хлорофилла), окислительно-восстановительных ферментов (каталазы, пероксидазы, полифенолоксидазы). Следовательно, все эти соединения выполняют в клетках и тканях структурную функцию. В то же время ионы К + , Na + , Са 2+ , Cl - , Н + необходимы для регуляции pH среды и поддержания физиологических градиентов клеток (тургора, осмотического давления, полярности).

В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании гетеротрофных тканей (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20-60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза), моносахариды (гексозы: глюкоза и фруктоза, пентозы: ксилоза и другие). Полисахариды в питательных средах практически не используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом, раффинозой (природный трисахарид), целлобиозой.

Для стимуляции биохимических реакций в клетке используют биологические катализаторы - витамины группы В: В₁, В₆, В₁₂; С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит (витаминоподобное соединение).

Тиамин (В₁) входит в состав пируватдекарбоксилазы, участвует в превращениях углеводов. Тиаминпирофосфат входит в состав ферментов окислительного декарбоксилирования кетокислот (пировиноградной и кетоглутаровой), является коферментом транскетолазы (фермент пентозомонофосфатного пути).

Пиридоксин (В₆) в виде фосфорнокислого эфира входит в состав ферментов декарбоксилирования и переаминирования аминокислот.

Никотиновая кислота (РР) в виде амида входит в состав дегидрогеназ НАД и НАДФ, катализирующих донорно-акцепторную электротранспортную цепь Н + (отнятие Н + от молекул органических веществ).

Для управления процессами формообразования в культуре тканей необходимы биологические регуляторы роста и развития - фитогормоны. Эти вещества влияют на дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей, инициируют гистогенез, индуцируют деление и растяжение клеток, участвуют в процессах старения и созревания, либо стимулируют, либо ингибируют рост и развитие клеточных культур, обуславливают формирование пола. В биотехнологических исследованиях чаще используют гормоны, стимулирующие рост и развитие: ауксины, цитокинины, гиббереллины.

Ауксины: ИУК - -индолил-3-уксусная кислота, ИМК - индолил-3-мас-ляная кислота, НУК - -нафтилуксусная кислота, 2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота.

Цитокинины: кинетин - 6-фурфуриламинопурин, зеатин, NN-дифенил-мочевина, 6-БАП - 6-бензиламинопурин.

Гиббереллины: гиберрелловая кислота.

В качестве биологических добавок для индукции первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10-15 % от общего объёма среды): кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины - кинетин и зеатин (6-ти замещенные аминопурины) и NN-дифенилмочевину.

В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Жидкие среды используются для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений - регенерантов. При этом для поддержания эксплантов в пробирки со средой помещают специальные мостики - поддержки из фильтровальной бумаги или синтетических пористых материалов.

Агаризованные среды готовят на основе агар-агара - полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при pH 5,6-6,0. иногда в качестве уплотнителя и заменителя агар-агара используют полиакриламидные гели (биогели) P₁₀ и P₂₀₀.

Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0…+4 о С; витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты - при -20 о С в небольших по 5-10 мл сосудах с пробками (пеницилловые флаконы).

Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10-40 раз, микросолей - в 100-1000 раз, витаминов - в 1000 раз.

Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно перед работой со средами.

Для приготовления маточного раствора макро- и микросолей каждую соль растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем сливают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли - раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).

Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (сернокислое железо + ЭДТА, либо Na ЭДТА - трилон Б) готовят и хранят отдельно от других солей.

Концентрированные растворы витаминов готовят следующим образом: 10-кратные навески растворяют в 10 мл дистиллированной воды каждый отдельно.

Фитогормоны - это вещества, которые плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 100 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5-2,0 мл) спирта (ауксины, гиббереллины), 0,5-1н HCl или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят до 100 мл объема (1 мл содержит 1 мг вещества).

В таблице представлен состав наиболее часто используемых питательных сред. Как правило, начиная работать с новым объектом, исследователи модифицируют состав стандартных сред, особенно часто варьируя концентрации и набор органических компонентов.

Читайте также: