Определение сахаролитических свойств бактерий производят путем посева на среды
Обновлено: 05.07.2024
Для определения сахаролитических свойств микробов применяют дифференциально-диагностические среды такие, как среды Гисса, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева.
Среды Эндо, Левина, Плоскирева в чашках Петри применяются для дифференцировки бактерий кишечной группы по способности сбраживать лактозу. Эти среды содержат питательный агар, лактозу и индикатор, изменяющий свой цвет в кислой среде (индикатор рН). Если посеять на такую среду бактерии, которые сбраживают лактозу, например, кишечную палочку, то в результате сбраживания лактозы образуется кислота, и индикатор изменит свой цвет в кислой среде. Поэтому колонии кишечной палочки на таких средах будут окрашены соответственно цвету индикатора: на среде Эндо и среде Плоскирева — в красный цвет, на среде Левина — в черно-синий. Если же на эти среды посеять бактерии, которые не сбраживают лактозу, например, палочки брюшного тифа или палочки дизентерии, то кислота не образуется, реакция среды останется слабощелочной и цвет индикатора не изменится. Поэтому колонии бактерий, не сбраживающих лактозу, на этих средах будут бесцветными
4. Методы изучения протеолитических и редуцирующих свойств бактерий.
Для определения протеолитической активности микробы засевают уколом в столбик желатина и после 3-5 суток инкубирования при комнатной температуре отмечают характер разжижения желатина: в виде воронки, гвоздя, чулка или в виде опрокинутой елки. Протеолитическую активность определяют также по образованию продуктов разложения белка: индола, сероводорода, аммиака. Для их определения засевают микроорганизмы в мясопептонный бульон, и между горлышком пробирки и ватной пробкой помещают индикаторные бумажки, исключая их контакт со средой. При образовании индола бумага, пропитанная насыщенным раствором щавелевой кислоты, приобретает розовый цвет; в присутствии сероводорода бумага, пропитанная ацетатом свинца, чернеет; при образовании аммиака красная лакмусовая бумажка синеет.
Для выявления редуцирующих свойств бактерий к обычным питательным средам (мясопептонному бульону, мясопептонному агару, молоку) добавляют соответствующие индикаторы (метиленовую синь, лакмус и др.).
Молоко с метиленовой синью готовится следующим образом: свежее молоко доводят до кипения, оставляют в прохладном месте на сутки, освобождают его от сливок, затем вторично кипятят и через сутки вновь снимают верхний слой. Обезжиренное таким образом молоко фильтруют через толстый слой ваты, подщелачивают 10%-ным раствором углекислого натрия до pH 7,2. К 100 мл молока добавляют 2 мл 1%-ного водного раствора метиленовой сини. Приготовленную среду разливают по 5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют текучим паром три дня подряд по 30 мин. После остывания среда имеет темно-голубой цвет. При наличии у бактерий редуцирующей способности метиленовая синь обесцвечивается и среда приобретает кремовый цвет.
2.) Определение редуцирующей способности бактерий на среде Омелянского производится следующим образом: к 100 мл щелочного мясопептонного агара добавляют десять капель стерильного свежеприготовленного 1%-ного водного раствора метиленовой сини. При посеве бактерий, обладающих редуцирующей способностью, среда обесцвечивается.
3.) На среде Ротбергера выявление редуцирующей способности бактерий состоит в следующем: к 100 мл расплавленного мясопептонного агара добавляют 0,3 г глюкозы и 1 мл насыщенного водорастворимого нейтраль-рота. Разливают в пробирки и дробно стерилизуют, затем среду охлаждают в вертикальном положении. Посев производят уколом. При наличии редуцирующей способности у бактерий цвет среды изменяется – из красного становится желтым (это становится хорошо заметным, если среду покрыть слоем жидкого парафина). При образовании газа в результате расщепления глюкозы агар растрескивается.
5. Использование ферментов (и ферментативной деятельности) микроорганизмов в медицине и биологии.
Для микробов характерна высокая ферментативная активность. Это используется в промышленности для получения органических кислот (уксусной, молочной, щавелевой, лимонной), приготовления молочных продуктов (сыр, ацидофилин, кумыс), в виноделии, пивоварении и других отраслях промышленности. Ферменты микробного происхождения - липазы и протеазы, входящие в состав моющих средств и стиральных порошков, расщепляют белковые и жировые загрязнения до водорастворимых веществ, которые легко смываются водой. В медицине находят применение такие лечебные средства, как стрептокиназа (фибринолизин стрептококков), террилитин (протеаза Aspergillus terricola). Так, во многих клиниках проводят измерение активности различных форм ферментов лактатдегидрогеназы и трансаминазы – их соотношение изменяется при таких болезнях как инфаркт миокарда, поражения печени, мышечные дистрофии; фермент стрептокиназу врачи применяют для рассасывания тромбов; ферменты трипсин и коллагеназа используются для рассасывания рубцов. С помощью ферментов получают витамины, гормоны, алкалозы, веществ, происходящих внутри клетки.
1. Сахаролитические свойства – это способность микроорганизмов ферментировать определенные углеводы с образованием органических кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газа (СО2 и Н2). Для многих микроорганизмов они служат таксономическим признаком.
2. Для определения сахаролитических свойств используются дифференциально-диагностические среды – жидкие и полужидкие среды Гисса.
В эти среды добавляют углеводы (лактозу, глюкозу, мальтозу и т.д.) и различные индикаторы. В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – регистрируется также появление газообразных продуктов.
3. Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. При сбраживании сахара бактериями цвет среды в присутствии индикатора Андреде (интервал рН 7,2-6,5) изменяется от соломенно-желтого (первоначальный цвет) до ярко-розового (красного). Если кроме кислоты происходит также образование газа, он скапливается в поплавке. При отсутствии ферментации цвет среды не изменяется.
Поскольку определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, входящие в состав сред Гисса, то наблюдается довольно пестрая картина. Поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором был назван "пестрым рядом". Каждый вид бактерий характеризуется своим "пестрым рядом".
Используют короткий и длинный "пестрый ряд". К первому относятся среды Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и спиртом маннитом. В длинный "пестрый ряд" наряду с перечисленными углеводами вводят среды с моносахаридами (арабинозой, ксилозой, рамнозой, галактозой и т.д.), полисахаридами (инулином, крахмалом, гликогеном и т.д.) и спиртами (глицерином, дульцитом, инозитом).
4. Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % МПА, 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды розовато-серый. При ферментации сахара цвет среды становится голубым, а при наличии и газообразования по ходу посева видны пузырьки газа, а сам агар разрывается.
Наиболее часто среды Гисса используют для дифференциальной диагностики бактерий кишечно-тифозной группы (для отличия патогенных представителей кишечно-тифозного семейства от нормальных представителей, например E. coli).
5. Для изучения бактерий кишечной группы широкое использование получили дифференциально-диагностические среды, содержащие лактозу – среды Эндо, Левина и Плоскирева. Благодаря наличию у E. coli фермента, расщепляющего лактозу, колонии этого микроба изменяют цвет среды в присутствии того или иного индикатора (на среде Эндо колонии кишечной палочки окрашиваются в красный цвет; на среде Левина – в темно-фиолетовый, на среде Плоскирева – в красный). До посева бактерий индикатор фуксин в среде Эндо обесцвечен сульфитом натрия и находится в лейкосоединении. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид. Он взаимодействует с сульфитом натрия, рвется двойная связь, соединяющая его с фуксином, и фуксин восстанавливается.
6. Ферментация лактозы может быть изучена при посеве культуры на молоко: обезжиренное молоко подщелачивают 10 % р-ром карбоната натрия и добавляют в качестве индикатора лакмусовую настойку, разливают по пробиркам и стерилизуют дробным методом. При росте микробов на молоке можно наблюдать подкисление или подщелачивание, свертывание или пептонизацию.
7. Для обнаружения интенсивного кислотообразования, характерного для брожения смешанного типа, используют среду Кларка (1 % глюкоза, 0,5 % пептон, индикатор – метиленовый красный). При рН 4,5 и выше он имеет желтый цвет, при более низких значениях рН – красный цвет.
8. Микроорганизмы, образующие амилазу, способны расщеплять крахмал. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель р-ра Люголя. Если крахмал расщепляется, то цвет среды не изменяется. Если крахмал не расщепляется, среда с этим раствором дает синее окрашивание.
Их изучают на средах Эндо, ЭМС, Плоскирева. Микроорганизмы, сбраживая до кислоты находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу), образуют окрашенные колонии — кислота изменяет цвет имеющегося в среде индикатора. Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны. Например, при культивировании кишечной палочки на среде Эндо, Левина, Плоскирева образуются окрашенные в цвет самой среды колонии: На Эндо - малиновые, на Плоскирева - красные, на Левина - фиолетовые. Это происходит вследствие того, что кишечная палочка выделяет фермент лактазу, расщепляющий лактозу в перечисленных средах. В процессе ферментации выделяется кислота, которая изменяет цвет индикатора, что и приводит к изменению цвета самой колонии.
Молоко с лакмусом. Перед стерилизацией к обезжиренному молоку прибавляют 5-10% лакмусовой настойки и столько же 10% раствора бикарбоната натрия, чтобы пена молока приняла синевато-фиолетовый оттенок. При кислотообразовании молоко становится розовым (до красного), при щелочеобразовании – сине-фиолетовым (до синего). В среде может образоваться кислотный сгусток.
Протеолитические свойства - способность расщеплять белки, полипептиды. Изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном.
При росте на желатиновой среде микробов, ферментирующих желатин, среда разжижается. Характер разжижения, вызываемый разными микробами, различен (см. приложение).
Молоко. Свежее молоко доводят на огне до кипения и кипятят 5 минут. Оставляют в прохладном месте на сутки. Освобождают от верхнего жирного слоя. Вторично кипятят 5 минут, оставляют на сутки, опять снимают верхний слой. Фильтруют 2-3 раза через плотную ватную пробку, нейтрализуют 10% раствором карбоната натрия до рН 7,2, определяемого розоловой бумажкой или по потенциометру. Разливают и стерилизуют текучим паром 2 дня по 30 минут. Протеолиз казеина в молоке выражается растворением сгустка казеина, образованного бактериями, свертывающими молоко. Оно приобретает вид молочной сыворотки. Микробы, расщепляющие казеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока —- при расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак.
Образование газов можно установить с помощью индикаторных бумажек на МПБ. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают, нарезают узенькими полосками длиной 5 — 6 см и после посева культуры на МПБ помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат.
Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной 20% раствором свинца ацетата и натрия гидрокарбоната, происходит образование свинца сульфата — бумажка чернеет; индол вызывает покраснение бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты.
Гемолитические свойства - способность разрушать эритроциты. Изучают на средах с кровью. Жидкие кровяные среды при этом становятся прозрачными, а на плотном кровяном агаре вокруг колонии появляется прозрачная зона гемолиза. При образовании метгемоглобина среда зеленеет.
Задание № 24.
Сделайте посев на углеводные и белковые среды для изучения сахаролитических и протеолитических свойств культуры. Внимание! Соблюдайте правила техники безопасности при работе с живыми культурами.
Задание №25.
Запишите в дневник методики исследований.
Задание №26.
Зарисуйте в альбом биохимический ряд.
Ознакомьтесь с серологическими свойствами бактерий.
Серологические свойства микроорганизмов - это свойства, описывающие антигенное строение микробной клетки. Они определяются с помощью серологических реакций. Например, реакции агглютинации на стекле. При этом используются исследуемая чистая культура и различные агглютинирующие сыворотки.
Произведите окончательную идентификацию бактерий. Выпишите результат исследования, используя бланк специального образца.
Вопросы для закрепления
1. Что называют культуральным методом лабораторной диагностики?
2. Каковы достоинства и недостатки этого метода?
3. Назовите задачи бактериологического метода.
4. Каковы правила взятия биологического материала в бактериологическую лабораторию?
5. Расскажите о правилах оформления направления, прилагаемого к материалу.
6. Расскажите о правилах транспортировки материала в бактериологическую лабораторию.
7. Каковы основные правила регистрации материала?
8. Перечислите основные манипуляции, производимые на 1 этапе бактериологического метода диагностики.
9. Назовите известные вам способы посева материала на плотные и жидкие питательные среды.
10. Расскажите об основных правилах приготовления окрашенных препаратов.
11. Перечислите основные манипуляции, производимые на 2 этапе бактериологического метода диагностики.
12. Что называют культуральными свойствами бактерий?
13. Какие способы изучения колоний вы знаете?
14. Какие признаки колоний можно описать, наблюдая невооруженным глазом в отраженном свете?
15. Какие признаки колоний можно описать, наблюдая невооруженным глазом в проходящем свете?
16. Какие признаки колоний можно описать при малом увеличении микроскопа или с помощью лупы?
17. Каковы правила приготовления мазков из колоний?
18. Какие правила техники безопасности необходимо выполнять при проведении посевов?
19. Какие манипуляции проводят на 3 этапе бактериологического метода исследования?
20.Для чего на 3 этапе бактериологического метода исследования изучают морфологические свойства бактерий?
21. Расскажите об основных этапах приготовления окрашенного мазка.
22. Что называют морфологическими свойствами бактерий?
23. Что называют ферментативными свойствами бактерий?
24. Какие субстраты расщепляют микроорганизмы?
25. Что называют сахаролитическими свойствами?
26. Как определить сахаролитические свойства на средах Эндо, Левина, Плоскирева?
27.Каким образом оценить сахаролитические свойства, используя пестрый ряд сред Гисса?
28. Какие конечные продукты выделяются при ферментации? Как их определить?
29. Как увидеть газообразование на плотных и жидких средах?
30. Что называют протеолитическими свойствами?
31. Какие питательные среды используют для их изучения?
32. Как проявляется протеолиз на желатиновом агаре?
33. Как выглядит протеолиз в молоке?
34. Что называют гемолитическими свойствами?
35. На каких средах их можно оценить?
36. Что такое гемолиз? Как выглядит гемолиз на жидких и плотных средах?
37. На основании каких свойств производится окончательная идентификация возбудителя?
Домашнее задание: учебник Ф.К. Черкес, с.111-113,
Учебник С.А. Павловича , с.87-92
Обряды и обрядовый фольклор: составляли словесно-музыкальные, драматические, игровые, хореографические жанры, которые.
Что входит в перечень работ по подготовке дома к зиме: При подготовке дома к зиме проводят следующие мероприятия.
Не секрет, что прокариоты – это одноклеточные организмы. Они легко и быстро размножаются, удваивая свое количество, по некоторым данным, каждые 20-30 минут. Несложно догадаться, что перед нами геометрическая прогрессия роста культуры.
Колония – это потомство одной клетки, видимое скопление огромного количества микроорганизмов на питательной среде. По размеру колонии, ее цвету и другим морфологическим признакам в лаборатории определяют культуральные свойства бактерий.
Для изучения параметров отдельного скопления клеток прокариот используется специальная питательная среда. На ней микроорганизмы способны быстро размножаться, т. к. в состав входят важные для метаболизма бактерий вещества. В итоге через 4-5 суток (промежуток времени может варьировать) на чашке Петри появляются приметные видимые точки, с которыми и проводится работа.
ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
(ГОУ ВПО ИГМУ Минздравсоцразвития России)
1 Методические рекомендации составлены:
Методические рекомендации обсуждены на заседании кафедры микробиологии ИГМУ.
Протокол № от 2009г.
Методические рекомендации рассмотрены и рекомендованы к изданию на заседании цикловой методической комиссии кафедр медикобиологического профиля ИГМУ.
Протокол № от _2009 г.
Председатель ЦМК профессор Р.В. Киборт ЗАНЯТИЕ № Тема занятия: Физиология микроорганизмов: питание, питательные среды, используемые для культивирования микроорганизмов (классификация, требования). Культуральные свойства микроорганизмов. Дыхание, рост и размножение бактерий. Принципы культивирования аэробных и анаэробных микроорганизмов.
Вопросы для самостоятельной подготовки студентов к занятиям:
Химический состав бактериальной клетки. Роль воды, белков, липидов, 1.
углеводов, нуклеиновых кислот, минеральных солей для жизнедеятельности бактерий.
Питание бактерий. Типы питания. Механизмы переноса питательных 2.
веществ в бактериальную клетку.
Рост и размножение бактерий. Фазы размножения бактерий в популяции.
Дыхание бактерий. Основные типы биологического окисления субстрата 4.
Энергетический метаболизм. Аэробы, анаэробы, факультативные анаэробы, 5.
Аэротолерантные системы защиты бактериальной клетки от токсического 6.
действия свободных кислородных радикалов.
Пути получения энергии: биологическое окисление и брожение.
Студент должен знать:
Культивирование микроорганизмов. Условия, необходимые для 1.
культивирования: питательные среды, температурный режим, состояние кислорода в атмосферном воздухе.
Питательные среды. Классификация питательных сред.
Требования, предъявляемые к питательным средам.
Практическое применение питательных сред.
Культуральные свойства бактерий.
Методы культивирования бактерий на жидких и твердых питательных 6.
Знать способы создания анаэробных условий.
Знать методы выделения чистых культур на основе:
а) механического разобщения;
б) биологических особенностей микроорганизмов;
в) биохимических особенностей микроорганизмов.
Студент должен уметь:
Соблюдать правила противоэпидемического режима и техники безопасности при работе с чистыми культурами возбудителей.
Забирать материал для проведения бактериологических исследований.
Проводить бактериологическую работу:
дифференцировать типы роста микроорганизмов на жидких питательных описывать культуральные свойства микроорганизмов на твердых питательных средах.
— изучать культуральные свойства бактерий.
— производить посев для выделения чистой культуры анаэробов.
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ
Метод выделения чистой культуры микроорганизмов путем рассева на поверхности плотной питательной среды.
Метод посева истощающим штрихом. В основе метода лежит механическое разобщение микробных клеток путем снижения их концентрации по ходу нанесения исследуемого материала бактериологической петлей штриховыми движениями по поверхности плотной питательной среды (а) и последующим их культивированием с целью получения изолированных колоний (б).
В основе этого метода лежит разобщение микробных клеток на поверхности питательной среды с применением шпателя. На поверхность питательного агара наносится капля исследуемого материала и распределяется круговыми движениями шпателя по всей поверхности,(крышка на чашке должна быть слегка приоткрыта). Не прожигая шпателя, посев производится аналогичным образом во 2-ю и затем в 3-ю чашку последовательно. Чашки подписываются и инкубируются при t — 37С.
Метод выделения чистой культуры микроорганизмов путем рассева в Суть метода состоит в снижении концентрации микроорганизмов в исследуемом материале путем разведения в физиологическом растворе хлорида натрия (а) с последующем внесении в питательный агар (б) и культивированием с целью получения изолированных колоний (в).
3 этапа выделения изолированных колоний
Исходный материал, как правило, содержит смесь разнообразных бактерий. Выделение изолированных колоний необходимой группы клеток – это скрупулезный и требующий внимания процесс. Он условно делится на три этапа:
1. Выделение накопительной культуры бактерий, среди которых присутствует необходимая нам для исследования.
2. Выделение изолированных чистых колоний с помощью специальных селективных методов.
3. Выращивание и размножение клеток бактерий, проведение работы с ними.
МПА МПА
на основе биологических особенностей микроорганизмов а) Метод Шукевича. Этот метод используется для выделения чистой культуры тех микроорганизмов, для которых характерен ползучий рост.
Посев исследуемого материала производится в конденсат скошенной части агара. Для этого стерильной петлей исследуемый материал вносится так, чтобы не соприкасаться с поверхностью питательной среды. Пробку с питательной средой инкубируют в вертикальном положении.
б) Выделение чистой культуры с использованием селективных сред В основе этого метода лежат метаболические особенности микроорганизмов. Наличие ингибиторов роста в питательной среде не позволяет формировать колонии микроорганизмов сопутствующей микрофлоры. Специальные среды нашли широкое применение для выделения возбудителей различных инфекций. Добавление к питательной среде значительных концентраций поваренной соли (ЖСА) дает селективные преимущества росту стафилококка, ингибирует сопутствующую микрофлору. При выделении чистой культуры некоторых бактерий используют для их культивирования температурный оптимум.
Культивированием при t ниже 20С позволяет выделить из загрязненного материала возбудителя чумы, рост сопутствующей микрофлоры ингибируется.
ЗАДАНИЕ 4. Освоить посев штрихом на плотную питательную среду с целью получения изолированных колоний:
а) правой рукой взять бактериальную петлю и простерилизовать ее над пламенем горелки;
б) левой рукой, между большим и указательным пальцами держать пробирку с исследуемым материалом;
в) легким вращательным движением обхватить ватную пробку мизинцем правой руки, прижимая к ладони и вынуть ее из пробирки;
г) край пробирки слегка обжечь;
д) стерильной петлей забрать немного материала, содержащего микробы и зигзагообразными движениями нанести на поверхность питательного агара чашки Петри;
е) петлю после посева прожечь, пробирку закрыть пробкой.
Следите, чтобы посев был выполнен на всю поверхность питательной среды, не нарушая ее целостности.
ЗАДАНИЕ 5. Освоить метод посева уколом в столбик агара.
а) пробирку с агаром держать дном кверху.
б) материал, подлежащий посеву берут стерильной иглой, которую отвесно вкалывают в поверхность агара и продвигают по оси пробирки до самого дна;
в) иглу извлечь, обжечь над пламенем горелки, пробирку закрыть пробкой и поставить в термостат.
ЗАДАНИЕ 9. Освоить метод посева на питательную среду шпателем.
а) чашку слегка приоткрыть. На поверхность агара нанести стерильной бактериальной петлей каплю исследуемого материала;
б) стерильным стеклянным шпателем растереть каплю по всей поверхности, проводя легкие вращающие движения шпателем;
в) по окончании работы шпатель дезинфицировать путем прожигания над пламенем горелки, предварительно обработав спиртом, либо опустив его в дезинфицирующий раствор.
Читайте также: