Оптимальные условия инкубирования посевов воды для выявления термотолерантных колиформных бактерий
Обновлено: 05.10.2024
441. Для выделения Вас illus cereus применяется среда:
д) кровяной агар
442. При исследовании мороженого срок термостатирования посевов составляет:
443. Санитарно-бактериологическое исследование вареных колбас предусматривает определение следующих бактерий:
б) золотистый стафилококк
в) колиформы, золотистый стафилококк
г) колиформы, клостридии
д) колиформы, золотистый стафилококк, клостридии
444. Для выделения Cl ostridium perfringens используется среда:
а) Вильсона - Блера
б) полужидкий агар
д) кровяной агар
445. Cl ostridium perfringens образует в среде Вильсона-Блера колонии:
б) желтого цвета
в) черного цвета
446. Условия инкубирования среды для выделения Cl ostridium perfringens:
447. Подготовка среды Вильсона-Блер к посеву включает:
а) прогревание в течение 40 минут при 80 0 С
б) прогревание в течение 40 минут при 80 0 С с последующим резким охлаждением
в) нагрев до 44 0 С в течение 1 часа
г) прогревание в течение суток при 37 0 С
д) охлаждение среды в течение 1 часа
448. Для выделения грибов и дрожжей используют среду:
а) Вильсона - Блера
б) полужидкий агар
д) кровяной агар
449. Результат о наличии колифагов в воде выражают в единицах:
а) БОЕ в 100 мл воды
б) БОЕ в 1000 мл воды
в) ОМЧ в 100 мл воды
г) КОЕ в 100 мл воды
д) КОЕ в 1000 мл воды
450. Объемы питьевой воды, засеваемые для выявления спор сульфит-редуцирующих клостридий:
451. Оптимальные условия инкубирования посевов воды для выявления термотолерантных колиформных бактерий:
а) 24 часа при 37 0 С
б) 48 часов при 37 0 С
в) 48 часов при 25 0 С
г) 24 часа при 44 0 С
д) 48 часов при 44 0 С
452. Результат анализа питьевой воды на клостридии выражают в следующих единицах:
а) БОЕ в 20 мл воды
б) БОЕ в 100 мл воды
в) ОМЧ в 20 мл воды
г) КОЕ в 20 мл воды
д) КОЕ в 100 мл воды
453. Методом мембранных фильтров колиформные бактерии выделяют на среде:
а) Вильсона - Блера
б) полужидкий агар
д) кровяной агар
454. В качестве среды накопления для выявления колиформных бактерий в питьевой воде используют:
а) 1% пептонную воду
б) селенитовый бульон
в) глюкозопептонную среду
г) магниевую среду
д) глицериновую среду
455. Оптимальные условия инкубирования посевов воды для выявления общих колиформных бактерий:
а) 24 часа при 37 0 С
б) 48 часов при 37 0 С
в) 48 часов при 25 0 С
г) 24 часа при 44 0 С
д) 48 часов при 44 0 С
456. При исследовании питьевой воды на колиформные бактерии на среде Эндо учитывают колонии:
д) темно-красные с металлическим блеском
457. Средой накопления для выявления сальмонелл в воде водоемов является:
а) 1% пептонная вода
б) среда Кесслер
в) магниевая среда
г) селенитовая среда
д) глюкозопептонная среда
458. Методом микробиологического исследования воздуха является:
а) аспирационный
г) посев в полужидкий агар
д) газонный метод
459. Для определения коли-титра в пищевых продуктах используется среда накопления:
в) мясо-пептонный бульон
460. Для определения присутствия дрожжей, вызывающих порчу продуктов, используют среду:
а) мясо-пептонный агар
в) мясо-пептонный бульон
461. Для определения МАФАМ применяется среда:
а) мясо-пептонный агар
в) сусловой агар
462. Для определения МАФАМ подсчитывают колонии следующего варианта:
а) мелкие колонии на поверхности агара
б) крупные колонии на поверхности агара
в) мелкие колонии в глубине агара
г) крупные колонии в глубине агара
д) все колонии на поверхности и в глубине агара
463. Для выявления анаэробной микрофлоры в консервах применяют питательную среду:
а) Китт-Тароцци
в) мясо-пептонный бульон
464. Для определения в консервах мезофильных аэробов используют жидкую питательную среду:
а) лактозопептонная среда
б) желчный бульон
в) селенитовый бульон
г) бульон Сабуро
д) мясо-пептонный бульон с 1% глюкозы
465. При исследовании бочкового пива, кваса не определяют:
а) общие колиформные бактерии
в) общая обсемененность
г) дрожжевые и плесневые грибы
д) термотолерантные колиформные бактерии
466. Жидкие пищевые продукты, явившиеся причиной пищевого отравления, засевают:
а) без разведения
б) разведенными 1:2
в) разведенными 1:5
г) разведенными 1:10
д) разведенными 1:100
467. Пробы, доставляемые на исследование по поводу пищевого отравления:
а) исследуются в любом количестве
б) исследуется 200 г продукта
в) исследуется 500 г продукта
г) исследуется 50 г продукта
д) исследуется 100 г продукта
468. Посевы на колифаги инкубируют в следующих условиях:
а) 24 часа при 37 0 С
б) 48 часов при 37 0 С
в) 48 часов при 25 0 С
г) 24 часа при 44 0 С
д) 48 часов при 44 0 С
469. Оптимальные условия доставки в лабораторию проб питьевой воды:
а) 10 часов при температуре +10-15 0 С
б) 6 часов при температуре +4-10 0 С
в) 12 часов при температуре +4-10 0 С
г) 6 часов без охлаждения
д) 24 часа без охлаждения
470. Оптимальные условия инкубирования посевов на золотистый стафилококк:
а) 48 часов при 37 0 С
б) 24 часа при 37 0 С
в) 48 часов при 25 0 С
г) 24 часа при 44 0 С
д) 48 часов при 44 0 С
471. Время инкубирования посевов питьевой воды на лактозопептонной среде:
а) 24-48 часов
472. При бактериологическом анализе питьевой воды на колиформные бактерии засевают объемы:
а) 2 объема по 200 мл воды
б) 3 объема по 100 мл воды
в) 5 объемов по 50 мл воды
г) 1 объем 50 мл
д) 2 объема по 100 мл воды
473. Для расчета наиболее вероятного числа бактерий в 100 мл питьевой воды засевают объемы:
а) 2 по 100 мл, 2 по 10 мл, 2 по 1 мл
б) 4 по 100 мл, 4 по 10 мл, 4 по 1 мл
в) 5 по 50 мл, 5 по 10 мл, 5 по 1 мл
г) 3 по 100 мл, 3 по 10 мл, 3 по 1 мл
д) 3 по 200 мл, 3 по 20 мл, 3 по 2 мл
474. Аутохтонная микрофлора воды поверхности водоемов представлена всеми группами бактерий, КРОМЕ:
б) извитые формы
в) микроскопические водоросли
г) патогенные энтеробактерии
д) грибки и актиномицеты
475. Основные группы микроорганизмов, подлежащих учету при исследовании воды плавательных бассейнов:
а) общие колиформные бактерии, клостридии
б) общие колиформные бактерии, золотистый стафилококк
в) золотистый стафилококк, коли-фаги
г) клостридии, золотистый стафилококк
д) общие колиформные бактерии, золотистый стафилококк, клостридии
476. Критериями оценки качества питьевой воды являются все показатели, КРОМЕ:
б) общие колиформные бактерии
в) золотистый стафилококк
г) термотолерантные колиформные бактерии
477. Основную бактериальную обсемененность пищевых продуктов обеспечивают:
а) специфическая и неспецифическая микрофлора
б) молочнокислые бактерии
д) споры клостридий
478. При исследовании воды централизованного водоснабжения учету подлежат индикаторные микроорганизмы, КРОМЕ:
а) общие колиформные бактерии
в) энтерококки
г) термотолерантные колиформные бактерии
479. Объектами исследования при бактериологическом контроле в медицинских учреждениях являются:
а) воздушная среда
б) шовный материал
в) хирургический инструментарий
г) стерильный перевязочный материал
д) все перечисленное
480. Основным индикатором санитарного неблагополучия на пищевых предприятиях являются:
а) колиформные бактерии
в) грибы и дрожжи
481. При определении коли-фагов в воде для освобождения от бактерий применяют:
б) теллурит калия
в) хлороформ
482. Режим термостатирования при исследовании на стерильность на среде Сабуро:
а) 20-22 0 С - 7 сут
б) 35-37 0 С - 7 сут
в) 20-22 0 С - 14 сут
г) 35-37 0 С - 14 сут
д) 44 0 С - 7 сут
483. Метод посева по Шукевичу используют для обнаружения:
г) колиформных бактерий
484. Условия инкубирования посевов по Шукевичу:
а) 37 0 С - 48 часов
б) 22 0 С - 18 часов
в) 43 0 С - 24 часа
г) 43 0 С - 48 часов
д) 37 0 С - 24 часа
485. При посеве по Шукевичу материал вносят:
а) на поверхность МПА в чашке Петри
б) на поверхность скошенного МПА
в) в столбик скошенного МПА.
г) в конденсат скошенного МПА
д) в глубину МПА в чашке Петри
486. Рост протеев при посеве по Шукевичу обнаруживают в виде:
а) ползучей пленки на поверхности МПА
б) помутнения в конденсате МПА
в) выпуклых белых колоний
г) мелких прозрачных колоний
д) матовой сморщенной пленки
487. Запах земляничного мыла является специфичным для:
а) колиформных бактерий
г) синегнойной палочки
488. Основным отличительным признаком Р seudomonas aеruginosа является:
а) полупрозрачные или белые колонии
б) отрицательная окраска по Граму
в) наличие жгутиков
г) наличие сине-зеленого пигмента
д) запах земляничного мыла
489. Микроорганизмы, относящиеся к клостридиям, представляют собой:
а) грамположительные неспорообразующие аэробные палочки
б) грамотрицательные спорообразующие анаэробные палочки
в) грамположительные неспорообразующие анаэробные палочки
г) грамположительные спорообразующие аэробные палочки
д) грамположительные спорообразующие анаэробные палочки
490. Микробиологический контроль стерильности проводится медицинскими учреждениями:
а) 1 раз в месяц
б) 2 раза в месяц
в) 1 раз в 10 дней
г) 1 раз в неделю
491. Бактериологическое исследование воздушной среды в медицинских учреждениях предусматривает определение:
а) количество стрептококков и стафилококков
б) общее количество бактерий и золотистый стафилококк
в) энтеропатогенные бактерии
д) синегнойная палочка
492. При исследовании на стерильность медицинского инструментария большого размера:
а) берут смывы тампоном, увлажненным соответствующей питательной средой
б) изделия заливают питательной средой, а затем отсасывают пипеткой
в) берут смыв тампоном с физ. раствором
г) смывы не берут
д) отправляют инструментарий в бак. лабораторию
493. Минимальная партия изделий одного наименования для исследования на стерильность:
494. Щелочно-полимиксиновая среда используется для обнаружения:
б) энтерококков
г) колиформных бактерий
495. Для выделения B acillus cereus в пищевых продуктах используют среду:
а) солевой полимиксиновый агар
б) висмут-сульфит агар
в) шоколадный агар
г) щелочно-полимиксиновую среду
д) щелочной агар
496. Исследование консервов на термотолерантные бактерии проводят при температуре:
497. Для определения спор сульфитредуцирующих клостридий в консервах необходима пробоподготовка:
а) прогрев при 45 0 С 20 минут
б) прогрев при 80 0 С 20 минут
в) прогрев при 37 0 С 30 минут
г) прогрев при 80 0 С 60 минут
д) прогрев при 100 0 С 30 минут
498. Микроорганизмы, свидетельствующие об антропогенном загрязнении прибрежной морской воды, КРОМЕ:
18.3. Методы определения общих и термотолерантных колиформных бактерий в воде
Общие колиформные бактерии (ОКБ) – это грамотрицательные, оксидазоотрицательные палочки, не образующие спор, растущие на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 37±1 °С в течение 24–48 ч. Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число ОКБ, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 44±0,5 °С в течение 24 ч.
ОКБ и ТКБ в воде, согласно действующим МУ 2.1.4.1018–01, определяют мембранным и титрационным (бродильным) методами. Титрационный метод используют только при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации, наличии в воде большого количества взвешенных веществ и в случае преобладания посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний.
18.3.1. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации
Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема воды на мембранных фильтрах с подращиванием их на среде Эндо при 37±1,0 °С, дифференцировании по культуральным и биохимическим тестам и подсчете выросших колоний.
Первый день. 1. Подготовка мембранных фильтров. Мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм (ацетатцеллюлозные, нитратцеллюлозные, ядерные и др.), имеющие сертификат качества, выпускаются стерильными, в противном случае их стерилизуют методом кипячения по инструкции, предложенной изготовителем.
- Подготовка фильтровального аппарата. Фильтровальный аппарат, воронку и столик фильтровального аппарата обтирают и фламбируют марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртом. После охлаждения на столик фильтровального аппарата кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его воронкой. Если вода содержит большое количество взвешенных веществ или клеток, ее сначала фильтруют через фильтр с большим диаметром пор, помещая его поверх основного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм.
- Фильтрование воды. В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем воды, затем создают вакуум. При посеве нескольких объемов одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат без обеззараживания сначала меньшие, а затем большие объемы воды, меняя каждый раз фильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы прибор обеззараживают. Вначале фильтруют пробы обеззараженной воды или предположительно незагрязненные, а затем фильтруют загрязненные пробы. При фильтровании 1 мл исследуемой воды в воронку наливают предварительно не менее 10 мл стерильной воды, а затем вносят анализируемую воду.
После окончания фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на питательную среду Эндо (рецепты 96, 97), разлитую в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.
Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, номера пробы и даты посева. На одну чашку помещают 3–4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре 37±1 °С в течение 24±2 ч.
При исследовании питьевой воды анализируют 3 объема по 100 мл. При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 мл воды через один фильтр.
Объем воды водоемов для посева выбирают в зависимости от степени ее предполагаемого загрязнения. Рассчитывают, чтобы не менее чем на двух фильтрах выросли изолированные колонии. Из них не более 30 колоний на фильтрах диаметром 35 мм или не более 50 колоний на фильтрах диаметром 47 мм должны быть образованы колиформными бактериями. При этом можно ориентироваться на результаты предыдущих исследований.
При исследовании воды неизвестной степени бактериального загрязнения следует засевать не менее четырех-десяти-кратных ее объемов.
Так, например, для воды водоемов, загрязняемых сточными водами, рекомендуется брать объемы 10; 1; 0,1; 0,01 мл. При анализе воды водоемов в зоне влияния выпуска сточных вод – 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 мл; для чистых водоемов – 100; 50; 10; 1 мл. При анализе воды незагрязненных шахтных колодцев фильтруют 100; 10; 1 и 0,1 мл.
Второй день. По окончании инкубации производят просмотр посевов:
- • отсутствие микробного роста или обнаружение колоний, не характерных для ОКБ (пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые), позволяет на этом этапе анализа закончить исследования с выдачей отрицательного результата (отсутствие ОКБ и ТКБ в исследуемом объеме воды). Анализ заканчивают через 24 ч;
- • при обнаружении на фильтрах типичных лактозоположительных колоний (темно-красных, красных с металлическим блеском или без него либо других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра) исследования продолжают. Подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ.
Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на наличие оксидазной активности (см. гл. 9, рецепт 75). Оксидазный тест предложен для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других водных сапрофитов, которые в отличие от кишечных бактерий вырабатывают фермент оксидазу.
Готовят мазки, окрашивают их по Граму, микроскопируют или определяют принадлежность к грамотрицательным бактериям постановкой теста Грегерсена, не требующего использования оптики (см. гл. 6). Подтверждают ферментацию лактозы до кислоты и газа.
Оставшуюся часть оксидазоотрицательной грамотрицательной изолированной колонии засевают параллельно в две пробирки с лактозной средой (рецепт 99).
- — для подтверждения наличия ОКБ посев инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 48 ч;
- — для подтверждения наличия ТКБ посев осуществляют в среду, предварительно прогретую до температуры 43–44 °С, и инкубируют при температуре 44±0,5 °С в течение 24 ч.
Первичный учет образования кислоты и газа на подтверждающих полужидких средах и СИБ-лактозы (коммерческие полоски) возможен через 4–6 ч. При обнаружении кислоты и газа в среде с лактозой дают положительный ответ. При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты пробирки с посевами для окончательного учета ТКБ оставляют до 24 ч. Пробирки с посевами для подтверждения наличия ОКБ после просмотра через 24 ч и получения отрицательного результата оставляют для окончательного учета до 48 ч.
При лабораторно-производственном контроле качества воды поверхностных водоемов анализ может быть завершен подсчетом колоний, которые отнесены к ОКБ по двум признакам: отрицательному оксидазному тесту и ферментации лактозы на среде Эндо до кислоты и альдегида. Дальнейшее подтверждение ОКБ по способности образовывать газ на лактозных средах проводят только при отсутствии достаточно четкой дифференциации лактозоположительных колоний, при росте мелкоточечных или мелких плоских колоний, не характерных для колиформных бактерий, при небольшом опыте работы выполняющего анализ.
Учет результатов. Грамотрицательные колонии учитываются как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 37 °С с образованием кислоты и газа.
Грамотрицательные колонии учитываются как ТКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44 °С с образованием кислоты и газа.
При анализе питьевой воды, воды водоемов число колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа в КОЕ на 100 мл воды.
Вычисление проводят по формуле:
где X – число колоний в 100 мл; V – профильтрованный через фильтры объем воды; а – число подсчитанных на этих фильтрах колоний в сумме.
- При посеве по 100 мл воды на 3 фильтрах выросло две колонии на одном фильтре, на остальных двух фильтрах нет роста. Число общих или термотолерантных колиформных бактерий будет:
- При посеве 10, 40, 100 и 150 мл воды на фильтрах с профильтрованным объемом 40 мл выросло 4 изолированные колонии, с профильтрованным объемом 100 мл – 3 ОКБ. Фильтры с объемами 10 и 150 мл заросли и учету не подлежат. Суммируют общее число колоний ОКБ (ТКБ) на тех фильтрах, где получены изолированные колонии, пересчитывают это число на объем 100 мл.
Питьевая вода, вода водоемов удовлетворяют требованиям в том случае, когда ОКБ и ТКБ не обнаруживают в 100 мл воды. При установлении бактериальной загрязненности воды свыше допустимых норм прибегают к повторному исследованию воды.
18.3.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом
Первый день: а) при исследовании питьевой воды засевают 3 объема по 100 мл (качественный метод). При исследованиях воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ при повторном анализе производят посев: трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл, трех объемов по 1 мл;
б) посев воды водоемов производят в двух или трех повторностях. Воду водоемов, не загрязняемых сточными водами, засевают в объемах по 10; 1; 0,1; 0,01 мл; воду водоемов, загрязняемых сточными водами, – по 1; 0,1; 0,01; 0,001 мл; воду водоемов в зоне влияния выпусков сточных вод – в объеме по 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 мл.
Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозопептонную среду (рецепт 95). Посев 100 и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозопептонной среды, посев 1 мл пробы проводят в 10 мл среды обычной концентрации.
Второй день. Посевы инкубируют при 37±1 °С. Не ранее 24 ч инкубации проводят предварительную оценку посевов. Из емкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа, производят высев бактериологической петлей на сектора среды Эндо (рецепты 96, 97) для получения изолированных колоний.
Емкости без наличия роста и образования газа оставляют в термостате и окончательно просматривают через 48 ч. Посевы без признаков роста считают отрицательными, и дальнейшему исследованию они не подлежат. Из емкостей, где отмечено помутнение и образование газа или только помутнение, делают высев на сектора среды Эндо.
Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 18–20 ч.
При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бактерий (темно-красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде), дают положительный ответ на присутствие ОКБ в данном объеме пробы.
Отрицательный ответ выдается, если в среде накопления и на секторах среды Эндо не отмечено роста; на секторах среды Эндо выросли не характерные для колиформных бактерий колонии; все колонии оказались оксидазоположительными; все бактерии оказались грамположительными; не отмечено газообразования в подтверждающем тесте на среде с углеводом.
Для определения секторов среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии, делают посев 2–3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред (рецепты 99, 100).
Среду перед посевом нагревают на водяной бане или в термостате до 44 °С. Немедленно после посева пробирки помещают в термостат и инкубируют при температуре 44±0,5 °С в течение 24 ч. Допускается просмотр посевов через 4–6 ч.
При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 ч при температуре 44 °С дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях выдают отрицательный ответ.
Для ускорения выдачи ответа на присутствие ТКБ производят высев 1 мл из объемов среды накопления, где отмечено помутнение и газообразование в пробирке с лактозо-пептонной средой с поплавком и прогретой предварительно до температуры 44 °С. Посевы выдерживают в термостате при температуре 44±0,5 °С в течение 24 ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ.
Учет результатов. При обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из трех объемов питьевой воды выдается ответ об обнаружении ОКБ и ТКБ в 100 мл.
При исследовании количественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ питьевой воды (табл. 18.1), воды водоемов (табл. 18.2).
Общие колиформные бактерии (ОКБ) - грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 37 +/- 1 °C в течение 24 - 48 ч.
Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 44 +/- 0,5 °C в течение 24 ч.
8.2.2. Принцип метода
Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам.
8.2.3. Выполнение анализа
8.2.3.1. Порядок исследования
При исследовании питьевой воды анализируют 3 объема по 100 мл.
При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 мл воды через один фильтр.
При фильтрации воды неизвестного качества целесообразно увеличение количества фильтруемых объемов для получения изолированных колоний на фильтре (например, 10, 40, 100, 150 мл воды).
Отмеренный объем воды фильтруют через мембранные фильтры с соблюдением требований, изложенных в п. 7.
Фильтры помещают на среду Эндо, приготовленную по п. 5.4. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре 37 +/- 1 °C в течение 24 +/- 2 ч.
Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые, выдают отрицательный ответ: отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 мл исследуемой воды. Анализ заканчивают через 24 ч.
Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозоположительных колоний: темно-красных, красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ.
Для подтверждения наличия ОКБ исследуют:
- все колонии, если на фильтрах выросло менее 5 колоний;
- не менее 3 - 4 колоний каждого типа.
Для подтверждения наличия ТКБ исследуют все типичные колонии, но не более 10.
Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на:
- наличие оксидазной активности;
- принадлежность к Граму (микроскопия окрашенного по Граму препарата или постановка теста Грегерсена);
- ферментацию лактозы до кислоты и газа.
8.2.3.2. Постановка оксидазного теста
Полоску фильтровальной бумаги помещают в чистую чашку Петри и смачивают 2 - 3 каплями реактива для оксидазного теста по п. 5.7. Готовые бумажные системы смачивают дистиллированной водой. Часть изолированной колонии стеклянной палочкой или платиновой петлей (металлическая петля из нихрома может дать ложноположительную реакцию) наносят штрихом на подготовленную фильтровальную бумагу. Реакция считается положительной, если в течение 1 мин. появляется фиолетово - коричневое (п. 5.7.1, вариант 1) или синее (п. 5.7.2, вариант 2 и СИБ-оксидаза) окрашивание штриха. При отрицательной реакции цвет в месте нанесения культуры не меняется. При положительном результате эту колонию из дальнейшего исследования исключают.
Если при исследовании колоний, окрашенных в темно-красный цвет, получают недостаточно четкий результат, необходимо пересеять культуру со среды Эндо на питательный агар. После инкубации тест повторяют.
8.2.3.3. Определение принадлежности к Граму
Из оксидазоотрицательной колонии делается мазок, окрашивается по Граму и микроскопируется.
На обезжиренное спиртом предметное стекло наносят петлей 1 каплю дистиллированной воды, вносят небольшое количество культуры из анализируемой колонии и распределяют по поверхности стекла. Мазок высушивают при комнатной температуре и фиксируют трехкратным проведением через пламя горелки. На препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генциана фиолетового на 0,5 - 1 мин., снимают бумагу, наливают раствор Люголя на 0,5 - 1 мин., сливают раствор Люголя и стекло промывают в этиловом спирте в течение 0,5 - 1 мин., пока не перестанет отходить краситель. Затем стекло тщательно промывают водой и докрашивают в течение 1 - 2 мин. фуксином Циля, разведенным 1:10 дистиллированной водой. После промывания и просушивания препарата мазок микроскопируют.
Приготовление реактивов для окраски по Граму изложено в п. 5.9.
Грамотрицательные микроорганизмы имеют розовую окраску, грамположительные окрашиваются в синий цвет. Колиформные бактерии являются грамотрицательными палочками.
Окраска по Граму может быть заменена тестом Грегерсена, не требующим использования оптики.
Тест Грегерсена: в капле 3%-ного водного раствора КОН на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры или колонии к грамотрицательному виду. У грамположительных бактерий слизистые нити не образуются - реакция отрицательная.
8.2.3.4. Определение ферментации лактозы
Оставшуюся часть оксидазоотрицательной грамотрицательной изолированной колонии засевают параллельно в две пробирки с лактозной средой (п. 5.6):
- для подтверждения наличия ОКБ посев инкубируют при температуре 37 +/- 1 °C в течение 48 ч;
- для подтверждения наличия ТКБ посев осуществляют в среду, предварительно прогретую до температуры 43 - 44 °C, и инкубируют при температуре 44 +/- 0,5 °C в течение 24 ч.
Первичный учет образования кислоты и газа на подтверждающих полужидких средах и СИБ (п. 5.6) возможен через 4 - 6 ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ. При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты пробирки с посевами для окончательного учета ТКБ оставляют до 24 ч. Пробирки с посевами для подтверждения наличия ОКБ после просмотра через 24 ч и получения отрицательного результата оставляют для окончательного учета до 48 ч.
Если колония, подлежащая исследованию, незначительных размеров, ее пересевают на скошенный питательный агар и после инкубации в течение 18 - 24 ч выполняют все необходимые подтверждающие тесты.
8.2.3.5. Постановка подтверждающих тестов при наложении колоний или сплошном росте
Если на части или на всей поверхности фильтра наблюдается наложение колоний или сплошной рост, выполняют оксидазный тест путем помещения мембранного фильтра на кружок фильтровальной бумаги большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивом, или на диск СИБ-оксидаза, смоченный дистиллированной водой. При появлении первых признаков реакции, но не более чем через 5 мин., мембранный фильтр переносят обратно на среду Эндо. После четкого проявления реакции определяют результат. При появлении фиолетово-коричневого или синего окрашивания (в зависимости от примененного реактива) оксидазный тест считают положительным.
Если на фильтрах все колонии оксидазоположительные, они не учитываются, и выдают ответ об отсутствии ОКБ и ТКБ и завершают анализ.
При отрицательной оксидазной реакции проводят рассев до получения изолированных колоний и подтверждают их принадлежность к ОКБ и ТКБ по п. п. 8.2.3.3 - 8.2.3.4 (анализ качественный).
8.2.4. Учет результатов
8.2.4.1. Грамотрицательные колонии учитываются как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 37 °C с образованием кислоты и газа.
Грамотрицательные колонии учитываются как ТКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44 °C с образованием кислоты и газа.
8.2.4.2. При отсутствии общих и термотолерантных колиформных бактерий на всех фильтрах результат записывают "не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 мл" и "не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 мл".
8.2.4.3. В случае идентификации всех выросших подозрительных колоний число колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ в 100 мл воды.
Вычисление проводят по формуле:
X - число колоний в 100 мл;
V - профильтрованный объем воды через фильтры, на которых велся учет;
a - число подсчитанных на этих фильтрах колоний в сумме.
1. При посеве 3 фильтров по 100 мл выросло две колонии в 100 мл, на остальных двух фильтрах нет роста. Число общих или термотолерантных колиформных бактерий будет:
| 2 x 100 | = 0,7 КОЕ ОКБ (ТКБ) в 100 мл. |
| 300 |
2. При посеве 10, 40, 100 и 150 мл на фильтрах с профильтрованным объемом 40 мл выросло 4 изолированные колонии, с профильтрованным объемом 100 - 3 ОКБ. Фильтры с объемами 10 мл и 150 мл заросли и учету не подлежат. Суммируют общее число колоний ОКБ (ТКБ) на тех фильтрах, где получены изолированные колонии, и пересчитывают на объем 100 мл.
| (4 + 3) x 100 | = 5 КОЕ в 100 мл. |
| (40 + 100) |
8.2.4.4. Если при выборочной проверке колоний одного типа получены неодинаковые результаты, то вычисляют числа ОКБ или ТКБ среди колоний этого типа по формуле:
X - число подтвержденных бактерий одного типа;
a - общее число колоний этого типа;
b - число проверенных из них;
c - число колоний с положительным результатом.
Полученные результаты учета по каждому типу колоний суммируют и далее подсчитывают по п. п. 8.2.4.3 - 8.2.4.4.
8.2.4.5. Окончательный результат выдают: количество КОЕ ОКБ в 100 мл, из них количество КОЕ ТКБ в 100 мл.
Ориентировочный результат может быть выдан при обнаружении типичных колиформных колоний на среде Эндо, образованных грамотрицательными оксидазоотрицательными бактериями. Окончательный ответ подтверждается по результатам ферментации лактозы.
8.2.4.6. При наложении колоний или сплошном росте на всех фильтрах (п. 8.2.3.5) в случае подтверждения принадлежности к ОКБ и ТКБ выдается качественный результат "обнаружено ОКБ в 100 мл".
Если все колонии на фильтре оксидазоположительные или не подтвердилась их принадлежность к ОКБ и ТКБ, анализ завершается, в протоколе отмечают "зарост фильтров".
Термотолерантные колиформные бактерии – это группа микроорганизмов, ферментирующих лактозу при температуре 45 °C. В состав группы входят представители рода Escherichia, также известного как E.Coli, и отдельные представители Klebsiella, Enterobacter и Citrobacter. ТКБ отличаются простотой выявления при анализе, за счет чего часто используются в виде показателя качества воды и эффективности очистки от фекальных бактерий. Наиболее точным индикатором является E.Coli, поскольку другие термотолерантные микроорганизмы могут происходить от других источников.
ВОЗ рекомендуется проводить анализ воды на точное выявление E.Coli при обнаружении высокого содержания количества термотолерантных бактерий. В частности, это касается случаев, когда возможности осуществления комплексных микробиологических проверок нет, а результат требуется получить срочно.
Особенности ТКБ
Колиформные бактерии живут в пищеварительном тракте, а также отходах жизнедеятельности человека. Это же касается и животных, в частности, скота. Помимо прочего, бактерии можно найти в почве и воде, загрязнение которых впоследствии может приводить к возникновению заболеваний, вызываемых патогенами. Данный вид микроорганизмов относится к классу грамотрицательных бактерий и формой напоминает палочку. Микроорганизмы имеют большое количество разновидностей, однако опасны они для человека в той или иной степени только при превышении допустимой концентрации.
При определении качества воды из того или иного источника следует помнить, что колиформы имеют разное эпидемиологическое и санитарное значение – так, представители рода Escherichia указывают на заражение, которое произошло недавно. Наличие же Citrobacter или Enterobacter означает, что загрязнение произошло в течение последних нескольких недель.
О вреде термотолерантных бактерий
Колиформы могут быть условно-патогенными – среди всех родов таких насчитывается 15 видов. В человеческом организме они проживают в нижних отделах кишечного тракта, оказывая благотворное влияние на микрофлору, помогая усваивать и синтезировать витамины, а также ускоряя разложение белков и углеводов. Патогенными, то есть вызывающими различные заболевания, они могут стать при изменении условий среды. В таком случае может развиться их избыточное размножение.
Происходить это может по разным причинам – например, при снижении иммунитета, гибели нормальной микрофлоры во время приема лекарств или угнетении защитных свойств слизистых. Однако, это далеко не гарантирует появление заболеваний у человека, который пьет воду с содержанием данных микроорганизмов.
Определение термотолерантных колиформов
Так как термотолерантные колиформные бактерии по всем признакам схожи с общими – и это логично, так как они являются их подгруппой, определение ТКБ производится с применением идентичных методов. Приоритетные варианты основаны на способности микроорганизмов ферментировать лактозу в течение 24 часов при условии соблюдения оптимальной температуры. Она составляет 44 °C с погрешностью 0,5 °C.
Как и ОКБ, термотолерантные бактерии относятся к индикаторной группе, используясь для определения уровня загрязненности воды. Однако данная категория микроорганизмов более устойчива к воздействию окружающей среды. По этой причине обнаружение ТКБ указывает на однозначное загрязнение воды продуктами жизнедеятельности человека.
Применение метода мембранных фильтров
Определение колиформных микроорганизмов чаще всего производится с применением метода мембранных фильтров. В рамках данного исследования три образца по 100 мл пропускаются через три бактериальных фильтра из нитроцеллюлозы. Предварительно фильтр помещается в дистиллированную воду и прокипячивается в течение 15-20 минут.
Далее образцы помещаются в среду Эндо и инкубируются в течение 24 ч при температуре 44 °C (для общих бактерий градус должен быть ниже). Если в рамках данного времени был установлен факт развития бактерий, подсчитывается их количество (речь о лактозоположительных колониях), после чего остается идентифицировать их как колиформные бактерии.
Если в течение суток рост колоний не наблюдается или же он имеет место, но колонии относятся к другому типу микроорганизмов, результат считается отрицательным. Положительной реакцией станет наличие лактозоположительных колоний, которые дают отпечаток темно-красного цвета на обратной стороне фильтра, или же лактозоотрицательных, имеющих розовый оттенок. В таком случае производится подсчитывание числа колоний всех установленных типов.
Чтобы определить, к какой категории относятся бактерии, делается их посев, после чего производится инкубирование при температуре 44 °C еще 16-18 часов. Дальнейшие манипуляции осуществляются исключительно с чистыми культурами. В виде подтверждающих тестов задействуется оксидазный, а также тест образования кислоты и газа при ферментации лактозы.
Микробиологический анализ
В некоторых случаях для определения колиформных бактерий может проводиться микробиологический анализ. В зависимости от необходимости и возможностей лаборатории он может быть стандартным, расширенным, или направленным на выявление определенных микроорганизмов. Стандартный анализ затрагивает три показателя – общее микробное число, а также количество ОКБ и ТКБ. Расширенное исследование также направлено на определение титр колифагов и спор сульфитредуцирующих бактерий.
Правильность проведения анализа на ОКБ и ТКБ зависит не только от соблюдения правил во время процедуры, а также применения правильных реагентов и инструментов. Важно также не допустить порчи проб во время их забора – с этим справятся специалисты нашего испытательного центра. С учетом того, что образцы будут действительны в течение всего двух часов, мы обеспечим правильный отбор и быструю доставку с соблюдением правил хранения и транспортировки.
Читайте также: