Особенности культивирования клеток растений и животных

Обновлено: 05.10.2024

Презентация на тему: " Культивирование клеточных культур(растений и животных). Методы, виды и типы сред для культивирования." — Транскрипт:

1 Культивирование клеточных культур(растений и животных). Методы, виды и типы сред для культивирования.

4 Выделение клеток из тканей

5 Основное оборудование для культуральных работ Ламинарный шкаф CO 2 -инкубатор

6 Разновидности клеточных культур В лабораторной практике наиболее распространены раковые клетки. Они не имеют предела числа делений, будучи фактически бессмертными, что позволяет наращивать их в неограниченном количестве. Поскольку при постоянном росте клеток место в чашке Петри (или в объеме культуры) периодически кончается, время от времени их нужно пересевать: откреплять от поверхности, разбивать клеточные скопления с помощью ферментов и ЭДТА (хелатор кальция), а потом заново сеять в меньшей плотности, что позволяет им размножаться дальше. Эта процедура называется пассированием, а возраст культуры часто считают по числу таких пассажей.

9 Наиболее распространенными культурами дифференцированных клеток являются первичные клеточные культуры клетки, выделенные из зрелой ткани и не пассированные in vitro Число делений таких клеток критически зависит от условий культивирования, но редко составляет более 5–10 раз. Исключением являются стволовые, прогениторные и некоторые специализированные клетки, например, активированные Т- и B-лимфоциты. Кроме того, при длительном культивирование первичная культура склонна к замещению фибробластами.

11 Методы трансфекции и трансдукции

12 Схема получения и микрофотография колонии эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) Эмбриональные клетки (~100 шт) получают на 5–9 день после экстракорпорального оплодотворения из внутренней клеточной массы бластоцисты. Эти клетки высаживают на фидер из умерщвленных фибробластов. Примерно через неделю можно обнаружить образованные ими колонии эмбриодные тельца (справа).

13 Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) Клетки взрослого организма получают путем биопсии, после чего их трансфецируют набором транскрипционных факторов (факторов Яманаки) и высаживают на фидер. Для репрограммирования клеток и формирования эмбриодных телец необходимо 16 дней. После этого из ИПСК можно получать клетки заданного типа путем направленной дифференцировки и при необходимости корректировать неисправные гены. Полученные клетки могут быть использованы для введения пациенту с целью восстановления функций ткани.

14 Применение Схема технологического процесса производства вакцин. Для биореактора клетки из флакона сначала размножают, для чего обычно используют роллерные бутыли. С поверхности бутылей клетки в виде суспензии переносят в биореактор, где постоянно перемешивают, в результате чего они формируют клеточные сфероиды. Это позволят более эффективно использовать объем и питательную среду и многократно увеличить концентрацию вируса на литр среды. При достижении максимальной плотности клетки заражают вирусом, после чего они начинают его производить в большом количестве. Вирус собирают из культуральной среды, инактивируют, очищают и в итоге получают готовую вакцину.

15 Биотехнологическое производство белков Аналогично вирусам клетки могут производить и отдельные белки, но, в отличие от вирусов, белки не способны сами себя воспроизводить в клетках. Чтобы клетка начала производить нужный белок в нее необходимо внедрить ген этого белка. В этом заключается суть биотехнологического производства, при котором клетки программируются на генетическом уровне на выработку того или иного белка. Полученные таким образом белки называют рекомбинантными.

16 Схема процесса производства антител гибридомная технология. B-клетки, производящие антитела, получают из селезенки иммунизированных мышей. Далее для наработки антител эти В-клетки необходимо размножить, но поскольку они имеют ограниченную способность к делению, их иммортализуют путем слияния с линией раковых клеток (миеломой). Клетки гибридом рассаживают по лункам планшета с сильным разведением для обеспечения попадания не более одной клетки в лунку. Далее выращивают потомков одной клетки клеточный клон. Антитела, производимые клоном клеток, идентичны и называются моноклональными.

17 Клеточная терапия Схема трансплантации аутологичных (своих) кроветворных СК из костного мозга (КМ) и периферической крови. СК из периферической крови получают после предварительной стимуляции их выхода в кровоток из КМ, вводя препарат рекомбинантного белка (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор). После этого путем афереза из крови отбирают небольшие ядросодержащие клетки. Эта процедура проводится в непрерывном режиме, при котором кровь из одной руки поступает в центрифугу, где расслаивается на фракции. Необходимая фракция отбирается, а остальные возвращаются обратно пациенту в другую руку. СК костного мозга получают из тазобедренных костей, прокалывая их в нескольких местах с помощью специальной иглы. При этом получают в общей сложности около 1 л суспензии. Кроветворные СК выделяют путем иммуномагнитной сепарации по маркеру CD34 или путем культивирования в специальных условиях. После проведения химиотерапии эти клетки вводят в кровоток для восстановления клеток крови.

18 Среды для культивирования клеток Метод культивирования клеток и тканей находит применение в биотехнологии, молекулярной и клеточной биологии, фармацевтике и др. смежных областях. Клетки, ткани или органы выделяются из животных или растений и помещаются в искусственную питательную среду для поддержания роста и/или пролиферации. Основными условиями, необходимыми для оптимального роста клеток являются: контролируемый температурный режим, субстрат для прикрепления клеток (для адгезивных культур клеток), подходящая культуральная среда, СО2-инкубатор для контроля уровня рН, поддержание осмотического давления. Наиболее важным моментом для обеспечения оптимального роста/пролиферации клеток является выбор подходящей культуральной среды. Культуральная среда представляет собой жидкость или гель, разработанная для поддержания роста/пролиферации клеток различного происхождения. Среда для культивирования клеток состоит из определенного соотношения аминокислот, витаминов, солей, глюкозы, гормонов, факторов прикрепления, факторов роста; поддерживает буферную систему и осмотическое давление.

20 Белки и пептиды Наиболее часто используемыми белками и пептидами является альбумин, трансферрин и фибронектин; они особенно важны при бессывороточном культивировании. Альбумин связывает воду, соли, гормоны и витамины и транспортирует их между клетками и тканями. Фибронектин играет ключевую роль в адгезии клеток. Трансферрин – белок-переносчик железа, обеспечивающий железом клеточную мембрану. Жиры и жирные кислоты Особенно важны при бессывороточном культивировании, так как сыворотка обычно содержит их. Витамины Многие витамины необходимы для клеточного роста и пролиферации. В культуральную среду обычно добавляют рибофлавин, тиамин и биотин. Добавки Наиболее важным компонентом культуральной среды является сыворотка; она добавляется перед применением, примерно 5-10 %. Сыворотка представляет собой смесь альбуминов, факторов роста и ингибиторов роста; является источником витаминов, аминокислот, белков, углеводородов, жиров, микроэлементов, факторов роста. Наиболее часто используют бычью и телячью эмбриональную сыворотку. Факторы роста, цитокины, гормоны добавляются в культуральную среду для пролиферации и активации клеток. Антибиотики добавляются для предотвращения контаминации культуральной среды бактериями и грибами; однако антибиотики не предотвращают заражение культуральной среды микоплазмой.

21 Среда MEM (Minimum Essential Medium), или среда Игла была разработана Гари Иглом и является наиболее распространенной средой для культивирования клеток наряду со средой DMEM. Среда МЕМ содержит 13 аминокислот, 6 водорастворимых витаминов, холин и инозит, выполняющие роль углеводородного субстрата. Есть модификации среды МЕМ с солями Эрла и Хэнкса, а также α-модификация среды MEM с содержанием всех 21 аминокислот и солями Эрла. Среда DMEM (Dulbeccos Modified Eagles Medium) является модификацией среды BME (Basal Medium Eagle) и содержит в четыре раза больше аминокислот и витаминов, а также различные добавки, улучшающие рост клеток. Изначально среда DMEM была с содержанием глюкозы 1 г/л и применялась для культивирования эмбриональных клеток мыши. Затем появились модификации среды DMEM (с высоким и пониженным содержанием глюкозы, пирувата натрия, различных добавок) для культивирования клеток различных типов, в том числе нетрансформированных клеток и гибридом. Среда DMEM является наиболее распространенной средой для культивирования клеток наряду со средой MEM. Среда DMEM/F-12 в соотношении 1:1 применяется для выращивания широкого спектра клеточных культур. Изначально среда F12 была разработана для бессывороточного культивирования СНО клеток, клеток легких и мышиных L- клеток. В связи с богатым содержанием питательных веществ в среду DMEM/F12 можно добавлять относительно небольшое количество эмбриональной бычьей сыворотки (FBS–fetal bovine serum), либо использовать без сыворотки, но тогда необходимо добавлять такие факторы, как инсулин, трансферин, эпидермиальный фактор роста и др.. Среда RPMI-1640 была разработана в Roswell Park Memorial Institute (откуда и берет свое название) в 1966 Муром и его коллегами для культивирования лейкоцитов. В настоящее время используется для широкого спектра клеточных культур.


История

В XIX веке английский физиолог С. Рингер разработал солевой раствор, содержащий хлориды натрия, калия, кальция и магния для поддержания биения сердца животных вне организма. В 1885 году Вильгельм Ру установил принцип культивирования тканей, извлек часть костного мозга из куриного эмбриона и держал его в теплом физрастворе в течение нескольких дней. Росс Гранвилл Харрисон, работавший в Медицинской школе Дж. Хопкинса, а затем в Йельском университете, опубликовал результаты своих экспериментов в 1907 −1910 годах, создав методологию культивирования тканей. В 1910 г. Пейтон Раус, работая с культурой клеток саркомы цыплёнка, индуцировал образование опухолей у здоровых животных. Позже это привело к открытию онкогенных вирусов (Нобелевская премия по физиологии или медицине 1966 г.).

Основные принципы культивирования

Выделение клеток

Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами. Клетки могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты. Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов, как коллагеназа, трипсин, проназа, разрушающих внеклеточный матрикс. Кроме того, в питательную среду можно поместить кусочки тканей и материалов.

Культуры клеток, взятых непосредственно от объекта (ex vivo), называются первичными. Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определённого количества делений клетки такие стареют и прекращают делиться, хотя могут при этом сохранить жизнеспособность.

Культивирование клеток

Клетки выращивают в специальных питательных средах, при постоянной температуре. Для культур растительных клеток используется регулируемое освещение, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур. Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста и др. Факторы роста, используемые в питательных средах для клеток млекопитающих, чаще всего добавляют вместе с сывороткой крови. Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. При культивировании одной из важных задач является исключение или сведение к минимуму использование заражённых ингредиентов. Однако на практике это бывает достигнуто не всегда. Наилучшим, но и наиболее дорогостоящим способом является добавление вместо сыворотки очищенных факторов роста.

Клетки можно выращивать в суспензии, либо в адгезивном состоянии. Некоторые клетки (такие, как клетки крови) в естественных условиях существуют во взвешенном состоянии. Существуют также линии клеток, искусственно изменённых таким образом, чтобы они не могли прикрепляться к поверхности; это сделано для того, чтобы увеличить плотность клеток в культуре. Для выращивания адгезивных клеток требуется поверхность, например, культура ткани, или пластик, покрытый элементами внеклеточного матрикса для улучшения адгезивных свойств, а также для стимулирования роста и дифференцировки. Большинство клеток из мягких и твердых тканей адгезивны. Из адгезивного типа культуры выделяются органотипические культуры клеток, которые представляют собой трёхмерную среду, в отличие от обычной лабораторной посуды. Эта система культивирования физически и биохимически наиболее сходна с живыми тканями, но имеет некоторые технические сложности в обслуживании (например, нуждается в диффузии). С целью обеспечения необходимых физических условий для культивирования адгезивных культур и заселения объёма внеклеточного матрикса тканеинженерных конструкций используются системы динамического культивирования на основе роторных и вихревых биореакторов, биореакторов с непосредственным на скаффолд: компрессионных биореакторов, биореакторов с механическим натяжением и гидростатическим давлением, специальных биореакторов для электростимуляции клеток и тканей, а также комбинированных биореакторов.

Перекрёстное загрязнение клеточных линий

При работе с клеточными культурами учёные могут столкнуться с проблемой перекрёстного загрязнения.

Особенности выращивания клеток

При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре, и, как следствие, возникают следующие проблемы:

  • Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных.
  • Накопление в культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность.
  • Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл, рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать (контактное ингибирование роста).
  • По той же причине может начаться клеточное дифференцирование.

Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, пассирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами, или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин, стрептомицин) и противогрибковые препараты (амфотерицин B).

Одним из продуктов метаболизма в клетках являются кислоты, вследствие чего pH среды постепенно снижается. Для контроля кислотности питательных сред, в них добавляют индикаторы pH.

Если культура клеток адгезивная, питательную среду можно полностью заменять.

Пассирование клеток

Пассирование (разделение) клеток — это отбор небольшого количества клеток для выращивания в другом лабораторном сосуде. Если культура быстро растет, это необходимо делать регулярно, поскольку в среде истощаются питательные вещества и накапливаются продукты метаболизма. Суспензивные культуры пассировать проще, так как для этого достаточно всего лишь отобрать необходимое количество клеток, поместить их в другие сосуды, и добавить свежей питательной среды. Адгезивные же клетки перед этим следует отделить от субстрата и разделить их скопления. Чаще всего для этой цели используют смесь трипсина и ЭДТА или другие ферментные смеси, иногда достаточно только ЭДТА в физиологическом растворе (раствор Версена). Если культура растет медленно, её обычно подкармливают без переноса в другой сосуд, периодически (обычно раз в 2-3 дня) отбирая часть использованной среды и добавляя свежую.

Трансфекция и трансдукция

В клетки при их выращивании можно внедрять чужеродную ДНК путём трансфекции (невирусный метод). Часто данную технологию применяют для управляемой экспрессии генов. Сравнительно недавно для этих целей была успешно реализована трансфекция иРНК.

ДНК также может быть внедрена в геном клетки с помощью вирусов или бактериофагов. Они, являясь внутриклеточными паразитами, как нельзя лучше подходят для этих целей, так как внедрение генетического материала в клетку-хозяина является обычной частью их жизненного цикла. Этот метод называется трансдукция.

Линии клеток человека

Гибридома

Использование клеточных культур

Массовое культивирование клеток является основой для промышленного производства вирусных вакцин и разнообразных продуктов биотехнологии.

Продукты биотехнологии

Промышленным методом из культур клеток получают такие продукты, как ферменты, синтетические гормоны, моноклональные антитела, интерлейкины, лимфокины, противоопухолевые препараты. Хотя многие простые белки относительно просто могут быть получены с использованием рДНК в бактериальных культурах, более сложные белки, такие как гликопротеины, в настоящее время могут быть получены только из животных клеток. Одним из таких важнейших белков является гормон эритропоэтин. Стоимость выращивания культур клеток млекопитающих является довольно высокой, поэтому в настоящее время проводятся исследования по возможности производства сложных белков в культурах клеток насекомых или высших растений.

Тканевые культуры

Культивирование клеток является неотъемлемой частью технологии культивирования тканей и тканевой инженерии, поскольку именно оно определяет основы выращивания клеток и поддержания их в жизнеспособном состоянии ex vivo.

Вакцины

С применением методики культивирования клеток в настоящее время выпускаются вакцины против полиомиелита, кори, эпидемического паротита, краснухи, ветрянки. Вследствие угрозы пандемии гриппа, вызываемого штаммом вируса H5N1, в настоящий момент правительство Соединённых Штатов финансирует исследования по получению вакцины против птичьего гриппа с использованием клеточных культур.

Культуры клеток не млекопитающих

Культуры клеток растений

Культуры клеток растений, как правило, выращиваются либо в виде суспензии в жидкой питательной среде, либо в виде каллусной культуры на твердой питательной основе. Культивирование недифференцированных клеток и каллуса требует соблюдения определённого баланса гормонов роста растений ауксинов и цитокининов.

Бактериальные, дрожжевые культуры

Для культивирования небольшого количества клеток бактерий и дрожжей клетки высеивают на твердую питательную среду на основе желатина или агар-агара. Для массового производства применяют выращивание в жидких питательных средах (бульонах).

Вирусные культуры

Культуры вирусов выращивают на культурах клеток млекопитающих, растений, грибов или бактерий, в зависимости от природного хозяина конкретного типа вирусов. Но при некоторых условиях могут быть выращены и в клетках другого типа.

В этом случае культура клеток сама служит средой для роста и репликации вируса.

Виды клеточных линий

Краткий перечень клеточных линий

Приведённый здесь список наиболее распространённых клеточных линий не является полным и исчерпывающим.

Несмотря на успехи, достигнутые в области использования различных микроорганизмов, микробная биотехнология имеет целый ряд существенных недостатков. Прежде всего это невозможность получения целых классов жизненно важных для человека соединений, таких как алкалоиды, стероиды, многие полифенолы и терпеноиды, поскольку в природных сообществах микроорганизмов не найдены продуценты этих веществ. По той же причине ограничены и возможности биотрансформационных процессов с участием микроорганизмов.

Другим объектом биотехнологического производства, помимо одноклеточных микроорганизмов могут выступать специально культивируемые клетки и ткани высших растений и животных. Эта область биотехнологии стала развиваться относительно недавно, последние 30-40 лет. Однако идеи и первые попытки их реализации возникли еще в конце XIX века.

В конце XIX - начале XX в. немецкие ученые X. Фехтинг (1892), С. Рехингер (1893), Дж. Хаберландт (1902) сделали первую неудачную попытку стимуляции роста растительных тканей и органов, помещенных на фильтро­вальную бумагу, пропитанную сахарозой. Несмотря на отсутствие положительного результата, их работы представляют большой инте­рес. В них были высказаны идеи, которые намного опередили раз­витие науки того времени и которые нашли свое подтверждение несколько десятилетий спустя. Так, Фехтинг предположил, что полярность присуща не только организму или органу растения, но и самой клетке. Рехингер определил минимальный размер сег­мента, образующего каллус. Согласно его исследованиям, в кусочках ткани тоньше 1,5-2,0 мм клетки не делились. Хаберланд впервые четко сформулировал идеи о возможности культивирования in vitro изолированных клеток растений и о тотипотентности кле­ток, т. е. способности любой соматической клетки полностью реализовывать свой потенциал развития. Иначе говоря, о способнос­ти каждой растительной клетки давать начало целому организму.

Первые успехи были получены в 1922 г. американским ученым В.Роббинсом и немецким ученым В. Котте. Независимо друг от друга они показали возможность выращивания меристем кончи­ков корней томатов и кукурузы на синтетической питательной среде. Считается, что их работы легли в основу метода культуры изолированных корней растения.

В 1907г. Р.Гаррисон открыл новый путь изучения живой клетки многоклеточных организмов, показав, что клетки зачатка нервной системы зародыша лягушки в капле лимфы остаются живы­ми, дифференцируются, из них вырастают нервные волокна. Этим было положено начало созданию метода культуры животных клеток, который, главным образом благодаря работам Карреля, послужил мощ­ным толчком к дальнейшему развитию цитологии и биотехнологии. Метод культуры клеток используется и развивается в самых раз­личных направлениях. С его помощью был, прежде всего, получен очень важный результат; было доказано, что, подобно бактериям и простейшим, клетки многоклеточных организмов могут развивать­ся в культуре в течение неопределенно долгого времени. Каррелевская культура клеток сердца эмбриона курицы поддерживалась путем пересевов в питательной среде, содержащей эмбриональный экстракт и плазму крови, с 1912 по 1946 г, за что ученый был удостоен Нобелевской премии.

Дальнейшие успехи в разработке метода культур клеток были обуслов-лены, главным образом, созданием и усовершенствованием питательных сред, содержащих необходимые для жизни клеток ве­щества. Настоящее развитие метода культуры тканей и клеток высших растений началось в 1932 г. с работ французского ученого Р. Готре и американского исследователя Ф.Уайта. Они показали, что при периодической пересадке на свежую питательную среду кончики корней могут расти неограниченно долго. Кроме того, ими были разработаны методы культивирования новых объектов: тканей древесных растений камбиального происхождения, каллусных тканей запасающей паренхимы (Р. Готре), а также тканей расти­тельных опухолей (Ф.Уайт). С этого момента начинаются массо­вые исследования по разработке новых питательных сред, вклю­чающих даже такие неконтролируемые компоненты, как березо­вый сок или эндосперм кокоса, и по введению в культуру новых объектов. К 1959г. насчитывалось уже 142 вида высших растений, выращиваемых в стерильной культуре.

В 1955 г. после открытия Ф. Скугом и С. Миллером нового клас­са фитогормонов - цитокининов - оказалось, что при совмест­ном их действии с другим классом фитогормонов - ауксинами - появилась возможность стиму-лировать деление клеток, поддер­живать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез в конт­ролируемых условиях.

Основы использования клеток человека и животных в биотехнологии были заложены в 1949 г, когда группе американских ученых удалось вы­растить вирус полиомиелита в культивируемых клетках кожи и мышц человеческого зародыша. Теперь уже не представляет проб­лемы производство в ферментерах клеточных культур, содержащих вирус. Существуют клетки, которые используют для выращивания: вирусов во всем мире. Это клетки HeLa (карцинома шайки матки человека), BHK-2I (почка эмбрионов хомяка) и Vero (почка зе­леной мартышки). Благодаря применению метода клеточных культур вирусы стали выделять в чистом виде, что позволило усовершен­ствовать методы диагностики вирусных заболеваний и самое главное - получить вакцины, такие, например, как против ящура, оспы, кори, полиомиелита.

Культуры клеток, тканей или органов широко использовались и используются сейчас в научных исследованиях. Они являются методом сохранения жизнеспособности или выращивания вне организма от­дельных клеток, а также организованных структур (ткани, ор­ганы, эмбрионы) сохраняющих свою дифференцировку. С того вре­мени, как ученые нашли способ выделения чистых клеточных ли­ний, метод культуры клеток стал идеальным способом изучения строения и свойств живых клеток. Культуры клеток, получаемые современными методами, представляют собой гомогенные популяции генетически однородных клеток, растущих в постоянных условиях.

Культивируемые клетки дают возможность изучать прижизнен­ное (витальное) состояние клеток методом микроскопии. На жи­вотном или растении можно определить состояние клеток организма только в конце эксперимента, удалив клетки из организма животного. С помощью культур клеток изучают межтканевые и межклеточные взаимодействия, дифференцировку, рост, деление клеток, их вирусную трансформацию, особенности обмена веществ в живых клетках, потребности их в питании, методы клонирования и хранения, чувствительность к различным веществам, в том числе лекарст­вам, ядам. Культуры клеток обеспечивают реальные значения ско­рости включения и метаболизма исследуемых соединений в клетках, поскольку отсутствует метаболизм этих веществ печенью, запаса­ние их в мышцах, экскретирование почками. На клетках культур делают различные операции: удаляют части клетки, вводят в нее вирусы, проводят генетические эксперименты. Органные культуры используются при изучении закономерностей развития зачатков ор­ганов в норме и в эксперименте, при совместном культивировании органов от разных особей одного или нескольких видов, а также для изучения способов сохранения жизнеспособности изолирован­ных органов и тканей, предназначенных для пересадки (трансплан­тации).

Культуры клеток животных и человека могут служить и уже служат идеальным источником различных биологически активных веществ: ферментов, антигенов, онкогенных и моноклональных антител, гор­монов, инсулина, интерферона. Многие из этих препаратов, например, половые гормоны, инсулин, интерферон, антитела, получаемые от животных, или генноинженерными методами из микроорганизмов не обладают достаточной специфичностью или алергенны, поэтому малоэффективны для человека.

Однако попытки получения полезных веществ с помощью культур клеток часто заканчиваются неудачей. Многие клетки животных и особенно человеческие плохо размножают­ся в культуральной среде, а если и растут, то в большинстве случаев теряют способность к синтезу специфического продукта. Поэтому основным направлением исследований в настоящее время является разработка методов культивирования, позволяющих клеткам сохранять и усиливать ценные специфические функции, в течение длительного времени выращивания. Одними из самых эффективных методов получения стабильных, долго живущих и относительно неприхотливых к условиям культивироввания клеточных культур является их трансформация (обработка некоторыми химическими реактивами или инфицирование их онковирусами) или получение гибридных клеток (гибридом) путем слияния их с некоторыми опухолевыми клетками.

В отличие от вышесказанного, промышленная реализация возможностей культивирования клеток и тканей растений достигла в настоящее время гораздо больших результатов. Во многих странах запущены промышленные производства лекарственных веществ, красителей, витаминов, основанные на различных способах культивирования растительных клеток. Начало было положено японскими фирмами, запустивших в начале 80-х годов ХХ века промышленное производство красителя шиконина и убихинона-10. В СССР было налажено промышленное производство биомассы клеток женьшеня.

Использование культур клеток и тканей как источника сырья для производства различных первичных и вторичных метаболитов имеет целый ряд преимуществ, по сравнению с традиционно используемыми источниками (дикие и культурные растения и животные, живые люди-доноры и органы, извлекаемые из трупов).

1.Возможность круглогодичного выращивания необходимого количества биомассы клеток и тканей.

2.Независимость от климатических и географических факторов.

3. Быстрота накопления целевого продукта (многие растения и животные растут и развиваются в течение десятков лет (женьшень)).

4. Стандартность и более высокое качество сырья.

5. Освобождение земельных площадей, техники и людей, занятых в сельском хозяйстве.

6. Возможность автоматизации и механизации технологических процессов, снижение доли ручного труда.

7. Освобождение страны от импорта сырья.

8. Сохранение редких и исчезающих видов животных и растений, улучшение экологической обстановки.

Существует 3 основных направления создания новых технологий на основе культивируемых клеток и тканей растений. Первое из них – использование результатов исследования биологии растительной клетки и методов клеточной и генной инженерии для генетического изменения клетки и получения на ее основе нового растения. Второе – получение ценных биологически активных веществ растительного происхождения в промышленных масштабах путем культивирования клеток и тканей растений. Третье –использование культур клеток и тканей для быстрого микроклонального размножения и оздоровления растений.

Животные клетки используются для культивирования вирусов, при производстве вакцин, для получения интерферона и т.д.

Суспензию отдельных клеток получают обработкой размельченной ткани эмбриона пищеварительным ферментом трипсином. Если клеткам в такой суспензии дать осесть на плоскую поверхность в сосуде с питательной средой, то клетки становятся плоскими и делятся, образуя монослой. В обычной методике культивирования пользуются цилиндрическими бутылями, которые медленно вращаются вокруг своей длинной оси. Рост клеток и выход биомассы можно увеличить, добавив к суспензии носитель – микроскопические гранулы из инертного синтетического полимера, на которых клетки закрепляются. Деление клеток млекопитающих происходит примерно раз в сутки (для сравнения – клетки дрожжей делятся каждые 1,5-2 ч, а бактериальные клетки – каждые 20-60 мин). Клетки млекопитающих нуждаются в многочисленных питательных веществах, поэтому в питательную среду следует добавлять смесь аминокислот, пуринов и пиримидинов для синтеза белков и нуклеиновых кислот, глюкозу в качестве источника углерода и энергии, витамины и минеральные соли для поддержания необходимого осмотического давления и значения рН, близкого к 7,2. Среда также должна содержать небольшие концентрации антибиотиков для подавления роста бактерий и 5-20 % сыворотки (из крови человека или из плода крупного рогатого скота). Для оптимального роста температуру культуры необходимо поддерживать около 37 ºС, так как ниже 36 ºС клетки либо делятся крайне медленно, либо не делятся вовсе; при температуре выше 38 ºС погибают. Большинство культур клеток млекопитающих, в том числе и клеток человека, удается сохранять неопределенно долгое время замороженными в специальной среде при - 180 ºС.

Особенности культивирования растительных клеток

Культивирование растительных клеток в крупных масштабах было освоено в 1976 г. японскими исследователями, которым удалось получить растительную биомассу в объеме 20 м 3 . Получение массы растительных клеток обходится намного дороже, чем равное количество бактериальных или дрожжевых клеток. Поэтому ученые стараются избежать разрушения клеток с целью извлечения из них полезных для человека соединений. В связи с этим, растительные клетки иммобилизуют внутри пористых полимеров. Доказано, что в таком состоянии клетки удается поддержать жизнеспособными в течение нескольких сотен дней. Проблемой остается извлечение метаболитов в том случае, когда они синтезируются внутри клеток, а не выделяются в среду.

Культуры растительных клеток применяют для синтеза различных веществ: алкалоидов и других вторичных метаболитов, фитогормонов (регуляторов роста растений) и т.д.

Использование растительных клеток является перспективным направлением биотехнологии, так как клетки, растущие в культуре, способны синтезировать вещества, которые не обнаруживаются в целом растении.

Процессы биотехнологических производств разнообразны, но все они имеют пять общих основных стадий, которые могут различаться в зависимости от целевого продукта и способа его получения. Основные стадии следующие: приготовление питательной среды; получение посевного материала; культивирование микроорганизмов; выделение целевого продукта; очистка целевого продукта. Общая биотехнологическая схема производства продуктов микробного синтеза приведена на рис.3.

6. Приготовление питательной среды

Задача специалиста, оптимизирующего состав среды для конкретного вида микроорганизма, - выбрать такие источники углерода, азота, фосфора и других веществ, которые наиболее оправданы в экономическом и экологическом отношениях.

Принцип составления питательных сред. Каждый конкретный вид микроорганизмов, используемых в биотехнологии, строго избирателен к питательным веществам. Потребность микроорганизма в тех или иных соединениях определяется физиологическими особенностями данного вида микроба, но во всех случаях среда должна быть водным раствором этих веществ и обеспечивать в определенном количестве их приток в клетку.

В самом приближенном виде физиологические потребности микроорганизма в питательных веществах можно выявить, определив химический состав микробной клетки. Однако в этом случае не учитываются количество и состав метаболитов, удаленных клеткой во внешнюю среду, и то обстоятельство, что состав клеточного вещества микроорганизма зависит от состава среды обитания и варьирует в достаточно широких пределах. Но все же, первоначальную ориентировку в выборе оптимального состава питательной среды, исходя из состава клеточного вещества микроба, сделать можно.

Важнейшим условием приготовления питательных сред является соблюдение правил асептики. Для обеззараживания питательных сред применяют, как известно, химическое воздействие (дезинфекцию), воздействие температуры и других физических факторов (ультразвука, ультрафиолетовых лучей, ультрафильтрации). Каждый из этих методов весьма избирателен. В биотехнологии широко применяют термические методы обеззараживания питательных сред (автоклавирование, стерилизацию, кипячение и др.). Споры микроорганизмов более устойчивы к высокой температуре, поэтому именно споры бактерий являются лимитирующим фактором, определяющим температурные режимы стерилизации сред.

Для стерилизации воздуха в случае аэробных процессов культивирования используют фильтрование и ультрафиолетовое облучение.


Получение посевного материала

Поддержание чистой культуры штамма-продуцента - ключевая задача любого биотехнологического производства. Культуры микроорганизмов-продуцентов заводы получают из коллекций в пробирках на агаризованных питательных средах или в ампулах. Чистая культура микроорганизма может постоянно или по мере необходимости использоваться в производстве. При длительном хранении чистых культур могут происходить случайные нерегулируемые мутации. Для избежания мутаций следует не только соблюдать правила хранения и поддержания исходной культуры, но и периодически проводить пересев культуры и проверку ее однородности как по морфологическим, так и по физиологическим признакам.

Посевным материалом (инокулятом) называют чистую культуру микроорганизма, которую получают путем ее последовательного пересева из пробирки в колбу, а затем в аппараты увеличивающегося объема до количества, необходимого для промышленного производства. Сначала чистую культуру размножают в лаборатории, затем в цехе чистых культур и инокуляции, далее направляют на культивирование. Приготовление посевного материала состоит из следующих стадий:

1. Получение культуры микроорганизма в микробиологической лаборатории завода.

2. Выращивание микроорганизмов в малом посевном аппарате.

3. Выращивание микроорганизмов в большом посевном аппарате.

4. Накопление культуры микроорганизмов в малом ферментере.

Передачу чистых культур из одного аппарата в другой осуществляют в конце логарифмической фазы роста. Качество полученного посевного материала контролируют путем микроскопирования.

В биотехнологии широко применяются плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты (грамположительные бактерии, не образующие спор), бактерии и водоросли в виде чистых и смешанных культур. В традиционных процессах ферментации предпочтение обычно отдается смешанным культурам, а в большинстве современных ферментационных процессов – монокультурам (чистым культурам), выращиваемых в асептических условиях. Большинство используемых сегодня культур получено из природных источников, однако затем эти культуры были улучшены или путем выращивания в условиях, характерных для данного процесса (для повышения выхода биомассы и первичных метаболитов), или с помощью мутагенеза или генетической инженерии (для производства вторичных метаболитов).

Ферментация (культивирование)

Это самый важный и продолжительный этап биотехнологического производства. Ферментация представляет собой совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и термостатированную питательную среду посевного материала до завершения процессов роста и биосинтеза вследствие исчерпывания питательных веществ среды. Существует два основных типа ферментаций: получение биомассы микроорганизмов и получение ценных веществ (метаболитов), возникающих в ходе роста или на последующих стадиях развития культуры.

Как говорилось ранее (п.1), для выращивания любой культуры необходимы: жизнеспособный посевной материал; источники энергии и углерода; питательные вещества для синтеза биомассы; отсутствие ингибиторов роста; соответствующие физико-химические условия.

На оптимальной питательной среде при благоприятных значениях рН и температуры, при условии подачи требуемого количества воздуха в среду микроорганизмы быстро начинают расти и размножаться, обеспечивая накопление биомассы продуцента и биологически ценных метаболитов в культуральной жидкости. Способы ферментации мы рассматривали ранее в разделе 4.

Для культивирования микроорганизмов в промышленных масштабах применяют ферментеры (или ферментаторы) – реакционные емкости, в которых при определенных условиях находятся микроорганизмы. Основное назначение ферментатора – своевременно обеспечить микробные клетки необходимыми питательными веществами и кислородом (при необходимости) и отвести продукты обмена веществ, создать однородный состав среды при условии слабого потока культуральной жидкости (при непрерывном культивировании). Для поддержания кислородного режима ферментатор снабжается устройством подвода воздуха, для лучшего перемешивания среды – мешалками различной конструкции. Для поддержания температуры среды предусмотрены системы охлаждения.

Читайте также: