Первичный посев и пересев

Обновлено: 05.10.2024

3) при выделении чистой культуры микробов в целях всестороннего изучения их свойств и определения видовой принадлежности и т.д.

Основным методом бактериологического исследования является посев анализируемого материала на питательные среды.

Посевом в микробиологической практике называется внесение в стерильную питательную среду какого-либо исследуемого материала для обнаружения в нем микроорганизмов.

Пересев - это перенос выращенных микроорганизмов в свежую стерильную питательную среду. При выполнении этих приемов требуется перенести тот или иной материал в питательную среду так, чтобы в нее из воздуха не попали посторонние микроорганизмы.

При посевах и пересевах с одной питательной среды на другую пользуются платиновой проволокой в виде петли или иглы, так как они допускают быструю стерилизацию на огне без повреждения металла. Платиновая проволочка накаливается очень быстро и так же быстро остывает. Над пламенем горелки иглу или петлю следует держать вертикально, чтобы проволока на всем протяжении была одновременно накалена докрасна. Затем слегка обжигают прилегающий к проволоке отрезок стеклянной или металлической палочки, в которую впаяна или заделана проволочка. Нужно строго следить за тем, чтобы до внесения в огонь стеклянная палочка была совершенно сухая, в противном случае стекло треснет и петля (или игла) из него выпадет. После нагревания до красного каления платиновая проволочка будет простерилизована. Лишь после такой стерилизации петлю или иглу можно вносить в пробирку с бактериальной культурой. Но прежде чем захватить ею бактериальную культуру, петелькой или концом иглы касаются части среды, свободной от микробного налета (если имеют дело с твердой средой), или внутренней стенки пробирки с жидкой средой. Это делается для того, чтобы удостовериться, что прокаленная петля достаточно остыла. Если проволочка имеет еще высокую температуру, то среда на данном участке расплавляется или кипит. Этим создается гарантия, что бактерии, снятые проволочкой, будут вполне жизнеспособны.

Посев на жидкую питательную среду (бульон)

Посев на жидкую питательную среду производится с помощью петли и стерильных трубок и пипеток.

Посев петлей (иглой). Прокаленной петлей или иглой, которую держат в руке между указательным, средним и большим пальцами (подобно карандашу или ручке), захватывают небольшое количество налета с поверхности сырья или каплю посевного материала из исследуемой жидкости, слегка погрузив в нее петлю. В левой руке держат пробирку (или колбочку) с питательной средой. На пламени горелки обжигают верхнюю часть пробирки (колбы) непосредственно у пробки. При этом сосуд со средой слегка наклоняют, но так, чтобы жидкость не выливалась и не смачивала пробки и краев посуды. Мизинцем и безымянным пальцем правой руки вынимают пробку из пробирки и зажимают ее до конца посева между этими пальцами и ладонью так, чтобы входящая в пробирку часть пробки не прикасалась к руке. Все манипуляции производят над пламенем горелки. В открытую и наклоненную пробирку вводят петлю с посевным материалом, слегка погружая петельку в среду и размазывая внесенный материал по стенке пробирки, осторожно размешивают петлей питательную среду. Закончив посев, не изменяя наклонного положения пробирки, закрывают ее ватной пробкой, обжигая в пламени горелки конец пробирки и ту часть ватной пробки, которая входит в пробирку. Лишь после этого возвращают пробирку в вертикальное положение. По окончании посева петлю немедленно стерилизуют в пламени горелки.

Техника посева петлей бактериологического материала из одной пробирки в другую почти аналогична. Обе пробирки - с культурой и стерильной питательной средой - держат в наклонном положении между большим и остальными пальцами левой руки (рис. 56, положение а). При этом пробирку с культурой микробов следует держать ближе к себе. Вся работа, как и в первом случае, выполняется под защитой пламени горелки, а наклонное положение пробирок предохраняет питательную среду от оседания в нее микроорганизмов из воздуха.

Петлю держат между указательным и большим пальцами правой руки, а свободными пальцами извлекают из пробирок пробки, предварительно внеся их на несколько секунд в пламя горелки (положение б). Извлекать ватные пробки нужно плавно, не рывком, а легким винтообразным движением.

Прокалив на огне петлю и подвергнув легкому обжигу верхние концы пробирок, вводят внутрь пробирки с культурой петлю, забирают петлей ничтожную часть бактериального материала (положение в) и переносят его во вторую пробирку со стерильной средой (положение г). Когда посев закончен, края пробирок и нижние концы ватных пробок проводят сквозь пламя горелки и легким движением закрывают пробирки пробками (положение д). Петля стерилизуется и откладывается (положение е). Работать нужно быстро, но избегая резких движений, вызывающих усиленное движение воздуха.

Посев на плотную среду

Посев уколом делают в желатиновые среды с целью выявления протеолитической способности микробов. Засеянные пробирки выдерживают 2-3 дня при температуре 22-23 °С, наблюдая за быстротой и формой разжижения столбика желатиновой среды. У различных видов микробов форма разжижения желатины различна: послойная, в форме гвоздя, чулка и пр. Затем пробирки опускают в холодную воду. Если среда в пробирке с микроорганизмом остается жидкой, а среда в контрольной пробирке застынет, это значит, что микроб обладает протеолитической способностью.

Можно установить протеолитическую способность микроба, фиксируя также образующиеся при распаде белка продукты - сероводород, аммиак, индол, являющиеся показателями протекающего процесса гниения. Наличие этих продуктов определяют с помощью цветных реакций. Сероводород дает почернение полоски фильтровальной бумаги, смоченной раствором основного уксуснокислого свинца, благодаря превращению H2S в PbS. Появление серебристой побежалости (оттенка) свидетельствует об образовании при гниении тиоспиртов и меркаптанов.

Раствор основного уксуснокислого свинца готовят приливанием к 10%-ной взвеси РЬ(СН3СОО)2 10%-ного раствора едкого натра до растворения осадка. Полоски фильтровальной бумаги пропитывают этим раствором, высушивают при комнатной температуре и хранят в склянке с притертой пробкой. При проведении опыта подготовленную полоску фильтровальной бумаги смачивают стерильной дистиллированной водой и помещают в пробирку с изучаемой культурой между ватной пробкой и стенками пробирки. Полоска бумаги должна свободно свешиваться внутрь пробирки, а не касаться ни ее стенок, ни среды. Пробку сверху плотно закрывают целлофановым колпачком (можно надеть резиновую соску), что предотвращает улетучивание выделяющихся при гниении газов.

Для выявления в продуктах гниения аммиака в пробирку с культурой микроорганизма аналогично помещают влажную красную лакмусовую бумажку, синеющую от присутствия NH3.

Индолообразование выявляется добавлением к 5 мл бульонной культуры микроба 5 мл специфического раствора Эрлиха и 2,5 мл насыщенного раствора пиросульфита калия (K2S2O7). При наличии индола появляется интенсивное красное окрашивание. Реактив Эрлиха приготовляют растворяя 4 г парадиметиламидобензальдегида в 30 мл 96%-ного спирта-ректификата, приливая затем сюда же 80 мл концентрированной соляной кислоты.

Посев уколом в высокий столбик сахарного агара дает возможность выявить у микроорганизмов степень анаэробности. Аэробы растут только в верхней части укола; анаэробы, наоборот, - только в нижней; факультативные анаэробы - по всему уколу. Укол должен проходить по возможности посредине столбика среды в пробирке на равном расстоянии от краев и доходить почти до дна. Внесение материала в толщу питательной среды можно также производить после предварительного ее расплавления и вносить материал в остуженную до 45 °С, но еще жидкую среду, а затем дать ей остыть.

Техника посева в чашки Петри

Питательный агар в колбах, флаконах, пробирках расплавляют в кипящей водяной бане. Сосуд со средой следует погружать в баню так, чтобы уровни среды и воды совпадали или уровень среды был чуть ниже уровня воды в бане. Затем среде дают несколько остыть - до 50-60 °С и разливают ее в стерильные чашки Петри, установив их на горизонтальной поверхности. Техника розлива среды в чашки Петри следующая (рис. 58). Над пламенем горелки, слегка наклоняя сосуд, содержащий расплавленный агар, вынимают пробку и края сосуда обжигают. Левой рукой приподнимают с одной стороны крышку чашки и, вводя в образовавшийся просвет открытый конец сосуда со средой, выливают среду в чашку. Совсем открывать чашку Петри нельзя. Ее лишь слегка приоткрывают с одной стороны. Это предохраняет среду от оседания в нее микробов из воздуха.

Опустив крышку и наклоняя чашку в разные стороны, распределяют налитый в нее агар ровным слоем по всему дну. Когда агар застынет, чашки ставят в термостат вверх дном для подсушивания и удаления конденсационной воды. Посев на агаровые среды в чашки Петри производится штрихом при помощи платиновой петли или стеклянным шпателем.

При посеве штрихом платиновой петлей забирают небольшое количество материала и легко проводят по поверхности агара, нанося ряд линий. При этом один край крышки чашки Петри следует лишь осторожно приподнять левой рукой, не дотрагиваясь пальцами до нижнего ранта. Закрыв первую чашку Петри той же петлей, не набирая материала, наносят штрихи на поверхность агара во второй, затем в третьей чашке с соблюдением тех же предосторожностей, предупреждающих попадание микробов из воздуха на поверхность среды.

После посева чашки ставят в термостат вверх дном на 24 ч и по истечении указанного срока рассматривают выросшие колонии микроорганизмов. В первой чашке, куда попало много материала, может получиться сплошной рост, во второй и третьей чашках вырастут единичные изолированные колонии. Каждая колония представляет собой обособленное скопление однородных микробов.

При посеве на твердую среду можно пользоваться и одной чашкой Петри, разделив ее на несколько секторов. Для этого на стекле с нижней стороны дна чашки наносят линии карандашом для стекла. Каждый отдельный сектор в данном случае будет заменять соответствующую чашку Петри.

При посеве шпателем на поверхность агаровой среды наносят платиновой петлей одну небольшую каплю исследуемого материала. Затем прокаленным и остуженным шпателем растирают эту каплю по всей поверхности среды, совершая легкие зигзагообразные движения во все стороны. Этим же шпателем засевают вторую и третью чашки.

Посев жидких материалов на твердую среду в чашки Петри пипеткой. Определенный объем исследуемой жидкости (обычно 1 или 0,1 мл) вносят в стерильную чашку. Затем в эту же чашку вливают расплавленный и остуженный до температуры 45 °С мясопептонный агар и плавными движениями чашки на горизонтальной плоскости тщательно перемешивают среду с исследуемой жидкостью. После застывания агара чашку Петри, как обычно, перевертывают вверх дном и ставят в термостат. Выращивание микробов производят 24-48 ч при температуре, оптимальной для изучаемого вида микроорганизмов, чистую культуру которых выделяют.

Каждая микробная клетка, а также спора, попавшая в питательную среду из посевного материала, при застывании среды оказывается закрепленной на одном месте, начинает развиваться и дает колонию. Чем меньше колоний выросло на чашке и чем изолированнее одна от другой эти колонии, тем успешнее можно выделить чистую культуру микроба. Поэтому при посевах желательно брать посевной материал, содержащий как можно меньше микроорганизмов. С этой целью производят разбавление (разведение) материала.

Для разведения исследуемых материалов необходимо иметь достаточное количество стерильных пипеток емкостью 1 мл и стерильную воду в пробирках по 9 мл.

Техника разведения следующая (рис. 59). После тщательного перемешивания исследуемой пробы стерильной пипеткой отбирают 1 мл материала и вносят в пробирку с 9 мл стерильной воды. Работу проводят над пламенем горелки с соблюдением правил стерильности. Получают первое разведение в 10 раз. Осторожно перемешивают содержимое пробирки. Перемешивание можно произвести повторным всасыванием жидкости в пипетку и выпусканием ее обратно в пробирку. Из пробирки с первым разведением второй стерильной пипеткой переносят 1 мл в следующую пробирку, содержащую 9 мл стерильной воды. Получают второе разведение (в 100 раз). Эту операцию при необходимости производят и дальше, получая третье, четвертое, пятое разведения. Производить разведение более чем в 100 000 раз (пятое разведение) не рекомендуется, так как при слишком больших разведениях изучаемые микробы могут не попасть в отбираемую пробу, особенно в том случае, если количество их составляло относительно небольшой процент по отношению ко всей микрофлоре субстрата.

Выделение чистых культур аэробных микроорганизмов

Из каждого разведения 1 мл жидкости высевают в стерильную чашку Петри, заливая 10-15 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С мясопептонного агара. Посев выращивают в термостате при температуре, оптимальной для изучаемых микроорганизмов, в течение 24-48 ч. Просматривая чашки Петри после выращивания, отбирают ту чашку, в которой выросшие колонии оказываются наиболее изолированными.

Однородность по внешнему виду выросших на чашке колоний свидетельствует о том, что посевной материал содержал микроорганизмы одного вида. Если же колонии оказываются неоднородными, то, следовательно, в посевном материале находилась смесь разнообразных микробов. Все выросшие колонии в этом случае нужно разбить на группы по однородности и изучать каждую группу однородных колоний в отдельности.

Из однородных колоний в чашке Петри выбирают одну изолированную колонию, из нее делают мазок и устанавливают чистоту культуры. Об этом будет свидетельствовать морфологическая однородность микробных клеток, наблюдаемых в поле зрения микроскопа. Оставшуюся часть колонии прокаленной и остуженной петлей с соблюдением правил стерильности пересевают (отвивают) на поверхность скошенного агара. Выросшая на косом агаре культура также должна давать однородный рост и при микроскопировании однородные клетки. В противном случае пересевы колоний с чашек Петри повторяют до тех пор, пока не убедятся в чистоте выделенной культуры.

Выделение чистых культур анаэробных микроорганизмов

Одним из основных условий при культивировании анаэробных микробов является удаление из питательной среды молекулярного кислорода, оказывающего токсическое действие на анаэробные культуры. Вторым обязательным условием, обеспечивающим выделение анаэробов из исследуемого субстрата, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду.

Изолированные колонии анаэробных микробов можно получить в глубине плотной питательной среды - в трубках Вейона. Средой накопления для анаэробов является среда Китта-Тароцци. Уже указывалось, что для создания анаэробных условий при приготовлении среды Китта-Тароцци на дно пробирок помещают кусочки печени. Можно использовать и круто сваренный белок куриного яйца.

Анаэробные микроорганизмы являются спорообразующими, поэтому при исследовании материалов, где предполагается наличие вегетативных форм, необходимо засеянные пробирки прогреть в водяной бане при 80 °С в течение 30 мин.

Посевы выдерживают в термостате при 37 °С в течение 5 суток. При наличии роста отмечают наступившее в среде Китта-Тароцци изменение: помутнение или помутнение и газообразование; из проросших пробирок делают мазки и окрашивают по Граму. Материал для мазков берут пастеровской пипеткой, которую опускают до дна пробирки.

Высев из среды Китта-Тароцци можно производить и в чашки Петри, применяя метод последовательного разведения. В этом случае посевы необходимо выдерживать в анаэростатах или эксикаторах, на дно которых помещаются кислородпоглощающие вещества (смесь гидросульфита натрия с двууглекислой содой или щелочной раствор пирогаллола).

Посевом в микробиологической практике называется заражение стерильной питательной среды каким-либо исследуемым материалом (вода, пищевые продукты и т.д.) для выявления микроорганизмов. Пересев – это перенос выращенных микроорганизмов в свежую стерильную питательную среду.

В микробиологической практике используются следующие основные способы посевов (пересевов) микроорганизмов:

а) штрихом – осуществляется бактериологической петлей из пробирки в

пробирку или в чашку Петри;

б) уколом – проводится бактериологической иглой из пробирки в пробирку;

в) газоном – осуществляется шпателем Дригальского в чашке Петри;

При посевах (пересевах) культуры необходимо соблюдать стерильность, т.е. предотвращать возможность загрязнения исследуемого материала и питательных сред посторонними микроорганизмами.

4.3.1 Посев штрихом (уколом) из пробирки в пробирку

Техника посева по этапам показана на рис. 3.

а) зажечь спиртовку;

б) взять в левую руку две пробирки: одну, из которой будет проводиться пересев, и другую со свежей питательной средой (ближе к себе), (см. рис.3,а);

Рисунок 3 - Посев из пробирки в пробирку

в) прокалить бактериологическую петлю (иглу) в пламени (см. рис.3,а);

г) открыть пробирки, захватив одновременно обе ватные пробки мизинцем правой руки (см. рис.3,б);

д) обжечь края обеих пробирок (см. рис.3,б);

е) внести петлю в пробирку с микроорганизмами и, захватив немного микробной взвеси, перенести ее, не касаясь стенок пробирки, в пробирку со свежей питательной средой (см. рис.3, в,г), т.е произвести посев культуры.

Посев штрихом осуществляется на скошенный агар (агар-косячкок) – петлю осторожно вводят в пробирку до границы конденсационной воды и зигзагообразными движениями распределяют материал по поверхности агара снизу вверх.

Посев уколом осуществляется в агаровый столбик – среду прокалывают бактериологической иглой до дна пробирки.

Посев на жидкие среды – материал, взятый петлей, наносят на стенку пробирки у верхнего уровня среды, и слегка встряхивая пробирку, смывают его средой.

ж) обжечь обе пробирки и края пробирок и одновременно в пламени закрыть обе пробирки (см. рис. 3,д);

з) обжечь петлю в пламени (см. рис. 3,е).

Посев суспензии микроорганизмов можно производить с помощью пипетки. Для этого профламбированной пипеткой набирают жидкость, выпускают ее содержимое (при количественном посеве – определенный объем) в свежую питательную среду. После посева использованную пипетку опускают в сосуд с дезинфицирующим раствором.

4.3.2 Посев газоном

Посев газоном используется для изучения поверхностного роста культур. Исследуемый материал наносят петлей или пипеткой на поверхность застывшей питательной среды в чашке Петри и затем равномерно распределяют его по поверхности, пользуясь предварительно простерилизованным шпателем Дригальского.

Левой рукой слегка приподнимают крышку чашки Петри, стоящей на поверхности стола, а правой - вносят в чашку шпатель. Круговыми движениями шпателя распределяют культуру по всей поверхности плотной питательной среды.

4.3.3 Посев розливкой

Посев розливкой используют в случае необходимости вырастить микроорганизмы в толще среды (глубинный посев). Глубинный посев можно осуществить двумя способами:

1) Культуру микроорганизмов вносят в пробирки с расплавленной и охлажденной до 40-50 о С плотной питательной средой, а затем выливают эту смесь в чашки Петри;

2) Взвесь микроорганизмов вносят бактериологической петлей или пипеткой непосредственно на дно стерильной чашки Петри, слегка приоткрыв крышку, а затем заливают ее расплавленной и охлажденной до 40-50 о С плотной питательной средой. Среду с культурой тщательно перемешивают круговыми движениями чашки, не поднимая ее с поверхности стола. После этого чашку оставляют на столе до застывания агара.

Посев на жидкую питательную среду. Пробирку с исследуемым материалом и пробирку с питательной средой держат слегка наклонно в левой руке между большим и указательным пальцами так, чтобы края пробирок были на одном уровне (пробирка с исследуемым материалом должна быть первой по отношению к работающему). В правую руку берут бактериологическую петлю (иглу или пипетку) как писчее перо. Пробки от пробирок прижимают мизинцем к ладонной поверхности правой кисти, в зоне пламени горелки пробирки открывают, края пробирок обжигают. Петлю вертикально прокаливают в пламени горелки. Простерилизованную петлю (иглу, пипетку) вводят через пламя горелки в пробирку с посевным материалом. Петлю охлаждают, забирают небольшое количество материала, переносят в пробирку со стерильной питательной средой. Материал стряхивают в среду или, слегка погружая в жидкость петлю, растирают посевной материал по стенке пробирки не касаясь среды держателем, после чего смывают его средой. Края пробирок и пробки вновь проводят над пламенем горелки, закрывают пробирки пробками, стерилизуют петлю и ставят ее в штатив или стакан. При посеве материала с помощью пипетки использованную пипетку опускают вниз концом в банку с дезинфицирующим раствором.

Посев на плотную питательную среду. Посевы выполняют разными способами. Эти способы основаны на том, что микроорганизмы иммобилизуются на поверхности или в глубине питательной среды.

Посев в пробирку. Материал, забранный петлей, опускают до дна пробирки со скошенным агаром, погружают в конденсационную жидкость и зигзагообразными движением петли проводят снизу вверх, слегка касаясь поверхности среды (посев штрихом). При посеве материала уколом в столбик среды, петлей с материалом или иглой прокалывают вертикально центру пробирки питательную среду, петлю или иглу вынимают, прожигают. (Правила работы с пробирками и петлей при посеве в пробирку с плотной средой аналогичны правилам при посеве на жидкие питательные среды).

Посев на чашку Петри. Чашку берут в левую руку, большим пальцем левой руки слег приподнимают крышку, чтобы в образовавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель, обжигают на пламени горелки края чашки в зоне щели, вносят посевной материал на поверхность питательной среды, затем растирают его при помощи стеклянного шпателя или бактериологической петли.

1. Посев штрихом. Посевной материал втирают петлей в поверхность среды у края чаш избыток снимают, проколов агар. Оставшийся материал растирают параллельными штрихами по поверхности среды.

2. Посев петлей на секторы: дно чашки расчерчивают на секторы, посев производят зигзагообразными движениями от края чашки к центру так, чтобы штрихи с одного сектора не переходили на другой.

3. Дробный посев: бактериологической петлей с посевным материалом несколько раз делают параллельные штрихи в одном секторе чашки Петри, петлю прожигают в пламени горелки, дают остыть и часть материала из первого сектора (А) распределяют во втором секторе (В) аналогичным способом, затем в третьем (С) и четвертом (Д) секторах.

Посев шпателем. Материал наносят на поверхность среды петлей или пипеткой, затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают по всей поверхности агара, вращая полуоткрытую чашку. После посева стеклянный шпатель помещают в дезинфицирующий раствор, металлический — прокаливают в пламени горелки.

Посев тампоном. Тампон с исследуемым материалом вносят в чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, одновременно вращая тампон и чашку.

Посев газоном. 1 мл исследуемого материала (жидкая бульонная культура или взвесь микробов в физиологическом растворе) наносят пипеткой на поверхность среды и тщательно распределяют жидкость по всей поверхности чашки. Избыток материала отсасывают пипеткой и вместе с ней помещают в дезинфицирующий раствор.

Посев уколом. Посев уколом в агар столбиком (прямой агар) применяется для выращивания анаэробов или выявления характерного признака микроба, так как рост по уколу типичен для ряда бактерий. Посев уколом в полужидкий агар практикуется также с целью длительного хранения культур. При посеве уколом в столбик желатина наблюдается разжижение ее бактериями, обладающими протеолитическим ферментом. Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку, как обычно, вынимают пробку и обжигают край пробирки, и в центре столбика питательной среды сверху вниз почти до самого дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней материалом.

Микроорганизмы в лабораторных условиях выращивают обычно в пробирках, чашках Петри, на жидких или плотных питательных средах.

При пересеве микроорганизмов с одной среды на другую или при извлечении части клеток для приготовления микропрепарата необходимо строго соблюдать условия, которые позволили бы предохранить культуру от загрязнения другими микроорганизмами, а также персонал от инфицирования микроорганизмами, находящимися в исследуемом материале.

Для приготовления препарата микроорганизмов, выращенных на поверхности плотной питательной среды, или для пересева культуры с одной среды на другую пользуются бактериологической петлей.

Петля представляет собой тонкую проволоку из платины или нихрома, прикрепленную к держателю из металла. Конец проволоки загибают в виде кольца диаметром около 2 мм, которым и захватывают небольшое количество микробной массы.

Но прежде, чем такая петля будет введена в пробирку, колбу или чашку Петри с культурой, ее необходимо простерилизовать, т.е уничтожить имеющиеся на ней микроорганизмы. Стерилизацию бактериологической петли проводят в пламени горелки так, чтобы проволока была равномерно раскалена на всем протяжении. Лишь после такой стерилизиции петлю можно вводить в пробирку с культурой микроорганизмов.

Прикосновение к культуре слишком горячей петли может повредить клетки, поэтому петлю следует предварительно остудить, прикоснувшись ею к внутренней поверхности пробирки или к питательной среде, свободной от микробных клеток.

Извлечение микроорганизмов из пробирки для приготовления препарата или для пересева в иную среду производится следующим образом.

Пробирку с культурой берут в левую руку так, чтобы была хорошо видна вся поверхность питательной среды с выросшими на ней микроорганизмами. Пробирка должна находиться в слегка наклонном положении. Петлю для пересева берут в правую руку и держат ее так, как держат ложку во время еды (для тех, у кого рабочей рукой является левая, работа проводится в зеркальном отражении к правой руке). Не выпуская петли, открывают пробирку, из которой берется культура. Делают это так: мизинцем и безымянным пальцами правой руки прижимают пробку к ладони и вынимают ее из пробирки. Пробку, прижатую к ладони пальцами, держат на протяжении всей последующей манипуляции. Класть ее на стол ни в коем случае нельзя, чтобы не загрязнить микрофлорой окружающей среды, через нее и культуру в пробирке, а также с целью, чтобы микробы, находящиеся в пробирке, не заразили окружающую среду и тех, кто с ними работает.

После того как пробка вынута из пробирки, края открытой пробирки с культурой обжигаются в пламени горелки и только после этого стерильную петлю вводят в пробирку.

Взяв небольшое количество микробной массы с поверхности субстрата, петлю вынимают из пробирки, следя за тем, чтобы переносимый материал не касался стенок или краев пробирки. Края пробирки снова обжигают в пламени горелки, затем обжигают пробку и закрывают нею пробирку. Если конец пробки загорится, ее нужно быстро внести в пробирку, где пробка потухнет из – за недостачи кислорода.

Закрытую пробкой пробирку с культурой ставят в штатив, а извлеченный материал используют для приготовления микропрепарата или для пересева культуры в свежую среду.

Если пересевают на скошенную агаризованную среду, то петлю вводят в пробирку до нижней части питательной среды в капельку конденсационной воды и, слегка касаясь петлей поверхности среды, штрихообразными движениями поднимают петлю вверх. Посев следует делать так, чтобы не повредить поверхности питательной среды. При пересеве на жидкие среды (в колбу или пробирку) петлю с микробной массой погружают непосредственно в среду.

Оставшиеся на петле после пересева или приготовления микропрепарата клетки микроорганизмов тщательно сжигают в пламени горелки. Прокаливание петли начинают с участка проволоки, примыкающего к кольцу, для того, чтобы микробная масса, оставшаяся на петле, подсохла. Затем петлю переводят в вертикальное положение и прокаливают докрасна. Только после этого петлю можно положить на место.

Когда нужно приготовить препарат или произвести пересев культуры микроорганизмов, выросших в жидкой питательной среде, лучше пользоваться не петлей, а применять стерильную пипетку.

Пипетку за верхний конец вынимают из бумаги или пенала, в которых она стерилизовалась, и вводят в пробирку или в колбу с культурой, соблюдая все предосторожности, описанные выше. Отбор жидкой культуры пипеткой можно производить с помощью резиновой груши. Использованную пипетку следует немедленной поставить в сосуд с дезинфицирующим раствором, не касаясь ею окружающих предметов.

При посеве материала в чашку Петри крышку ее следует только приоткрывать для того, чтобы не загрязнить культуру микробами из воздуха, которые вместе с пылинками, витающими в воздухе, могут осесть на питательную среду в чашке.

Все описанные манипуляции следует проводить около пламени горелки быстро, аккуратно, внимательно, чтобы не загрязнить культуру посторонними микроорганизмами и не распространить исследуемую культуру в окружающей среде.

Во время работы нельзя производить резких движений, разговаривать и передвигаться по лаборатории.

Культуры микроорганизмов, не нужных для дальнейшей работы, следует убить. Для этого сосуды с отработанными культурами микроорганизмов (колбы, пробирки, матрацы, Чашки Петри и пр.) автоклавируют и только после этого моют.

8.1. Техника посева и выделения чистых культур микроорганизмов

Доставляемый в лабораторию материал подвергают бакте­риологическому исследованию в тот же день. Техника посева зависит от характера засеваемого материала, консистенции пи­тательной среды и цели исследования.

Для проведения посевов необходимы: подлежащий исследо­ванию материал, питательные среды, бактериологическая пет­ля, шпатели (стеклянные, металлические), пастеровские и градуированные пипетки, металлические кюветы или поднос для переноса засеянных чашек и металлические коробки для пере­носа пробирок, ведро или бачок с крышками для сброса отра­ботанного инфицированного материала, спиртовая или газовая горелка.

Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. При взятии петлей жидкость должна образовать в кольце петли тонкую прозрачную пленку – "зеркало". Пипетками пользу­ются в том случае, когда материал засевают в большом или точно отмеряемом объеме.

Способ взятия плотного материала определяется его кон­систенцией. При посевах чаще всего пользуются бактериоло­гической петлей.

Все манипуляции, связанные с посевом и выделением мик­робных культур, производят над пламенем горелки. Бактери­альную петлю перед взятием материала прокаливают в пламени горелки, затем ее остужают так, чтобы при соприкосновении с жидкой средой она не вызывала кипения жидкости, а при­косновение к агару не сопровождалось его плавлением. Для остуживания петли лучше всего погружать ее в конденсацион­ную жидкость пробирки со стерильной питательной средой или прикасаться к крышке чашки Петри со стерильной средой. Нельзя остужать петлю прикосновением к поверхности пи­тательной среды, даже свободной от микробного роста, так как на ней могут находиться колонии, не видимые простым глазом.

После окончания посева петлю прожигают повторно для уничтожения находящейся в ней микробной культуры или инфицированного микроорганизмами материала.

Пипетки и шпатели, использованные для посевов, опускают в дезинфицирующий раствор.

После посева на чашках Петри со стороны дна, на пробир­ках – в верхней трети надписывают название засеянного ма­териала или ставят номер анализа и дату посевов.

8.1.1. Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды

• При посеве в жидкую питательную среду петлю с находя­щимся на ней материалом погружают в среду. Если мате­риал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду.
• При посеве на скошенный мясопептонный агар пробирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают правой рукой IV и V пальцами, не прикасаясь к той ее части, которая входит внутрь пробирки. Остальные три пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериологической петли, посредством которой произво­дится посев. Петлю держат, как писчее перо. После выни­мания пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее по­сторонних микроорганизмов из воздуха.

При посеве на скошенный агар петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опус­кают плашмя на поверхность питательной среды и скользящи­ми движениями наносят штрихи снизу вверх от одной стенки пробирки к другой (рис. 8.1).

• • При посеве на поверхность плотной питательной среды из пробирки в чашки Петри пробирку фиксируют II, III и V пальцами левой руки, а крышку чашки Петри приоткрыва­ют I и IV пальцами левой руки настолько, чтобы в образо­вавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель (рис. 8.2). Небольшое количество исследуемого материала, взятого из пробирки бактериологической петлей, втирают в поверхность питательной среды у края чашки. Затем пет­лю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала. Линию посева начинают с того места, в котором находится материал. Бактериологическую пет­лю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поца­рапать ее поверхность, и проводят штрихи по всей среде или по секторам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на 4, 8 или 16 равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые пет­лей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микробов в концевой ее части.
• • Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользовать­ся вместо петли тампоном или шпателем.

При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной сре­ды. Такой характер микробного роста получил название сплошного или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одно­го вида.

• Для посева материала в толщу плотной питательной среды готовят взвесь в стерильной водопроводной воде или в изо­тоническом растворе. Набирают 0,1–1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного за­грязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15–20 мл мясопептонного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40– 45 "С (при такой температуре пробирка со средой, прило­женная к щеке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распределения исследуемого материала в пи­тательной среде закрытую чашку с содержимым слегка вра­щают по поверхности стола.
• Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней матери­алом.
• Калиброванной бактериологической петлей (диаметр 2 мм, емкость 0,005 мл) производят посев мочи на сектор А чаш­ки Петри с простым агаром, сделав около 40 штрихов. Затем петлю прожигают и производят 4 штриховых посе­ва из сектора А в сектор I, из сектора I в сектор II и из сек­тора II в сектор III, каждый раз после прожигания петли (рис. 8.3).

Чашки инкубируют при температуре 37 °С в течение 18– 24 ч, после чего подсчитывают количество колоний, выросших в разных секторах, и определяют количество бактерий в 1,0 мл по приведенной табл. 8.1 (этот метод принят для определения степени бактериурии).

Таблица 8.1. Определение количества бактерий в 1 мл методом секторных посевов*

Количество колоний в секторах

Количество бактерий в 1 мл

*Приказ № 535 от 22 апреля 1985 г. "Об унификации микробиологи­ческих (бактериологических) методов исследования, применяемых в кли­нико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учрежде­ний" (Москва, 1985).

8.1.2. Методы выделения чистых культур

Чистой культурой принято называть совокупность однород­ных микроорганизмов, относящихся к одному виду, полученных из массы одной колонии, клетки которой идентичны по морфологическим, тинкториальным, культуральным, метабо­лическим и генетическим признакам, так как по существующим представлениям микробная колония является популяцией бактериальных клеток, возникшей в результате размножения единственной материнской клетки. Микробная колония являются аналогом клона.

Чистые культуры микроорганизмов одного вида, выделен­ные из различных источников, могут отличаться друг от друга незначительным отклонением морфологических, культуральных или биохимических признаков, не выходя за пределы своего вида или подвида. Такие культуры называют штаммами. Вместо ранее именованных типов в зависимости от характера изменившегося признака их обозначают морфоварами (отлич­ные по морфологическим признакам), сероварами (имеющие антигенные отличия), биоварами (отличающиеся биологичес­кими свойствами).

Чистая культура необходима для изучения морфологичес­ких, культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение полу­чил метод механического разъединения микроорганизмов, на­ходящихся в исследуемом материале, с целью получения изо­лированных колоний на поверхности или в глубине питатель­ной среды. Очень широко применяются селективные питатель­ные среды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить. Некоторые виды микробов обладают высокой чувствительностью к воз­действию определенных факторов внешней среды. Индивиду­альная устойчивость микробов к тому или иному фактору была использована для разработки методов выделения чистых куль­тур путем умерщвления сопутствующей микрофлоры. Этим способом производится выделение споровых форм микробов, устойчивых к действию высокой температуры, микобактерий туберкулеза, безразличных к действию концентрированных растворов минеральных кислот, в отличие от остальных мик­робов, содержащихся в мокроте.

При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней мик­рофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных жи­вотных, восприимчивых к тому виду микроба, который предполагается выделить из исследуемого материала. Биологичес­кий метод выделения чистой культуры применяется при иссле­довании мокроты на содержание в ней пневмококков, микобактерий туберкулеза.

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху). Три пробирки, содержащие по 15 мл мясопептонного агара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43–45 °С. В пробирку вносят одну бактериологическую петлю исследуе­мого материала. Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку вращают несколько раз, зажав между ладонями. После этого одну петлю (прокаленную и остуженную) содержимого 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в 3-ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам про­бирок.

После застудневания среды с исследуемым материалом чаш­ки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

Выделение чистой культуры по способу Дригальского. Рас­плавленную питательную среду разливают в три чашки Петри. Застывшую среду обязательно подсушивают, так как влажная поверхность ее способствует образованию сливного роста. В пер­вую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и сте­рильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды. Далее, не прожигая шпателя и не набирая нового ма­териала, шпатель переносят во 2-ю, а затем и 3-ю чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.

Метод рассева по поверхности, предложенный Дригальским, является наиболее употребительным для получения чис­той культуры микробов. Вместо шпателя можно пользоваться петлей. Материал на питательной среде распределяют парал­лельными штрихами по всей чашке в одном направлении. Затем, повернув чашку на 90°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посе­ва материал, находящийся в петле, расходуется постепенно, и по линиям штрихов, нанесенных в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

Выращивание и выделение чистых культур анаэробов. Для выращивания анаэробов необходимо создать определенные ус­ловия, сущность которых заключается в удалении молекуляр­ного кислорода из питательной среды и пространства, окружа­ющего эти культуры. Другим обязательным условием, обеспе­чивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду.

Единственным отличием питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, служит пониженное содержание в них свободного кислорода. Самым простым способом удале­ния растворенного кислорода является кипячение. Непосред­ственно перед посевом материала пробирки с питательными Средами кипятят на водяной бане в течение 10–20 мин. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, уда­ляется кислород. Свежепрокипяченную питательную среду бы­стро охлаждают, погружая в лед или подставляя под струю холодной воды, чтобы не дать ей насытиться кислородом воз­духа, и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху сте­рильным вазелиновым или парафиновым маслом (толщина слоя 1–1,5 см). Засев среды производят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки.

В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, ас­корбиновую кислоту, цистеин, гликокол, глутатион. Активно связываются с кислородом животные ткани паренхиматозных органов. На этом свойстве животных клеток основано приго­товление питательной среды Китта – Тароцци (рецепт 161), широко применяемой для выращивания анаэробов. В жидкие питательные среды помещают иногда пористые вещества: вату, пемзу, которые адсорбируют на своей поверхности пузырьки воздуха.

Для создания бескислородных условий используют физи­ческие, химические и биологические факторы.

Физические способы культивирования анаэробов:

• • способ Виньяля – Вейона. Берут 4–5 пробирок с 0,5 % рас­плавленным и охлажденным до температуры 40–45 °С са­харным агаром. В содержимое одной из них вносят пипет­кой небольшое количество исследуемого материала и тща­тельно размешивают. Для уменьшения концентрации мате­риала с целью получения изолированных колоний засеян­ную среду в количестве, соответствующем объему внесен­ного материала, переносят из 1-й пробирки во 2-ю, из 2-й в 3-ю. Затем содержимым каждой пробирки заполняют ка­пилляры трех пастеровских пипеток.

Чтобы предупредить застывание питательной среды в мо­мент насасывания ее в пипетки, пока их кончик не обломлен, пипетки погружают на 3–5 мин в стерильную воду с темпера­турой 45–50 °С. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2–3 сут в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Выросшие колонии легко изо­лировать. Для этого капилляр надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию микро­ба, находящуюся в агаре, извлекают петлей и пересевают в свежую питательную среду;

• • выращивание анаэробов в условиях вакуума. Вакуумные усло­вия для выращивания анаэробов создают в анаэростате или эксикаторе. Исследуемый материал или культуру микробов засевают в пробирки с жидкой средой или в чашки Пет­ри с плотной питательной средой. Посевы помещают в анаэростат, затем присоединяют его к насосу и выкачива­ют воздух. Степень разреженности воздуха определяют по показаниям вакуумметра. Колонии анаэробов в вакуум­ных условиях растут на поверхности плотной питательной среды.

Химические методы выращивания анаэробов (метод Аристовского). Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидро­сульфит натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор закры­вают крышкой и помещают в термостат при температуре 37 *С на 24–48 ч.

Биологический метод выращивания анаэробов (по Фортнеру). В чашку Петри наливают толстым слоем 5 % кровяной агар с 1–2 % глюкозы. Посередине чашки в питательной среде вы­резают стерильным скальпелем канавку шириной 1–1,5 см, которая делит питательную среду на две половины. Одну из них засевают культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом, другую половину – культурой аэробов: чудесной палочкой (Serratia marcescens) или кишечной палоч­кой (Escherichia coli). Перед посевом чашки подсушивают в термостате, чтобы аэробы вместе с капельками влаги не могли попасть на другую сторону чашки. Засеянные чашки закрыва­ют, а свободное пространство между дном и крышкой закле­ивают лейкопластырем, чтобы предупредить поступление в чашку кислорода извне. В термостате чашки устанавливают вверх дном. Быстро растущие аэробы, поглощая находящийся в чашке кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов.

Анаэростат для культивирования анаэробов. Анаэростат – прибор для выращивания микробов в анаэробных условиях – представляет собой толстостенную металлическую или пласти­ковую камеру с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакуумметр и два крана для присоединения к вакуум-насосу. Вместо кислорода в нем используются газо­вые смеси.

Читайте также:

  
• Экоморфы по отношению к климату покрытосеменных растений
  
• Как часто поливать газон после посадки
  
• Физиологические основы применения удобрений
  
• Физические и механические свойства дуба
  
• Амандин клубника описание сорта