Питательная среда использующаяся для посева материала при диагностике коклюша

Обновлено: 05.10.2024

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Коклюш: причины появления, симптомы, диагностика и способы лечения.

Определение

Коклюш – острое инфекционное заболевание, вызываемое бактериями рода Bordetella, характеризующееся длительным приступообразным судорожным спазматическим кашлем, поражением дыхательной, сердечно-сосудистой и нервной систем.

Источником инфекции являются больные с типичными или атипичными формами заболевания. Больные с атипичными формами коклюша представляют особую опасность при тесном и длительном контакте (например, матери и ребенка). Путь передачи возбудителя — воздушно-капельный. Риск инфицирования для окружающих особенно велик в предсудорожном периоде заболевания и в начале периода судорожного (спазматического) кашля. К 25-му дню от начала коклюша больной, как правило, становится не заразен.

При отсутствии антибактериальной терапии риск передачи инфекции непривитому ребенку, находящемуся в тесном контакте, сохраняется до 7-й недели периода судорожного кашля.

Восприимчивость к коклюшу высока и составляет до 70,0–100,0% у непривитых детей первого года жизни. Особенно подвержены риску новорожденные и недоношенные дети.

Причины появления коклюша

Возбудитель коклюша – грамотрицательная гемолитическая палочка, неподвижная, необразующая капсул и спор, неустойчивая во внешней среде. Коклюшная палочка образует экзотоксин, имеющий основное значение в патогенезе заболевания и обладающий системным воздействием (гематологическим и иммуносупрессивным).

Коклюшные микробы через слизистую верхних дыхательных путей достигают бронхиол и альвеол. Бактериемия (наличие бактерий в крови) для больных коклюшем не характерна.

Классификация коклюша

Для клинической классификации коклюша используют единый принцип классификации инфекционных болезней у детей по типу, тяжести и течению.

По типу

Типичные.
Атипичные (наблюдаются, как правило, у взрослых и/или привитых пациентов):

абортивная;
стертая;
бессимптомная;
транзиторное бактерионосительство.

Легкая форма (приступы кашля 10-15 раз в сутки).
Среднетяжелая форма (приступы кашля (20-25 раз в сутки).
Тяжелая форма (приступы кашля до 50 и более раз в сутки).

выраженность симптомов кислородной недостаточности;
частота и характер приступов судорожного кашля;
состояние больного в межприступном периоде;
выраженность отечного синдрома;
наличие специфических и неспецифических осложнений;
выраженность гематологических изменений.

Гладкое.
Негладкое:

с осложнениями;
с наслоением вторичной инфекции;
с обострением хронических заболеваний.

коклюш, вызванный Bordetella pertussis;
коклюш, вызванный Bordetella parapertussis;
коклюш, вызванный другим возбудителем вида Bordetella;
коклюш неуточненный.

Клиническая картина заболевания начинает проявляться после двух недель с момента заражения. Выделяют несколько периодов развития.

Катаральный период проявляется частым сухим кашлем, усиливающимся в ночное время. Может наблюдаться повышение температуры тела до 37-37,5оС.

У маленьких детей катаральные явления выражены сильнее, так что начало заболевания может напоминать ОРВИ с обильными выделениями из носа.

Спазматический период коклюша характеризуется усилением и быстрым прогрессированием симптомов: непроизвольным приступообразным кашлем, свистящим шумным вдохом после окончания приступа, что свидетельствует о спазме голосовой щели во время приступа кашля; отеком и покраснением лица. После окончания приступа кашля в большинстве случаев начинается рвота или сплевывание вязкой слизи.

Дети старшего возраста говорят о наличии предвестников приступа: першении в горле, ощущении давления в груди, чувстве страха.

Диагностика коклюша

При сборе анамнеза следует целенаправленно выявить жалобу на кашель длительностью более 7-14 дней, с уточнением его характера, наличия контактов с больным коклюшем или длительно кашляющим (более 3-4 недель) человеком.

Всем пациентам с подозрением на коклюш рекомендован общий (клинический) анализ крови с исследованием лейкоцитарной формулы. При наличии лейкоцитоза клинический анализ крови необходимо выполнять в динамике.

Одно из основных лабораторных исследований для количественной и качественной оценки всех классов форменных элементов крови. Включает цитологическое исследование мазка крови для подсчета процентного содержания разновидностей лейкоцитов и определение скорости оседания эритроцитов.

3.1.2. ИНФЕКЦИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

Диагностика коклюша и паракоклюша

Дата введения: с момента утверждения

1. Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е.Б.Ежлова, А.А.Мельникова, Н.А.Кошкина); Федеральным бюджетным учреждением науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Пастера" (Г.Я.Ценева, Н.Н.Курова); Федеральным бюджетным учреждением науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (С.Б.Яцышина, Т.С.Селезнева, М.Н.Прадед); Федеральным государственным бюджетным учреждением "Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального медико-биологического агентства" (Ю.В.Лобзин, И.В.Бабаченко).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 24 мая 2013 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

Термины и сокращения

АКДС - адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ГОСТ - Государственный стандарт

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

КУА - казеиново-угольный агар

ME - международные единицы

МУ - методические указания

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция

ПСК - период судорожного кашля

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - реакция агглютинации

РИФ - реакция иммунофлуоресценции

РНК - рибонуклеиновая кислота

СанПиН - санитарно-эпидемиологические правила и нормы

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

СП - санитарно-эпидемиологические правила

ТЕ - буфер Трис-ЭДТА

ТУ - технические условия

ФС - фармакопейная статья

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay (разновидность ИФА)

FHA - filamentous haemagglutinin (филаментозный гемагглютинин)

NASBA - nucleic acid sequence-based amplification (метод амплификации РНК)

PT - pertussis toxin (коклюшный токсин)

RS-инфекция - инфекция, вызванная респираторно-синцитиальным вирусом

1. Область применения

В методических рекомендациях представлена современная микробиологическая характеристика коклюша в условиях массовой вакцинопрофилактики. В них содержится краткое описание рода Bordetella, включая новые виды, открытые в последнее десятилетие, более детальная характеристика биологических свойств В. pertussis, В. parapertussis и В. bronchiseptica, описание бактериологического метода исследования с использованием приемов, повышающих его информативность, современных методов лабораторной диагностики ПЦР и ИФА. Представлены алгоритмы диагностики коклюша в зависимости от вакцинального статуса, возраста и сроков заболевания пациентов. Цель настоящих методических рекомендаций - унифицировать подходы к лабораторной диагностике коклюшной инфекции.

Методические рекомендации предназначены для специалистов органов и организаций Роспотребнадзора (микробиологов, эпидемиологов), специалистов по клинической лабораторной диагностике, инфекционистов, педиатров, семейных врачей и врачей общей практики.

2. Введение

В довакцинальную эру коклюш занимал второе место среди детских капельных инфекций по уровню заболеваемости и первое по уровню смертности. В настоящее время в мире ежегодно заболевает несколько миллионов человек, умирает около 200 тыс. (в 2008 г. - 16 млн заболевших, 195 тыс. смертей).

Специфическая профилактика коклюша, проводимая в нашей стране с 1959 года, отчетливо повлияла на эпидемический процесс, биологические свойства возбудителя и клинику. Этапы массовой иммунизации характеризовались различным уровнем охвата детей прививками против коклюша и, в соответствии с этим, менялась эпидемиологическая обстановка. Низкий уровень иммунизации в 90-е годы привел к росту заболеваемости коклюшем. Достижение охвата прививками детей первого года жизни (более 95%) в последующие годы и поддержание его на этом уровне обеспечило не только снижение заболеваемости коклюшем, но и с 2001 г. стабилизацию показателей на минимальном уровне (3,2-5,7 на 100 тыс. населения). Особенностью эпидемического процесса коклюша на фоне высокого охвата прививками детей раннего возраста является возникновение периодических подъемов. Это объясняется недостаточной напряженностью и длительностью поствакцинального иммунитета, создаваемого в условиях нередкого нарушения календаря прививок, в частности, несоблюдения сроков вакцинации и интервалов между введениями доз вакцины и проведением ревакцинации, что способствует накоплению значительного числа неиммунных лиц. Увеличение охвата прививками привело в настоящее время к изменению возрастной структуры лиц, заболевших коклюшем. Большинство заболевших составляют школьники 7-14 лет - до 50,0%, дети 3-6 лет - до 25,0%, наименьшую долю - дети в возрасте 1-2 лет - 11,0% и дети до 1 года - 14,0%. В периоды подъема заболеваемости коклюшем интенсивность эпидемического процесса определяется заболеваемостью детей школьного возраста. Темпы роста в этой группе увеличиваются в 2-3 раза. Из числа лиц, заболевших коклюшем, 65% составляют привитые.

Поствакцинальный иммунитет не предохраняет от заболевания. Коклюш в этих случаях протекает в виде легких и стертых форм инфекции, которые диагностируются, в основном, ретроспективно (серологически). После перенесенного заболевания остается более длительный иммунитет.

Истинная заболеваемость коклюшем значительно выше за счет недиагностированной коклюшной инфекции (легких и стертых клинических форм). Трудности клинической диагностики коклюша на ранних стадиях заболевания, отсутствие обследования всех длительно (свыше 7 дней) кашляющих или его проведение на поздних сроках заболевания, а также после продолжительного лечения антибактериальными препаратами приводит к низкому проценту выявляемости возбудителя инфекции. Уровень бактериологического подтверждения диагноза составляет 10-20%. Современные методы исследования позволяют проводить раннюю диагностику заболевания (ПЦР) и существенно облегчают постановку диагноза (ПЦР, ИФА).

Таким образом, коклюш в нашей стране требует пристального внимания со стороны врачей различных специальностей. Своевременная и качественная лабораторная диагностика коклюшной инфекции позволит избежать ошибок в постановке диагноза и будет способствовать эффективной терапии.

3. Характеристика рода Bordetella*, биологические свойства возбудителей коклюша и паракоклюша

* Слово "Bordetella" в наименовании раздела 3 в бумажном оригинале выделено курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.

Род Bordetella относится к семейству Alcaligenaceae и включает 9 видов: В. ansorpii, В. avium, В. bronchiseptica, В. hinzii, В. holmesii, В. parapertussis, В. pertussis, В. petrii, В. trematum. Первой (в 1908 г.) была описана В. pertussis, бактерия патогенна для человека и является возбудителем коклюша. В. parapertussis была описана в 1938 г., вызывает у людей паракоклюш (коклюшеподобное заболевание), она также была выделена от овец. В. bronchiseptica была описана в 1911 г., является возбудителем заболеваний дыхательных путей у многих млекопитающих (кашля у собак, атрофического ринита у свиней и др.), но встречается также бессимптомное носительство. У человека редко вызывает заболевание, однако описаны случаи, когда у пожилых людей, заразившихся от домашних животных (кроликов), В. bronchiseptica вызывала длительный кашель. В. avium описана в 1984 г., является возбудителем ринотрахеита у птиц. Описано несколько случаев выделения B. avium от пожилых пациентов с отягощенным анамнезом, с клинической картиной пневмонии. В 1995 г. были описаны сразу два новых вида: В. hinzii и В. holmesii. В. hinzii колонизирует дыхательные пути домашней птицы, была выделена от иммуноскомпрометированных пациентов, описан случай летальной септицемии. В. holmesii выделялась только от людей, обнаруживалась в мокроте, несколько раз в крови, этиологическая роль в развитии инфекций не доказана. В 1996 г. выделена В. trematum, возбудитель вызывает раневые и ушные инфекции. В 2001 г. была описана В. petrii, единственный представитель рода, выделенный из окружающей среды и способный жить в анаэробных условиях. В 2005 г. была выделена В. ansorpii, описано несколько случаев выделения от пациентов с онкологическими заболеваниями (из гнойного содержимого эпидермальной кисты, из крови).

Морфологические и культуральные свойства

Бактерии рода Bordetellae - мелкие (0,2-0,5 мкм0,5-2,0 мкм) грамотрицательные коккобациллы. В мазках - часто биполярно окрашенные, одиночные или в парах, реже в цепочках, имеют нежную капсулу. Все, за исключением В. petrii, - строгие аэробы. Температура выращивания бордетелл +35-37 °С (оптимально +35 °С). Бордетеллы требовательны к условиям роста: 130-150 мг %аминного азота, кровь, дрожжевой экстракт, никотиновая кислота, аминокислоты (цистин, пролин, метионин, серин, глютамин и др.); наиболее требователен возбудитель коклюша, он растет только на специальных средах, в то время как остальные представители рода растут на кровяном агаре. Классической средой для первичного выделения В. pertussis является среда Борде-Жангу (картофельно-глицериновый агар), позднее были предложены синтетические и полусинтетические среды, в частности, казеиново-угольный агар (КУА). На указанных средах бордетеллы вырастают в виде характерных колоний: на среде Борде-Жангу - выпуклые, гладкие, блестящие, серебряного цвета, напоминающие капли ртути, окруженные зоной гемолиза; на КУА - выпуклые, гладкие, серого цвета с жемчужным, желтоватым или беловатым оттенком. Колонии маслянистые, легко снимаются петлей. В. parapertussis и В. holmesii за счет образования пигмента вызывают потемнение сред с кровью, образуют бурую подложку.

Микробиологическое исследование, позволяющее выявить возбудитель коклюша (Bordetella pertussis) или паракоклюша (Bordetella parapertussis) в исследуемом биоматериале.

Синонимы русские

Посев на коклюш/паракоклюш.

Синонимы английские

Bordetella pertussis сulture / Bordetella parapertussis сulture.

Метод исследования

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Мазок из ротоглотки.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Подготовки не требуется.

Общая информация об исследовании

Bordetella pertussis/parapertussis (палочка коклюша/паракоклюша) – это грамотрицательные бактерии рода Bordetella, вызывающие поражение эпителия бронхов и являющиеся возбудителями коклюша/паракоклюша. Заболевание высокозаразно и передается воздушно-капельным путем. Источник инфекции – больные коклюшем/паракоклюшем. Инкубационный период составляет от нескольких дней до 3 недель. В клинической картине выделяют 3 стадии. На первой стадии (катаральной), которая обычно длится около 2 недель, преобладают симптомы простуды. На 2-й стадии (пароксизмальной) заболевания, составляющей 1-2 недели или даже несколько месяцев, основными симптомами являются тяжелые приступы кашля. 3-я стадия (выздоровления) характеризуется постепенным уменьшением количества приступов. Заболевание иногда может давать такие осложнения, как пневмония, энцефалит и судороги, и даже приводить к смертельному исходу. Наиболее тяжело оно протекает у детей.

Для выявления коклюша применяются микробиологические, молекулярно-генетические, серологические и ряд других методов диагностики. Посев на коклюш – “золотой стандарт” диагностики коклюша/паракоклюша, который позволяет вывить возбудителя в исследуемом материале.

Для чего используется исследование?

Чтобы выявить Bordetella pertussis/parapertussis для подтверждения диагноза "коклюш"/"паракоклюш".
Для дифференциальной диагностики заболеваний, протекающих со сходными симптомами, таких как бронхиты, грипп, инфекция, вызванная респираторно-синцитиальным вирусом (наряду с другими исследованиями).
Чтобы оценить эффективность проводимой антибактериальной терапии.

Когда назначается исследование?

При подозрении на коклюш/паракоклюш.
Если пациент контактировал с инфицированными коклюшем/паракоклюшем, особенно при наличии у него симптомов простуды.
При проведении антибактериальной терапии – не менее чем через 2 недели после окончания курса лечения.

Что означают результаты?

Референсные значения: отрицательно.

Выявление Bordetella pertussis/parapertussis в исследуемом биоматериале подтверждает диагноз "коклюш"/"паракоклюш".

Коклюш – острое инфекционное заболевание преимущественно детского возраста, основным симптомом которого являются приступы спазматического кашля.

Возбудителем коклюша является Bordetella pertussis . Род Bordetella , кроме возбудителей коклюша, включает еще два вида бактерий, патогенных для человека: B . Parapertussis – возбудитель паракоклюша и B . Bronchiseptica - возбудитель бронхисептикоза, заболевание которое развивается чаще у домашних животных (у человека регистрируется только в 0,5 % случаев). По морфологическим и тинкториальным свойствам бордетеллы – грамотрицательные палочки размером 0,5-1,0 х 0,2-0,3 мкм, неподвижные, спор не образуют, имеют небольшую капсулу. В препарате они располагаются поодиночке или попарно.

Бордетеллы коклюша строгие аэробы, требовательны к питательным средам. Для своего размножения они нуждаются в аминокислотах, как факторах роста, а также в добавлении крови, древесного угля для нейтрализации образовавшихся жирных кислот, которые тормозят развитие бордетелл.

Основным методом диагностики коклюша является бактериологический. Метод информативен в ранние сроки заболевания (период спазматического кашля), выделение культуры зависит от сроков взятия материала; на 1-й неделе заболевания положительные результаты удается получить у 95% больных, на 4-й – лишь у 50 %, а начиная с 5-й недели микроб выделить уже не удается. Серологические методы можно использовать для ретроспективной диагностики, а также у больных с отрицательными результатами бактериологических исследований.

Исследуемый материал засевают на одну из специальных сред: КУА, Борде – Жангу, молочно – кровяной агар. Для угнетения роста посторонних микроорганизмов поверхность питательной среды обрабатывают пенициллином. В каждую чашку наносят по 0,1 мл антибиотика, содержащего 7,5 МЕ и растирают стеклянным шпателем по всей поверхности питательной среды. Чашки помещают в термостат при 37 о С на 72 ч. Через 72 ч выросшие колонии просматривают с помощью бинокулярного стереоскопического микроскопа или бинокулярной лупы. Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии в мазках грамотрицательных палочек ставят реакцию агглютинации на стекле с агглютинирующей коклюшной сывороткой и делают пересев в пробирку или чашку Петри для получения чистой культуры бордетелл коклюша. Выросшую культуру идентифицируют и дифференцируют от других видов рода по комплексу свойств.

Для определения уреазы в агглютининационные пробирки вносят 0,3 мл густой суспензии исследуемого материала и 2–3 капли 0,1%-ного спиртового раствора фенолфталеина. В положительном случае через 20-30 мин появляется малиновое окрашивание, указывающее на расщепление мочевины уреазой.

При отсутствии роста 72 ч чашки ставят в термостат еще на 48 ч и затем их изучают повторно. Предварительный ответ выдается через 3-5 суток, окончательный через 5-7 суток.

Другим методом выявления возбудителя является иммунофлюоресцентный (РИФ), который используется как дополнительный при наличии качественных реактивов (моноклональных антител к ЛПС возбудителя).

Серодиагностику проводят в реакции агглютинации (РА), непрямой гемагглютинации (РНГА) и связывания комплемента (РСК). Антитела в крови больных появляются на 3 – 4 неделе заболевания. Диагностическое значение имеет нарастание титра антител в динамике болезни в 4 раза и более, поэтому реакции ставят повторно через 10 – 14 дней. При обследовании не привитых против коклюша диагностическое значение имеет наличие антител в титрах 1:80. Реакции ставятся параллельно с коклюшными и паракоклюшными антигенами. Латекс-микроагглютинация, являясь модификацией РА, позволяет выявлять антитела в более ранние сроки, но этот метод может давать ложноположительные результаты.

Читайте также: