Пневмококки при посеве на кровяном агаре
Обновлено: 04.10.2024
а) Питательные основы сред для выделения и культивирования пневмококка. Для выделения и культивирования пневмококка используют среды на высокопитательных основах с обязательным добавлением нормальной сыворотки или крови. В качестве основы применяют триптические перевары белка — мяса, бычьего сердца, сои, казеина, плаценты, кровяных сгустков с конечным содержанием 1,6-1,8 г/л аминного азота. Рекомендовано добавление к основам экстракта кормовых дрожжей (ЭКД).
Из питательных основ лабораторного изготовления чаще всего используют агар на триптическом переваре мяса по Хоттингеру. Специально для пневмококка разработан рецепт питательного агара ВНИИП.
б) Питательный агар ВНИИП. Из питательных основ лабораторного изготовления чаще всего используют агар на триптическом переваре мяса. Специально для пневмококков разработан рецепт питательного агара ВНИИП, основа которого содержит:
Стерилизация при 112°С 20 мин. Перед употреблением к расплавленной и остуженной до 45°С среде асептично добавляют 0,5% стерильного раствора ЭКД (вместе с сывороткой или кровью).
в) Кровяной агар, неселективный и селективный. К расплавленной и остуженной до 45°С питательной агаровой основе для пневмококка добавляют 5,0-7,0% свежей дефибринированной крови барана, лошади или кролика. Среду разливают в чашки Петри. Цвет готовой среды — ярко-красный; среда непрозрачна.
Для облегчения выделения пневмококка из полимикробного материала (мокрота — 1:10, бронхиальные смывы, отделяемое среднего уха, слизь из носоглотки) с целью подавления посторонней флоры на участок засеянного кровяного агара стерильным пинцетом накладывают стандартный диск с антибиотиками — мономицином или гентамицином. После инкубации в термостате через 22-24 ч вокруг диска вырастают преимущественно колонии пневмококка.
Можно приготовить селективный кровяной агар с гентамицином. К расплавленной и остуженной до 45°С питательной агаровой основе для пневмококка добавляют 5,0-7,0% дефибринированной крови и раствор гентамицина из расчета создания его конечной концентрации в среде 5 мкг/мл.
г) Сывороточный агар. Используется не только для посевов стерильных в норме жидкостей (СМЖ, плевральная, асцитическая, синовиальная и т.д.), но и является основной средой для культивирования и изучения выделенных чистых культур пневмококка. К расплавленному и остуженному до 45°С питательному агару для пневмококка добавляют 20% нормальной сыворотки лошади или крупного рогатого скота, стерильной или с консервантом хлороформом. Смесь перемешивают и разливают в чашки Петри или в пробирки по 3,0-3,5 мл для получения скошенного агара. Среда полупрозрачна, имеет кремово-желтоватый цвет.
Чашки с кровяным и сывороточным агарами можно сохранять в холодильнике не более 2 сут.; пробирки со скошенным сывороточным агаром — не более 5 сут.
д) Тесты для дифференциации пневмококка и сходных с ним α-гемолитических стрептококков и энтерококков:
2. Желчный тест. Для постановки теста используют желчь крупного рогатого скота без консервантов (лучше взятую стерильно на бойне) или свежевзятую желчь кролика.
Метод диска. На 20-22-часовую испытуемую культуру, выросшую в результате густого посева газоном на кровяном агаре, накладывают стерильный диск фильтровальной бумаги (диаметром 1,0 см), свежепропитанный 20%-ным раствором желчи. Чашку снова помещают в термостат на 2-3 ч. По истечении этого времени вокруг диска наблюдается зона (1-2 мм) полного исчезновения колоний пневмококка; рост колоний других стрептококков и энтерококков не нарушается.
Желчный бульон. В пробирку с 3,0 мл мясопептонного бульона с 10% желчи добавляют 1,0 мл взвеси (или бульонной культуры) испытуемого штамма; смесь помещают в термостат на 1 ч. Для контроля эту же взвесь испытуемой культуры вносят в другую пробирку с бульоном, но без желчи. Если через 1 ч в опытной пробирке заметно просветление (по сравнению с контролем), то тест положителен, т.е. испытуемая культура чувствительна к желчи. При нечетко выраженном результате обе пробирки могут быть оставлены на одни сутки при комнатной температуре.
Желчь в бульоне может быть заменена дезоксихолатом натрия в конечной концентрации 10%.
3. Термическая проба. Взвесь суточной испытуемой 24-часовой культуры в изотоническом растворе натрия хлорида прогревают в водяной бане при 60°С 30 мин. После остывания при комнатной температуре из прогретой взвеси делают высев на кровяной (или сывороточный) агар для пневмококка. Для контроля делают высев из непрогретой взвеси. Если через 1 сут. инкубации высев из прогретой взвеси оказался положительным, как и в контроле, то испытуемая культура не является пневмококком.
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Лабораторная диагностика внебольничной пневмонии пневмококковой этиологии
1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Ю.В.Демина), ГБОУ ВПО ПГМУ им.ак.Е.А.Вагнера Минздрава России (И.В.Фельдблюм, Ю.А.Захарова, В.В.Николенко, Н.Н.Воробьева, С.О.Голоднова, А.В.Климашина), МБУЗ "Городская клиническая больница N 8" г.Челябинска (О.А.Орлова), ФБУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора (В.В.Малеев, Г.А.Шипулин, С.Б.Яцышина, К.О.Миронов), "Научно-исследовательский институт антимикробной химиотерапии" ГБОУ ВПО "Смоленская ГМА" Минздрава России (Р.С.Козлов, С.А.Рачина), ФГБУ "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалея" Минздрава России (И.С.Тартаковский), ФГБУЗ "Научно-исследовательский институт детских инфекций" ФМБА России (С.В.Сидоренко, В.В.Гостев, М.О.Волкова).
2. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю.Поповой 20 октября 2016 г.
3. Введены впервые.
1. Область применения
1.1. Настоящие методические рекомендации (далее - МР) определяют порядок лабораторной диагностики заболеваний, в первую очередь пневмоний пневмококковой этиологии.
1.2. Методические рекомендации предназначены для специалистов организаций, осуществляющих лабораторную диагностику заболеваний органов дыхания, индикацию патогенов инфекций верхних и нижних дыхательных путей.
2. Термины и сокращения
БАЛ - бронхоальвеолярный лаваж
ВКО - внутренний контрольный образец
ВОЗ - всемирная организация здравоохранения
ВП - внебольничная пневмония
ГЭ/мл - количество геном-эквивалентов в 1 миллилитре
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИХА - иммунохроматографический анализ
КОЕ/мл - колониеобразующие единицы в 1 миллилитре
МО - медицинская организация
МПК - минимальная подавляющая концентрация
МУ - методические указания
- никотинамидадениндинуклеотид
OК - отрицательный контроль экстракции
ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция
ОРИТ - отделение реанимации и интенсивной терапии
ПК - положительный контроль экстракции
ПЦР - полимеразная цепная реакция
СМЖ - спинномозговая жидкость
СП - санитарно-эпидемиологические правила
УФ-бокс - ультрафиолетовый бокс
ФКР - Федеральные клинические рекомендации
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
CNA-aгap - селективный агар для выделения грамположительных бактерий с налидиксовой кислотой и колимицином
EUCAST - European on Antimicrobial Susceptibility Testing (Европейская система тестирования антимикробной восприимчивости)
3. Общие положения
Пневмонии - группа различных по этиологии, патогенезу, морфологической характеристике острых инфекционных заболеваний, характеризующихся поражением легких с обязательным наличием внутриальвеолярной экссудации, сопровождающихся симптомами патологии нижних отделов дыхательных путей (лихорадка, кашель, выделение мокроты, возможно гнойной, боль в грудной клетке, одышка) и рентгенологическими признаками "свежих" очагово-инфильтративных изменений в легких при отсутствии очевидной диагностической альтернативы. Внебольничной пневмонией считают заболевание, возникшее во внебольничных условиях (вне стационара или позднее 4 недель после выписки из него) или диагностируемое в первые 48 часов с момента госпитализации, а также развивающееся у пациента, не находившегося в домах сестринского ухода длительного медицинского наблюдения более 14 суток.
По данным федерального статистического наблюдения (форма N 2 "Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях"), за 2011-2014 гг. заболеваемость ВП в России находилась на уровне 310-380 на 100 тыс. населения (600-750 случаев на 100 тыс. детей в возрасте до 14 лет).
У отдельных категорий граждан, в частности у военнослужащих срочной службы, медицинских работников, заболеваемость пневмококковыми пневмониями превышает уровень заболеваемости среди населения в целом.
Показатель смертности при ВП в 2011-2014 гг. составлял 2,9-3,9 на 100 тыс. населения (у детей в возрасте до 14 лет - 0,3-0,4 на 100 тыс.). В структуре младенческой смертности заболевания органов дыхания стоят на третьем месте (около 7%), из них около 74% приходится на пневмонии.
Этиологическая структура ВП может различаться в зависимости от возраста пациентов, тяжести заболевания и наличия сопутствующей патологии. По зарубежным данным, пневмококковые пневмонии диагностируют у 5% взрослых амбулаторных пациентов, 17,3% госпитализированных в терапевтические отделения и 21% - в отделения интенсивной терапии. В Российской Федерации по расчетным данным частота пневмококковых пневмоний у детей в возрасте от 1 месяца до 15 лет составляет 490 случаев на 100000 детского населения соответствующего возраста, в возрасте от 1 месяца до 4 лет - 1060 случаев.
Дети первых лет жизни являются основными источниками пневмококковой инфекции, заражая окружающих взрослых. Так, при средней частоте носительства у взрослых в 5-7%, среди взрослых, проживающих с детьми, она может достигать 30%.
По данным отчетной формы государственного статистического наблюдения в России (ф-2), пневмококковая этиология ВП подтверждается лишь в 1,3% случаев.
Создавшаяся ситуация требует поиска новых диагностических подходов и разработки алгоритмов выявления S. pneumoniae, включая стандартизацию бактериологических и серологических тестов, внедрение в работу практической медицины современных молекулярно-биологических и иммунохроматографических способов детекции возбудителя.
4. Биологические свойства Streptococcus pneumoniae, общая характеристика методов лабораторной диагностики
Возбудитель пневмококковой пневмонии, S. pneumoniae или пневмококк, входит в состав семейства Streptococcaceae, род Streptococcus, как вид условно-патогенных бактерий. Пневмококки - грамположительные каталазо- и оксидазоотрицательные мелкие шаровидные бактерии (кокки), являющиеся факультативными анаэробами.
При микроскопии часто имеют ланцетовидную форму, располагаются парами (диплококк), нередко имеют капсулу. Из жидких питательных сред под микроскопом визуализируются цепочками средней длины. При искусственном культивировании пневмококк нуждается в специальных питательных основах, обогащенных дефибринированной кровью животных. Рост возбудителя в искусственных условиях культивирования стимулирует повышенное содержание в атмосфере СО.
На плотных питательных средах пневмококк образует мелкие (1-2 мм в диаметре), округлые, блестящие, бесцветные колонии с ровным краем, мягкой консистенции, которые в большинстве случаев через 24 часа инкубации имеют сферическую форму с уплощенным центром, образующимся в результате аутолиза (шероховатая R-форма).
На 5%-м кровяном агаре вокруг колоний пневмококка характерно образование зеленящей зоны альфа-гемолиза. Наиболее вирулентные капсульные бактерии могут располагаться в виде капель росы, в последующем принимая сливной рост (мукоидная М-форма). Гладкие, компактные, точечные колонии (S-форма) преобладают у авирулентных штаммов.
Рост S. pneumoniae на жидких питательных средах характеризуется диффузным помутнением бульона без образования пленки.
Биохимическая активность пневмококка во многом совпадает с активностью других зеленящих стрептококков: он разлагает глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, не ферментирует маннит, салицин и сорбит, однако в отличие от других представителей зеленящих форм стрептококков не обладает способностью к росту при температуре 45°С.
Видовая специфичность пневмококка выражается в способности ферментировать инулин, чувствительности к оптохину и солям желчных кислот (дезоксихолату и таурохолату натрия). Вместе с тем в последние годы появились изоляты, устойчивые к оптохину (до 10% от всей популяции).
Вирулентность пневмококка в первую очередь обусловлена наличием полисахаридной капсулы, обеспечивающей антифагоцитарную активность, а также протеина адгезии, протеазы секреторного IgA, тейхоевой кислоты и фрагментов пептидогликана, активизирующих комплемент по альтернативному типу.
В зависимости от химического строения капсульного полисахарида выделяют более 90 серологических типов S. pneumoniae: серогруппы (обозначаются цифрами, например: серогруппа 6) и входящие в них серотипы (обозначаются буквами, например: серотип 6А). Определение серологических типов проводится с использованием серологических методик, основанных на реакции набухания капсулы в присутствии иммунной сыворотки или в реакции латкес-агглютинации. Альтернативным способом определения серогрупп (серотипов) является детекция специфических локусов бактериальной ДНК, вовлеченных в биосинтез капсульного полисахарида, с помощью различных ПЦР-методик или секвенирования ДНК.
Более 90% инвазивных заболеваний вызывается 23 серотипами возбудителя, которые входят в широко используемую в настоящее время полисахаридную вакцину (1, 2, 3, 4, 5, 6В 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 1-9F, 19А, 20, 22F, 23F, 33F).
Спектр антибиотикорезистентности пневмококка зависит от географического места изоляции и вида материала, из которого изолирован штамм (мазок из носоглотки, спинномозговая жидкость и др.). В России уровень устойчивости пневмококков, выделенных из нестерильных локусов, к пенициллинам (МПК>0,06 мг/л) составляет в среднем 11%, к макролидам - 7%, к тетрациклинам - 25%, к ко-тримоксазолу - 39%. Полирезистентностью (устойчивостью к 3 и более классам антимикробных препаратов) обладает 14,5% штаммов пневмококка, большинство из которых (>90%) выделено из респираторных образцов. Пневмококки 23-й, 19-й и 6-й серогрупп (серотипы 23F, 19F, 19А, 6В) часто характеризуются повышенной устойчивостью к пенициллину и другим антибактериальным препаратам, а также могут обладать полирезистентными свойствами, что обусловлено генетическими мутациями циркулирующих возбудителей.
Микроскопическое исследование относится к простым ускоренным методам обнаружения S. pneumoniae, позволяющим получить предварительный результат. Бактериоскопия окрашенного по Граму мазка определяет морфотип потенциального бактериального патогена. Ценность метода и решаемые задачи различаются в зависимости от того, из какого локуса организма отобран клинический материал.
Модифицированным вариантом микроскопии в комбинации с серологической диагностикой S. pneumoniae является метод Нейфельда или феномен набухания капсулы при взаимодействии с неразведенной специфической антипневмококковой сывороткой (I, II, lll типов) в присутствии синьки Лёффлера. Метод основан на способности капсул пневмококков увеличиваться в объеме в присутствии гомологичной антисыворотки, что регистрируют светооптической микроскопией. При положительном результате наблюдается резкое увеличение капсул пневмококков. При отрицательном результате капсулы едва заметны. Реакция набухания специфична и не дает положительного результата с другими капсульными бактериями, однако с его помощью невозможно идентифицировать не имеющие капсулы S. pneumoniae.
Пневмококки, имеющие капсулу, также можно визуализировать по методу Бурри-Гинса. По Бурри материал перемешивают с тушью, на фоне которой будут выделяться неокрашенные бактерии и капсулы. В модификации Гинса приготовленный по Бурри препарат дополнительно окрашивается фуксином Циля, при этом бактерии приобретают ярко малиновую окраску, а их капсулы остаются неокрашенными.
У пациентов, принимавших антибактериальные препараты, данные методы могут давать ложно-отрицательные результаты, поскольку в этом случае в клиническом материале могут присутствовать пневмококки, лишенные капсулы. Следует помнить, что при переходе S. pneumoniae из S в R-форму капсульные антигены утрачиваются.
Бактериологический метод позволяет выделить "чистую" культуру возбудителя, провести его видовую идентификацию и серотипирование, определить чувствительность к антимикробным препаратам.
Отправной точкой идентификации пневмококков на кровяном агаре является гемолитическая реакция стрептококков. S. pneumoniae - гемолитический (зеленящий) стрептококк, который по морфологическим признакам роста трудно отличим от идругих гемолитических ("зеленящих") стрептококков - S. mitis, S. oralis, S. sanguis, S. parasanguis, S. gordonii.
Признаками, подтверждающими видовую принадлежность изолята, являются его морфология (грамположительные кокки), отсутствие каталазо- и оксидазообразования, чувствительность к оптохину и лизис солями желчи. Оптохин (этилгидрокупреина гидрохлорида) селективно подавляет рост пневмококка в отличие от других "зеленящих" стрептококков. Соли желчи (в особенности дезоксихолат натрия и таурохолат натрия) обладают способностью избирательно лизировать колонии S. pneumoniae на агаре или в бульоне. Метод основан на активации пневмококковых аутолизинов - ферментов, участвующих в синтезе клеточной стенки, что приводит к визуальному лизису S. pneumoniae в течение 0,5-2 ч. Однако примерно для 14% пневмококков наблюдается неполный лизис. Дифференциальная диагностика S. pneumoniae проводится с прочими представителями рода Streptococcus: S. pseudopneumoniae (чувствительного к оптохину, но устойчивого к желчи), S. pyogenes группы А (чувствительного к бацитрацину и положительного в ПИРА-тесте), S. agalactiae группы В (положительного в тесте с гиппуратом Na и САМР-тесте), зеленящими стрептококками группы S. viridans (как правило, растущих в тиогликолевой среде при температуре 45°С). От представителей других родов: Neisseria spp., Haemophilus spp. и Corynebacterium spp., дающих схожий рост на средах первичного посева с атипичными формами пневмококков, их отличают морфология, оксидазная и каталазная активность.
Необходимо помнить, что в современной популяции до 10% изолятов пневмококков устойчивы к оптохину, они также резистентны и к бета-лактамным антибиотикам. В то же время рост некоторых "зеленящих" стрептококков подавляется оптохином.
Принадлежность S. pneumoniae, устойчивых к оптохину, необходимо подтверждать с использованием комплекса тестов, дифференцирующих между собой различные виды стрепрококков, с помощью тест-систем коммерческого производства, разрешенных к применению в Российской Федерации.
К сожалению, один из современных методов идентификации бактерий по белковому профилю, MALDI-масс-спектрометрия, не может быть использован для идентификации S. pneumoniae в связи с высоким сходством белкового профиля различных видов гемолитических стрептококков.
Конечным этапом бактериологической диагностики S. pneumoniae является определение чувствительности к антибиотикам. В настоящее время теоретически обоснованным считается подход к оценке чувствительности, предлагаемый Европейским сообществом (European on Antimicrobial Susceptibility Testing - EUCAST), основанный на признании факта существования различий между микробиологической и клинической чувствительностью/устойчивостью микроорганизмов. Для обоснования клинических критериев EUCAST использует фармакокинетические/фармакодинамические закономерности зависимости между величиной МПК антибактериального препарата в отношении микроба-возбудителя, фармакологическими характеристиками препарата и эффективностью лечения.
К способам обнаружения антигена пневмококка с целью его ускоренного выявления может быть отнесен метод латекс-агглютинации, основанный на выявлении пневмококковых капсульных полисахаридных антигенов с применением поливалентной специфической пневмококковой сыворотки. Антиген, содержащийся в исследуемом образце, взаимодействует со специфичными гомологичными антителами, которыми покрыты латексные частицы. В присутствии гомологичного антигена латексные частицы агглютинируют. В отсутствии антигена, они остаются в виде гомогенной суспензии.
Исследование проводят непосредственно с чашки первичного посева. Можно использовать сам биологический материал, как правило, ликвор или сыворотку крови. Быстроту получения результата и простоту теста могут нивелировать перекрестные реакции с антигенами других стрептококков. К преимуществам метода относят быстроту и простоту исполнения, к недостаткам - высокую стоимость, невозможность определения антигена в нестерильном биологическом материале.
В последние годы все большую популярность приобретают быстрые тесты "у постели больного", в частности иммунохроматографический экспресс-тест для выявления пневмококкового клеточного полисахарида (с-полисахарида) в моче.
Пневмококк (Streptococcus pneumoniae)
Пневмококки - это грамположительные кокки, у которых стороны клеток, обращенные друг к другу, уплощены, а противоположные стороны вытянуты, поэтому они имеют ланцетовидную форму. Размер пневмококков 0,5 × 1-1,2 мкм, располагаются они парами (диплококки). В жидких питательных средах часто образуют короткие цепочки, приобретая сходство со стрептококками. Пневмококки неподвижны, не образуют спор, факультативные аэробы. В организме имеют полисахаридную капсулу, которая позволяет легко "типировать" их специфическими антисыворотками. В капсуле содержится термоустойчивое вещество антифагин (защищающий пневмококк от фагоцитоза и действия антител). При росте на искусственных питательных средах пневмококки утрачивают капсулу.
Пневмококки — факультативные анаэробы; капнофилы. Хорошо растут на кровяных или сывороточных средах, дополненных 0,1% глюкозой; температурный оптимум — 37 °С;
оптимум pH — 7,8. На жидких средах дают равномерное помутнение и небольшой хлопьевидный осадок; при длительном культивировании осадок увеличивается. На агаре образуют нежные полупрозрачные, четко очерченные колонии около 1 мм в диаметре; иногда они могут быть плоскими с центральным углублением; подобно прочим стрептококкам колонии никогда не сливаются между собой. Образуют на кровяном агаре колонии с альфа - гемолизом при аэробном культивировании (частичный гемолиз и позеленение среды вокруг колоний) и бета-гемолизом при культивировании в анаэробных условиях. . Для дифференцировки пневмококка от прочих стрептококков используется проба с оптохином (угнетает рост пневмококков); от зеленящих стрептококков пневмококк отличают способность ферментировать инулин, а также чувствительность к желчи (дезоксихолатная проба). Пневмококки относятся к группе нестойких микроорганизмов.
Основной фактор вирулентности пневмококков — капсула, защищающая бактерии от фагоцитоза и действия опсонинов. Некапсулированные штаммы практически авирулентны и встречаются редко. Важное
значение имеет субстанция С — холинсодержащая тейхоевая кислота клеточной стенки, специфически взаимодействующая с С-реактивным белком. Следствием подобного реагирования является активация комплемента и высвобождение медиаторов острой фазы воспаления.
Пневмококки также образуют эндотоксин, гемолизин и лейкоцидин. Вирулентность пневмококков связана также с наличием антифагина.
(Остальные факторы вирулентности перечислены в таблицах, прикрепленных к посту).
Антигенная структура и классификация.
Пневмококк не содержит группового АГ и серологически не однороден. По полисахаридному антигену( капсульному типу) все пневмококки разделяют на 85 сероваров. У взрослых людей серовары 1-8 и 18 являются возбудителями около 80% случаев пневмококковой пневмонии и более 50% летальных исходов пневмококковой бактериемии. У детей наиболее частыми возбудителями являются серовары 6,14,19 и 23.
Эпидемиология
Основной источник заражения - больные и бактерионосители. Путь распространения воздушно-капельный, реже контактно- бытовой. Наиболее восприимчивы лица с иммунодефицитом.
Инкапсулированные штаммы обычно наиболее патогенны. Клетки проникают в альвеолярную ткань нижних дыхательных путей ( в основном), где капсула позволяет клеткам противостоять фагоцитозу и вызывает сильную воспалительную реакцию у хозяина. Мутации или делеции генов, отвечающих за постройку капсулы (находящихся в едином кластере cps-локуса), ведут к появлению некапсулированных штаммов.
Снижение функций легких, переходящее в пневмонию, происходит в результате скопления большого количества клеток и жидкости. Пневмококки могут затем распространяться из очага инфекции как бактериемия, вызывая костные инфекции, инфекции среднего уха и эндокардит. Нелечение инвазивных пневмококковых заболеваний имеет смертность около 30%
Большинство сероваров - нормальные обитатели верхних дыхательных путей, могут вызывать пневмонии, синуситы, отиты, менингиты и другие инфекционные процессы при снижении резистентности макроорганизмов.
Пневмококк — один из основных возбудителей бактериальных пневмоний, регистрируемых вне стационаров (2-4 случая на 1000 человек); ежегодно в мире наблюдают не менее 500 ООО случаев пневмококковых пневмоний (реальная величина значительно больше). Классическая пневмококковая пневмония начинается внезапно; отмечают подъем температуры тела, продуктивный кашель и боли в груди. У ослабленных лиц и стариков заболевание развивается медленно, с незначительной лихорадкой, нарушением сознания и признаками легочно-сердечной недостаточности. У взрослых чаще наблюдают долевые поражения легких; у детей и лиц преклонного возраста доминируют перибронхиальные или очаговые поражения.
В настоящее время существует два вида вакцин, которые отличаются по составу, мишени, иммуногенности и эффективности. Это пневмококковая полисахаридная вакцина 23(PPV3), состоящая из капсульных полисахаридов от 23 разных серотипов (что в совокупности составляет примерно 85-90% всех случаев), и вакцина PCV42. Вакцины рекомендуются пожилым людям, медработникам, лицам с нарушениями иммунитета или высоким риском респираторных заболеваний.
Пневмококки чувствительны ко многим антибиотикам, включая пенициллин. Однако часть патогенных изолятов в данное время проявляет устойчивость к пенициллину. Устойчивость к эритромицину и цефотаксиму так же проявляется во многих штаммах. Каждый патогенный изолят должен быть обязательно проверен на чувствительность к антибиотикам. Довольно распространена пневмония, вызванная антибиотикорезистентным штаммом пневмококков (в США наблюдается около 3000 случаев в год).
По последним данным устойчивость к пенициллину проявляют 14,9-25,7% всех штаммов. К эритромицину: 12-21%. Устойчивость к макролидным антибиотикам происходит по эфлюксному механизму резистентности (низкие уровни резистентности), широко распространена в Северной Америке. Механизм рибосомального метилирования (высокие уровни резистентности) более распространен в Европе.
Бактериоскопический метод:
1)окраска по Граму мазков из патологического материала
2) реакция набухания капсулы с антикапсульными сыворотками: усиление преломления вокруг бактерий - положительный тест на пневмококк.
Бактериологический метод:
Выделение чистой культуры на специальных средах и идентификация по чувствительности к оптохину, по другим биохимическим и серологическим свойствам.
Биологический метод:
Внутрибрюшинное заражение белых мышей материалом от больного с последующим выделением культуры и ее идентификацией. Однако
при смешанной инфекции, вызванной ассоциацией
пневмококков с некоторыми другими условно-патогенными микроорганизмами, например, клебсиеллами, к которым белые
мыши также высокочувствительны, выделить чистую культуру биологическим методом не представляется возможным.
Печатается по решению Центрального координационно-методического совета Казанского государственного медицинского университета.
(Заведующий кафедрой микробиологии д.м.н., профессор О.К.Поздеев, ассистент кафедры микробиологии к.м.н., Е.Р.Федорова.
заведующий кафедрой эпидемиологии Казанского государственного медицинского университета, д.м.н., доцент М.Ш. Шафеев, заведующий кафедрой эпидемиологии Казанской государственной медицинской академии, д.м.н., профессор В.Е. Григорьев.
Пневмококки /O.K. Поздеев, Е.Р. Федорова -Казань: КГМУ,1999. - 14 с.
Методические рекомендации содержат основные сведения о классификации и свойствах пневмококков. Специальные разделы посвящены вопросам лабораторной диагностики, лечения и профилактики пневмококковой инфекции.
Методические рекомендации предназначены для студентов медицинских институтов и университетов.
Копируя, распространяя, публикуя текст либо его часть на своих ресурсах, Вы принимаете на себя ответственность согласно действующему законодательству.
Казанский государственный медицинский университет, 1999
Эпидемиология поражений. Пневмококк — один из основных возбудителей бактериальных пневмоний, регистрируемых вне стационаров (2-4 случая на 1000 человек); ежегодно в мире наблюдают не менее 500000 случаев пневмококковых пневмоний (реальная величина значительно больше). Наиболее подвержены инфекции дети и лица преклонного возраста. Резервуар инфекции — больные и носители (20-50% детей дошкольного возраста и 20-25% взрослых лиц); основной путь передачи — контактный; в период вспышек также воздушно-капельный. Пик заболеваемости приходится на холодное время года. В подавляющем большинстве случаев клинические формы инфекции развиваются при нарушениях резистентности организма (в том числе вследствие холодовых стрессов), а также на фоне иной патологии (серповидноклеточной анемии, болезни Ходжкина. ВИЧ-инфекции, миеломы, сахарного диабета, состояний после спленэктомии и др.) или при алкоголизме. Наибольшее эпидемиологическое значение в патологии у взрослых играют варианты 1, 2 и 3; у детей — 1, 2, 3 и 14 варианты. Вирулентность сероваров в нисходящем порядке — 3, 1, 2, 5, 7 и 8 варианты. К пневмококкам чувствительны белые мыши (при заражении они погибают от септицемии в течение суток ), телята, ягнята, поросята, собаки и обезьяны.
Морфология. Пневмококки неподвижны, они не образуют спор, имеют слегка вытянутую форму, напоминающую контуры пламени свечи. В мазках из клинического материала располагаются парами, каждая из которых окружена толстой капсулой. В мазках с питательных сред могут располагаться короткими цепочками и быть более округлыми. На простых средах образуют тонкую капсулу; её развитие стимулирует внесение крови, сыворотки или асцитической жидкости. Капсулообразование наиболее хорошо выражено у бактерий III типа. При расположении цепочками капсула может быть общей.
между собой. На кровяном агаре образуют мелкие полупрозрачные колонии зеленовато-серого цвета. Центр колоний более темный, периферия светлее. Под колонией и по ее периферии видна зона а-гемолиза в виде зеленоватой обесцвеченной зоны (что обусловлено переходом гемоглобина в метгемоглобин). Колонии пневмококка III типа часто имеют слизистую консистенцию, величина их до 2 мм. Они мутноваты, могу г сливаться между собой. Образуют S- и R-формы колоний. При переходе из S- в R-форму теряют способность синтезировать капсулу. На жидких средах с сывороткой и 0,2% глюкозой дают равномерное помутнение и небольшой хлопьевидный осадок. При длительном культивировании осадок увеличивается.
Устойчивость. Пневмококки относят к группе нестойких микроорганизмов. В сухой мокроте они сохраняются до двух месяцев. Способны длительно сохраняться при низких температурах; при температуре 60 °С погибают в течение 3-5 минут. 3% раствор карболовой кислоты убивает их за 1-2 минуты. На пневмококки губительно действуют оптохин (в концентрации 1:100000) и желчь, что используют для идентификации бактерий.
Пневмококки отличаются от других микроорганизмов по ряду свойств (табл.1).
Таблица 1 Биохимические свойства пневмококков
(+) - 80-89% штаммов положительные;
d - 21-79% штаммов положительные;
(-) - 11-20% штаммов положительные;
«- - 90% или более штаммов отрицательные.
Антигенная структура. У пневмококков обнаружены несколько видов антигенов полисахаридный, 0-соматический антиген, находящийся в клеточной стенке; полисахаридные капсульные К-антигены и М-белок. Полисахаридный соматический антиген аналогичен С-субстанции других стрептококков. Родство обуславливает сходство химической структуры рибиттейхоевых кислот, связанных с холинфосфатом. Капсульные антигены также имеют полисахаридную природу, состоят из повторяющихся в различном сочетании моносахаров: D-глюкозы, D-галактозы и L-рамнозы. По структуре капсульных антигенов пневмококки разделяют на 84 серовара. Следует помнить, что капсульные антигены перекрёстно реагируют с антисыворотками к антигенам стрептококков групп А и В, а также с сыворотками к антигенам клебсиелл и эшерихии. При переходе из S в R-форму капсульные антигены утрачиваются. Для серотипирования пневмококков выпускают групповые сыворотки, обозначаемые латинскими буквами (А, В, С, D и т.д.) и серовариантные, обозначаемые римскими цифрами. Агглютинирующую сыворотку III не включают в смеси сывороток. Её выпускают отдельно и её нельзя разводить. У человека наиболее часто выделяют пневмококки I, II и III серовариантов. Они наиболее вирулентны для человека, поэтому реакцию агглютинации первоначально ставят, используя антисыворотки к этим вариантам. При отрицательном результате реакцию агглютинации ставят со смесью сывороток А, В, С и т.д. (до получения положительного результата), а затем с отдельными антисыворотками. Для более быстрой идентификации сероваров применяют реакцию Нойфельда (иммунного набухания капсулы). Метод основан на способности капсул пневмококков увеличиваться в объёме в присутствии гомологичной антисыворотки, что регистрируют светооптической микроскопией. Капсульные полисахариды обладают сенсибилизирующими свойствами, проявляющимися в развитии реакции гиперчувствительности замедленного типа, выявляемой с помощью кожных проб.
Факторы патогенности. Основным фактором является капсула, защищающая бактерии от микробицидного потенциала фагоцитов и уводящая их от действия опсонинов. Некапсулированные штаммы практически авирулентны и встречаются редко. Большую часть пула противопневмококковых AT составляют AT к Аг капсулы. Важной функцией капсулы и М-белка также является обеспечение адгезии на слизистой. Существенное значение имеет субстанция-С, специфически взаимодействующая с С-реактивным белком. Следствием подобного реагирования являются активация комплементарного каскада и высвобождение медиаторов острой фазы воспаления; их аккумуляция в лёгочной ткани стимулирует миграцию полиморфноядерных фагоцитов. Формирование мощных воспалительных инфильтратов сопровождается нарушением гомеостаза лёгочной ткани и её опеченением. Пневмококки образуют эндотоксин, а- и в-гемолизины (пневмолизины), лейкоцидин. а-пневмолизин является термолабильным белком, способным нейтрализовать 0-стрептолизин,
эритрогенное вещество, нейраминидазу. Пневмококки также синтезируют ряд ферментов, вносящих вклад в патогенез поражений — мурамидазу, гиалуронидазу (способствует распространению микроорганизмов в тканях), пептидазу (расщепляет IgA).
Патогенез поражений. Биотопом пневмококков являются верхние дыхательные пути. Патогенез большинства пневмоний включает аспирацию слюны, содержащей S. pneumoniae, и проникновение бактерий в нижние отделы воздухоносных путей. Существенное значение имеет нарушение защитных дренирующих механизмов — кашлевого толчка и мукоцилиарного клиренса. У взрослых чаще наблюдают долевые поражения лёгких, у детей и лиц преклонного возраста доминируют перибронхиальные или очаговые поражения. Формирование мощных воспалительных инфильтратов сопровождается нарушением гомеостаза лёгочной ткани и её опеченением. Инфекции наиболее вирулентным 3 сероваром могут сопровождаться образованием полостей в паренхиме лёгких. Из первичного очага возбудитель может проникать в плевральную полость и перикард либо гематогенно диссеминировать и вызвать менингиты, эндокардиты и суставные поражения
Клинические проявления. Классическая пневмококковая пневмония начинается внезапно; отмечают подъём температуры тела, продуктивный кашель и боли в груди. У ослабленных лиц и пожилых заболевание развивается медленно, с незначительной лихорадкой, нарушением сознания и признаками лёгочно-сердечной недостаточности. Стрептококковые менингиты регистрируют во всех возрастных группах; они характеризуются бурным началом с подъёмом температуры тела, ригидностью шейных мышц, головной болью, тошнотой и рвотой. Поражения сосудов мозговых оболочек часто сопровождаются потерей сознания; среди детей и в преклонном возрасте летальность может достигать 80%. Довольно часто у лиц с иммунодефицитами (например, ВИЧ-инфицированных) или пациентов со спленэктомией отмечают гематогенные пневмококковые поражения, а также синуситы, мастоидиты, средние отиты, эндокардиты и перитониты. После перенесенного заболевания развивается нестойкий иммунитет, носящий типоспецифический характер и обусловленный появлением антител против типового капсульного полисахарида.
Лечение. Основу терапии пневмококковой инфекции составляют антибиотики — пенициллин, тетрациклин, левомицетин, ванкомицин, рифампицин, цефтриаксон.
пневмококков получены из 90% штаммов, выделенных из крови больных инвазионной пневмококковой инфекции в США и соответствующих штаммам, встречавшимся в России. Иммунизация проводится двукратно с интервалом 5-8 лет.
После вакцинации создается искусственный, активный, типоспецифический иммунитет.
Второй этап исследования. Изучают характер роста на питательных средах. На кровяном агаре колонии пневмококков мелкие, круглые, с ровными
краями, нежные, окруженные зоной позеленения среды (что весьма напоминает рост зеленящих стрептококков). На сывороточном агаре колонии нежные, полупрозрачные и прозрачные. При бактериоскопии мазков, окрашенных по Граму. обнаруживают грамположительные диплококки без капсул. После бактериоскопии колонии, подозрительные на пневмококки пересеивают на скошенный сывороточный или кровяной агар или на сывороточный бульон. При микроскопии мазков со среды обогащения наряду с различной микрофлорой можно обнаружить грамположительные кокки, располагающиеся парами или короткими цепочками. Материал со среды обогащения пересеивают на плотные питательные среды. Посевы инкубируют при 37°С 24 часа.
Третий этап исследования. Па скошенном кровяном агаре пневмококки образуют нежный тонкий полупрозрачный налёт. На сывороточном бульоне пневмококки вызывают помутнение и легкий осадок. В мазках с плотных питательных сред пневмококки могут иметь различный вид. Наряду с диплококками удлиненной формы с заостренными наружными концами, напоминающими пламя свечи, встречают клетки правильной овальной и круглой формы. В бульонной культуре пневмококки часто располагаются цепочками. Па основании морфологических и культуральных свойств пневмококки трудно отличить от зеленящих стрептококков, поэтому для их дифференцировки предложен набор специальных тестов:
•растворимость в желчи (дезоксихолатная проба);
•способность разлагать инулин;
•чувствительность к оптохину;
•реакция агглютинации со специфическими антипневмококковыми сыворотками;
•способность разлагать глюкозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, маннит, сорбит и салицин.
Наиболее доступными методами, дифференцирующими пневмококки от прочих стрептококков являются проба с оптохином (угнетает их рост); от зеленящих стрептококков их отличает способность ферментировать инулин, а также чувствительность к желчи.
Дезоксихолатная проба. После предварительной бактериоскопии в пробирку с 5 каплями стерильной бычьей желчи вносят 10 капель, выделенной чистой культуры (лучше бульонной). Контролем служит культура, внесённая в пробирку с 5 каплями физиологического раствора. Через 30-60 минут инкубации при 37 °С наблюдают полный лизис культуры в виде просветления в пробирке с желчью, в контрольной пробирке смесь остаётся мутной. Следует помнить, что авирулентные культуры пневмококка устойчивы к желчи.
Устойчивость к желчи также можно проверять посевом в 10% желчный бульон. В среду вносят исследуемый материал, при этом бульон мутнеет. После 24 часовой инкубации при 37 °С на наличие пневмококков укажет просветление бульона в результате лизиса бактерий.
Также можно использовать диски, пропитанные 20% раствором желчи. Диски помешают на выросшую культуру в чашке и инкубируют 1-2 часа при 37 °С. При наличии пневмококков колонии лизируются вокруг диска на расстоянии 1 -2 мм.
Проба на инулин. Культуру пневмококка засевают на среду с инулином. Для этого к 100 мл прогретой при 56 °С в течение 30 мин бычьей сыворотки прибавляют 200 мл стерильной дистиллированной воды, 18 мл лакмусовой настойки и 3 г инулина, стерилизуют текучим паром 30 минут. Посевы инкубируют при 37 °С 24 часа. Пневмококк разлагает инулин, в результате чего среда краснеет. Зеленящий стрептококк не вызывает покраснения среды.
Проба с оптохином. Испытуемую культуру пневмококка засевают на сывороточный бульон с оптохином в разведении 1:100000 или 1:200000. Пневмококк на такой среде не растёт. Также можно определить чувствительность к оптохину и посевом на 10% кровяной агар, содержащий оптохин в разведении 1:50000. Контролем является посев культуры на кровяной агар. Пневмококки не растут на среде с оптохином, на контрольной среде наблюдается рост пневмококков. Можно использовать диски, пропитанные 6 мкг оптохина, которые накладывают после посева на поверхность среды. У пневмококков вокруг диска образуется зона задержки роста не менее 18 мм диаметром.
Проба на вирулентность. Суточную культуру пневмококка, выращенную на сывороточном бульоне разводят 1% стерильной пептонной водой (рН - 7,6) или слабощелочным бульоном до 1:10. Разведённую культуру вводят внутрибрюшинно белым мышам весом 16-20 гр в объёме 0,5 мл и наблюдают в течение 72 часов. Из органов погибшей мыши делают высевы на питательные среды и микроскопируют мазки-отпечатки. К высоковирулентным культурам относят пневмококки, вызывающие гибель мышей после введения культуры в разведении 1:10. Авирулентные культуры не вызывают гибели мышей.
нормальной кроличьей сывороткой, а другая — только исследуемую культуру. Содержимое пробирок тщательно встряхивают и ставят на 2 часа в термостат при температуре 37 °С, после чего проводят предварительный учет реакции. Окончательные результаты отмечают после дополнительного выдерживания при комнатной температуре в течение 20 часов. Агглютинацию оценивают на четыре плюса, если содержимое пробирок полностью просветляется, а агглютинационная культура представляет собой плотную пленку, не разбивающуюся при встряхивании; на три плюса если при полном просветлении содержимого пробирки агглютинирующая культура легко разбивается на части; на два плюса — если просветления не наступает, в мутном содержимом пробирки хорошо видны невооруженным глазом частицы агглютинированной культуры; при агглютинации на один плюс в пробирке обнаруживают мелкозернистую смесь склеенных пневмококков. При отрицательной реакции, видимой глазом, агглютинации не наблюдают;
содержимое пробирок после встряхивания представляет собой равномерную муть.
Типирование пневмококков Х-группы проводят с помощью групповых
сывороток, содержащих смесь типовых агглютинирующих сывороток, взятых
в равных объёмах. Готовят следующие групповые сыворотки путем
смешивания равных объемов неразведенных типовых диагностических
сывороток (Lund, I960):
А -1, II, IV, V, XVIII серовары;
В - VI, VIII, XIX серовары;
С - VII, XX. XXIV, XXXI, XL серовары;
D - IX, XI, XVI, XXXVI. XXXVII серовары;
Е - X, XXI. XXXIII, XXXIX серовары;
F - XII. XVII. XXII, XXXVII, XXXII, XLI серовары;
G - XIII, XXV. XXIX, XXXIV, XXXV, XXXVIII, XLII, XLVII серовары;
J - XLIII. XLIV, XLV, XLVI серовары.
Агглютинирующую сыворотку III типа используют per se (без смешивания с другими типовыми сыворотками) из-за трудности ее получения в достаточно высоком титре. Типирование проводят в два приёма: сначала с помощью групповых сывороток, а затем с индивидуальными сыворотками той группы, с которой была получена положительная реакция. Серотипирование пневмококков применяют преимущественно для эпидемиологических исследований результатов специфической серотерапии и серопрофилактики.
Микроагглютинацию пневмококков по методу Сэбина можно получить при смешивании антипневмококковых сывороток с экссудатом из брюшной полости мыши, зараженной мокротой больного. Уже через четыре часа после заражения в экссудате обнаруживают чистую культуру пневмококков, дающую положительную агглютинацию по Сэбину.
Ускоренные методы обнаружения и типирования пневмококков. 1. Метод Нойфельда или феномен набухания капсулы пневмококка. По одному комочку свежевыделенной мокроты больного наносят на три
покровных стекла, к каждому из них прибавляют каплю неразведенной специфической антипневмококковой сыворотки (1, II, III типов) и каплю синьки Лёффлера. Капли тщательно смешивают, покрывают предметным стеклом с лункой, смазанной по краям вазелином. Через две минуты рассматривают висячие капли под микроскопом с иммерсионной системой. При положительном случае видно резкое увеличение капсул пневмококков. При отрицательном результате капсулы едва заветны. Реакция набухания специфична и не даёт положительного результата с другими капсульными бактериями. Её не применяю г для исследования мокроты от больных, леченных сульфаниламидами и антибиотиками, т.к. в этом случае могут выделяться безкапсульные пневмококки.
2. Метод преципитации. 5-10 мл мокроты кипятят в водяной бане до получения плотного сгустка. Сгусток растирают и добавляют небольшое количество физиологического раствора, вновь кипятят несколько минут для извлечения специфического полисахарида из пневмококков. Взвесь центрифугируют, с полученной прозрачной жидкостью и специфическими типовыми сыворотками в преципитационных пробирках ставят реакцию кольцепреципитации. Появление кольца на границе соприкосновения жидкостей указывает на положительный результат.
3. Определение капсул пневмококков по Бурри. На конец предметного стекла наносят каплю исследуемого материала и каплю туши. Смесь перемешивают и делают мазок, высушивают на воздухе и, не фиксируя, микроскопируют. Фон препарата — тёмно-дымчатый, микробные тела и их капсулы не окрашиваются. Препарат, изготовленный по Бурри, можно зафиксировать смесью Никифорова, промыть водой, окрасить фуксином Циля, разведенным 1:3 в течение 3-5 минут. На тёмном фоне мазка выделяются неокрашенные капсулы, внутри которых находятся бактерии ярко малинового цвета (метод Гинса).
Читайте также: