Посев материала по шукевичу

Обновлено: 05.10.2024

Принцип. Под действием фермента плазмокоагулазы активизируется естественная система свертывания крови (плазминогенротромбин).

Приготовление свежей плазмы. Стерильно взятую из сердца кровь кролика в количестве 3 мл вносят в пробирку с 2 мл стерильного 5 % раствора лимоннокислого натрия, смешивают и центрифугируют для осаждения форменных элементов крови в течение 10 минут при 1500 об/мин.

Плазму отсасывают, разводят в 5 раз стерильным физиологическим раствором и разливают в стерильные пробирки по 0,5 мл.

Ход исследования. В пробирку вносят 1 петлю суточной агаровой культуры исследуемого штамма, которую суспензируют в плазме. Штатив с пробиркой помещают в термостат при 37 °С и регистрируют результаты через 1, 2, 4 и 18 часов инкубации.

Оценка результатов. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка любого размера считается положительным результатом реакции. Отсутствие свертывания плазмы в течение 18 часов расценивается как отрицательный результат. В качестве контроля рекомендуется ставить реакцию с заведомо коагулирующим и некоагулирующим штаммами, а также оставлять одну пробирку с плазмой незасеянной.

Поставить тест анаэробного сбраживания маннита культурой стафилококка. Учет результата по демонстрационной пробе.

Для реакции можно использовать среду, приготовленную из сухого агара с индикатором ВР, содержащую маннит (пропись см. ниже). Среду разливают в пробирки по 4,0 мл и стерилизуют. По мере надобности пробирки со средой регенерируют и добавляют по 2,0 мл стерильного вазелинового масла. Когда среда остынет, уколом (до дна) производят посев испытуемой культуры. Пробирки помещают в термостат при 37 град.С на 5 суток. В случае разложения маннита среда приобретает синий цвет по всему столбику агара.

Способность разлагать маннит в аэробных условиях обнаруживается у 94-96% штаммов золотистого стафилококка.

Провести посевы чистой культуры с целью изучения ее биохимических свойств.

При посеве на чашку Петри: чашку берут в левую руку, большим пальцем левой руки слегка приподнимают крышку, обжигают на пламени горелки края чашки в зоне щели, вносят посевной материал на поверхность питательной среды, затем растирают его при помощи стеклянного шпателя или бактериологической петли.

Провести посев материала по Шукевичу. С какой целью он проводится?

Свойства микроорганизмов, учитываемые при выделении культуры

Принципы биологического разъединения бактерий подразумевают учет особенностей жизнедеятельности микробов с целью выбрать наиболее оптимальные методы исследования. Выбранные методы должны соответствовать возбудителю по определенным параметрам.

Тип дыхания. Среди бактерий выделяют группы аэробных и анаэробных представителей. Для получения анаэробных микробов материал для исследования прогревают. Следующий этап – культивирование микроба в анаэробных условиях. Методики получения аэробных и анаэробных бактерий различны.
Спорообразование. Способность некоторых бактерий к спорообразованию обеспечивает защиту и сохранность микроорганизмов.
Устойчивость бактерий к агрессивному воздействию щелочей и кислот. Устойчивость некоторых видов бактерий к данным веществам обеспечивает максимальное очищение исследуемого материала от примеси других бактерий с применением растворов щелочи либо кислоты.
Подвижность бактериальных организмов. Для отделения чистой культуры подвижных микроорганизмов используются методы отделения культур микробов в капле конденсата.
Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам, некоторым химическим веществам и другим антимикробным средствам. Для некоторых возбудителей наиболее предпочтительны методы выделения культур с применением селективных (специфических) питательных сред.
Антибиотики. Очищают материал от дополнительных микроорганизмов.
Способность бактерий проникать сквозь неповрежденные кожные покровы. Это свойство присуще некоторым разновидностям, которые обладают факторами агрессии.
Чувствительность животных к некоторым болезням инфекционного генеза.

Особенности бактериального посева мочи

Анализ, подразумевающий бактериальный посев мочи, предназначается для выявления, идентификации различных микроорганизмов, а также позволяет определить точную их концентрацию. Чтобы провести данную процедуру, мочу, которая является в данном случае основным биоматериалом, помещают в специальную среду питания, которая окажется для нее максимально благоприятной. Если после этого микроорганизмы не начнут расти, результат анализа является отрицательным.

Если же после проведения такого анализа концентрация микроорганизмов в моче окажется достаточно высокой для их размножения, то его результат, бесспорно, положителен.

Методики проведения оценки возбудителя

Для получения чистых культур бактериальных клеток применяется ряд методов. Каждый из них применяется в той или иной ситуации и имеет последовательные четкие этапы получения колоний возбудителя заболевания. Рассмотрим наиболее популярные.

Методика Пастера

Представляет собой разведение чистых культур в среде для бактериального роста (жидкой консистенции) до получения концентрации с 1 клеткой на объем жидкости. Данный метод выделения имеет важнейшее историческое значение.

Методика Коха

Посевы обычно проводят с 3-4 последних разведений, так как бактерий там уже мало. Таким образом, при росте микробов на питательной среде проявляются обособленные колонии микроорганизмов, которые рождаются из единственной материнской клетки. Затем из глубины агара можно выбрать изолированную колонию, и пересеять ее на свежую питательную среду. Следующий этап – идентификация и выделение возбудителя.

Методика Шукевича

Методика Дригальского

Способ Дригальского довольно широко используется в исследовании биологического материала путем разведения культур в пробирке с бульоном либо с физиологическим раствором.

Следующий этап: одну каплю полученного раствора при помощи стерильного шпателя из стекла распределяют равномерно по поверхности среды питания в 1-ой чашке. Потом, не прожигая шпатель на огне, делают им же посев на 2-ой и 3-ей чаше. Суть метода Дригальского заключается в том, что с каждым последующим посевом культур концентрация бактерий (аэробов) все меньше. На 3-ей чашке они распределяются довольно обособленно, каждая бактериальная клетка при этом дает клональные клетки (в виде изолированной колонии). Их пересевают на скошенный агар для накопления возбудителей.

Методика Вейнберга

Определенные затруднения вызывает выделение чистых культур анаэробных возбудителей, если микроорганизмы не гибнут при контакте с кислородными молекулами. Суть методики заключается в выведении анаэробных микробов (в составе материала) в слегка остывшей (45-50°С) расплавленной среде питания (агарозированной). Проводят 6-10 разведений. Затем идет следующий этап: необходимо быстро охладить состав в пробирке и залить ее поверхность смесью из масла вазелина и парафина, что препятствует проникновению воздуха и способствует развитию анаэробных условий.

При благоприятном посеве прорастают изолированные колонии на второй день, которые можно извлечь из пробирки путем ее нагревания при помощи горелки. Из разрезанного агарового столбика петлей набирают культуры для дальнейшего исследования. Полученные колонии размещают в жидкую питательную среду, на чем этапы выделения колонии анаэробных возбудителей можно завершить.

Методика Хангейта

Ее часто применяют для выделения аэробных микробов, обладающих высокой кислородочувствительностью. В проведении такого выделения культуры аэробов применяется методика вращения пробирок.

Методы засевания аэробных бактерий предполагают выведение их на агаризированной расплавленной среде. Наличие инертного газа в пробирке дает возможность вырастить изолированные колонны аэробных бактерий таким образом, что выделенные культуры аэробов хорошо можно увидеть даже невооруженным глазом на 2-3 день.

Микроманипулятор

Это методика выделения отдельных бактериальных клеток путем применения микроманипулятора. Микроманипулятор представляет собой специальный прибор, которым можно выловить из суспензии одну клетку, а также обеспечить возможность посева культуры в пробирку.

Дальнейшая идентификация возбудителя проводится с учетом всех перечисленных свойств возбудителя (аэробов и анаэробов), а также особенностей их взаимодействия с различными веществами.

Метод Дригальского: этапы выделения чистой культуры и ее идентификации

Методы выделения чистых культур аэробных бактерий

Механического разобщения Биологические

Метод Пастера Метод Коха Биологический Физический

(имеет историческое (пластинчатых

значение) разводок) Химический Метод Щукевича

Посев петлей Посев шпателем

Методы выделения чистых культур (схема 11):

Методы механического разобщения основаны на разъединении микробов путем последовательного растирания исследуемого материала по поверхности агара.

а) Метод Пастера – имеет историческое значение, предусматривает последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде методом переката

б) Метод Коха – метод пластинчатых разводок – основан на последовательном разведении исследуемого материала мясо-пептонным агаром с последующей разливкой пробирок с разведенным материалом в чашки Петри

в) Метод Дригальского – при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой, используют 2–3 чашки для последовательного посева шпателем.

г) Посев петлей параллельными штрихами.

Биологические методы основаны на биологических свойствах возбудителей.

а) Биологический – заражение высокочувствительных животных, где микробы быстро размножаются и накапливаются.

В одних случаях, этот метод является единственным, позволяющим выделить культуру возбудителя от больного человека (например, при туляремии),в других случаях – он более чувствителен (например, выделение пневмококка на белых мышах или возбудителя туберкулеза на морских свинках).

б) Химический – основан на кислотоустойчивости микобактерий. Для освобождения материала от сопутствующей флоры, его обрабатывают раствором кислоты.

Вырастут только туберкулезные палочки, так как кислотоподатливые микробы погибли под действием кислоты.

в) Физический метод основан на устойчивости спор к нагреванию. Для выделения культуры спорообразующих бактерий из смеси материал прогревают при 80°С и засевают на питательную среду. Вырастут только споровые бактерии, так как споры их остались живыми и дали рост.

г) Метод Щукевича – основан на высокой подвижности вульгарного протея, способного давать ползучий рост.

Методика пересева из колоний на скошенный агар и МПБ:

а) Пересев из колоний на скошенный агар

Приоткрывают крышку чашки, прокаленной остуженной петлей снимают часть отдельной колонии, открывают пробирку со стерильным скошенным агаром, держа ее в левой руке в наклонном положении, так, чтобы можно было наблюдать поверхность среды.

Переносят петлю с культурой в пробирку, не прикасаясь к стенкам, растирают по питательной среде, скользя по поверхности от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи до верхушки среды – посев штрихом. Пробирку закрывают и, не выпуская из рук, подписывают название посеянного микроба и дату посева.

б) Пересев из колонии на мясо-пептонный бульон

Техника пересева на МПБ в основном такая же, как и при посеве на плотную среду.

При посеве на МПБ петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый стерильной пастеровской или градуированной пипеткой, вливают в питательную среду.

В результате самостоятельной работы студент должен знать:

Методы выделения чистой культуры микроорганизмов

2. Методы культивирования микроорганизмов

1. Навыки соблюдения правил противоэпидемического режима и техники безопасности

Обеззараживать материал, проводить обработку рук

3. Приготовить препараты из колоний бактерий

4. Микроскопировать колоний

5. Окрашивать по Граму микроорганизмы

Методы выделения чистых культур (продолжение). Ферментативная активность бактерий и методы ее изучения.

Коварная кишечная палочка

Наглядным примером использования бактериальных культур в медицине может стать кишечная палочка. С одной стороны, микроорганизмы группы кишечной палочки постоянно присутствуют в организме человека и животных, т.е. являются частью нормальной микрофлоры кишечника. С другой стороны, некоторые штаммы могут не только представлять опасность для здоровья, но и привести к смертельному исходу у людей с ослабленным иммунитетом (старики, маленькие дети).

тяжелых пищевых отравлений;
диареи;
перитонита (при попадании в брюшную полость через разрыв в кишечнике);
бактериального простатита;
менингита у новорожденных и т.д.

Важной задачей является определение типа кишечной палочки и количества этих бактерий в организме человека. Для этого берутся анализы мочи, кала, мазок из влагалища, гноя, рвотных масс

Кроме того, микробиология научилась использовать свойства кишечной палочки для определения загрязнения окружающей среды. Дело в том, что кишечная палочка выводится из организма человека и животных вместе с фекальными массами. В случае попадания стоков в водоемы есть риск появления патогенных бактерий в обычной водопроводной воде, что может привести к серьезным эпидемиям.

Бактериальные культуры: чистые против смешанных

В микробиологии культурой бактерий называют популяцию микроорганизмов, растущую на питательной среде, которая используется в научных и медицинских целях. Различают:

Чистая культура используется:

в научных исследованиях;
при диагностике инфекционных заболеваний;
как исходный материал для производства вакцин, ферментов, антибиотиков, витаминов, гормонов и др.;
в промышленном производстве (молочнокислые закваски, пивные и обычные дрожжи и т.д.).

Несмотря на то что выведение чистых культур стало мощным толчком в развитии микробиологии (и до сих пор является ее основным инструментом), смешанные культуры дают более полную картину окружающего мира, так как в природе скопления бактерий одного и того же вида обязательно контактируют с различными микроорганизмами, находящимися по соседству

Особую важность определение смешанной культуры приобретает в медицине, при исследовании взаимодействия различных инфекций с микрофлорой организма

То есть определение заболевания основано на выведении чистых культур, а для полного изучения болезни в развитии необходимо исследовать смешанные культуры.

Бактериологическое исследование качества и безопасности колбасных изделий.

При бактериологическом исследовании колбас определяют: общее количество микроорганизмов в 1 г продукта; характер микрофлоры; наличие бактерий группы кишечной палочки, сальмонелл, протея, анаэробов.

Пробы, отобранные для бактериологического исследования, обрабатывают следующим образом.

Колбасные изделия в оболочке помещают на металлическую тарелку, которую тщательно протирают тампоном, смоченным спиртом, и обжигают над факелом. Затем батоны разрезают продольно стерильным (фламбированным) ножом или скальпелем на две половинки, не рассекая противоположной стороны оболочки батона. Пробу снимают путем соскоба или среза фарша с обеих половинок всей поверхности разрезанного батона.

При исследовании поверхности продукта отбирают с различных участков образца 2—3 пробы (толщина среза 0,2— 0,5 см). Пробу с поверхности продукции без оболочки можно отобрать путем смыва. Для этого используют стерильные тампоны, смоченные стерильной водой; смыв производят 2—3 раза с различных участков поверхности образца.

Из отобранных проб (срезов или смывов) составляют среднюю для каждого образца отдельно. Средние пробы переносят в предварительно взвешенные стерильные бюксы, которые затем вновь взвешивают; по разнице массы определяют массу взятого образца.

Массу образца можно определять и объемным методом. Для этого используют специально подготовленные пробирки, на стенке которых, на уровне 10 мл жидкости, наносят черту (нарезка алмазом). В пробирки наливают 8 мл физиологического раствора или воды и стерилизуют. Соблюдая стерильность, небольшие кусочки пробы вносят в пробирки в количестве, обеспечивающем подъем налитой жидкости до нанесенной черты (по нижнему мениску).

Взвешенную пробу переносят в стерильную ступку и тщательно растирают, добавляя стерильный физиологический раствор или стерильную воду с расчетом разведения материала в соотношении 1 : 10.
Пробы продуктов плотной консистенции растирают в ступке, добавляя небольшое количество стерильного песка. При растирании проб вареных изделий мажущейся консистенции (ливерные колбасы и др.) стерильный песок можно не добавлять.

Общее количество микроорганизмов в 1 г продукта. Стерильной градуированной пипеткой берут 0,2 мл из верхнего слоя жидкости и переносят на середину дна стерильной чашки Петри. Затем в нее наливают 12—15 мл расплавленного и охлажденного до 45—50 °С мясо-пептонного агара. Осторожно покачивая чашку, внесенный материал смешивают со средой и равномерно распределяют по всей поверхности. Чашки с посевами помещают в термостат при 37 °С.

Через 48 ч чашки вынимают из термостата и подсчитывают число колоний (в глубине и на поверхности среды). Для определения количества микробов в 1 г продукта общее число колоний умножают на 5 и на степень разведения.

Характер микрофлоры. 0,1 мл взвеси наносят на поверхность мясо-пептонного агара, застывшего в чашках. Внесенную жидкость стерильным стеклянным шпателем равномерно распределяют по всей поверхности среды. Чашки с посевами помещают в термостат при 37 °С.

Через 24 ч чашки с посевами вынимают из термостата и определяют характер микрофлоры, просматривают колонии при помощи лупы или под малым увеличением микроскопа. Из колоний, подозрительных на кишечную палочку или патогенную микрофлору, приготавливают мазки и окрашивают их по Граму.

Бактерии группы кишечной палочки и сальмонеллы. 0,1 мл взвеси наносят на поверхность элективной среды (Эндо или Левина), застывшей в чашках. Внесенную жидкость равномерно распределяют по всей поверхности среды. Чашки с посевами помещают в термостат при 37 °С.

Через 24—36 ч чашки с посевами вынимают из термостата и просматривают посевы для того, чтобы определить наличие бактерий группы кишечной палочки и сальмонелл. На фуксинсульфитном агаре (среде Эндо) бактерии группы кишечной палочки образуют темно-красные колонии с металлическим блеском; паратифозные бактерии — круглые прозрачные или полупрозрачные с голубоватым оттенком.
На среде Левина бактерии группы кишечной палочки образуют черные колонии, окруженные светлой зоной или ободком; паратифозные бактерии растут в виде прозрачных нежно-розовых или розовато-фиолетовых колоний.

Из подозрительных колоний приготовляют мазки, окрашивают их по Граму и исследуют на подвижность. Дальнейшую идентификацию бактерий этой группы проводят в соответствии с действующим ГОСТом.

Присутствие протея. Посев материала выполняют по методу Шукевича. 0,1 мл взвеси или небольшой кусочек подготовленной пробы вносят в конденсационную воду скошенного мясо-пептонного агара, не касаясь поверхности среды, и помещают в термостат при 37 °С.

Через 18—24 ч посевы просматривают. Обращают внимание на образование ползучего вуалеобразного налета с голубоватым оттенком. Наличие палочки протея подтверждают микроскопией посева и обнаружением грамотрицательных, активно подвижных палочек.

Присутствие анаэробов. 2—3 мл взвеси вносят в две пробирки с предварительно прокипяченным и быстро охлажденным до комнатной температуры печеночным бульоном (налитым на 2/3 высоты пробирки). Перед помещением в термостат одну из пробирок вновь прогревают при 80 °С в течение 20 мин.

Посевы инкубируют 5 сут при 37 °С. При просмотре посевов обращают внимание на помутнение, газообразование или другие изменения в печеночном бульоне. При подозрении на наличие микробов посев микроскопируют и делают пересев в расплавленный и охлажденный до 50 °С мясо-пептонный агар, добавляя 2 % глюкозы. Агар налит в пробирку на 2/3 ее высоты. По образованию колоний в глубине этой среды и по газообразованию судят о наличии анаэробной микрофлоры, идентификацию которой проводят в соответствии с действующим ГОСТом.

метод выделения чистой культуры протея, основанный на его способности перемещаться по поверхности скошенного агара из конденсационной жидкости, в которую засеян исследуемый материал.

1. Малая медицинская энциклопедия. — М.: Медицинская энциклопедия. 1991—96 гг. 2. Первая медицинская помощь. — М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. — М.: Советская энциклопедия. — 1982—1984 гг .

Смотреть что такое "Шукевича метод" в других словарях:

Шукевича метод — метод выделения чистой культуры протея, основанный на его способности перемещаться по поверхности скошенного агара из конденсационной жидкости, в которую засеян исследуемый материал … Большой медицинский словарь

ТУБЕРКУЛЕЗ У ЖИВОТНЫХ — ТУБЕРКУЛЕЗ У ЖИВОТНЫХ. Возбудителем Т. животных являются разновидности палочки Коха: у млекопитающих преимущественно typ. bovinus, у птиц typ. gallinaceus, в отдельных случаях встречается и typ. humanus. Среди млекопитающих Т. наиболее… … Большая медицинская энциклопедия

Посевы бактериологические — нанесение (внесение) петлей, пипеткой или др. инструментом содержащего бактерии материала на (в) питательные среды в целях выделения чистой к ры, ее накопления, хранения, а также определения количества и многообразных св в (см. Бактериологический … Словарь микробиологии

Читайте также: