Посев молока на клостридии

Обновлено: 19.09.2024

Клостридии (Clostridium difficile) бактерии, в норме присутствующие в толстом кишечнике, но которые при терапии антибиотиками могут вызвать псевдомембранозный колит.

Заболевание без специфической терапии часто заканчивается летальным исходом. Это обусловлено особенностями Clostridium difficile: токсикогенные штамы образуют летальный эндотоксин А и цитотоксин В. Первый вызывает кровоизлияние и выделение жидкости в кишечник, второй поражает клетки.

Псевдомембранозный колит возникает в результате бурного размножения этих микробов при дисбактериозе - подавлении нормальной микрофлоры кишечника, обусловленном применением (даже кратковременным) антибиотиков широкого спектра действия - клиндамицина, ампициллина, цефалоспоринов и аминогиликозидов.

Причиной может быть и химиотерапия. Заболевание характеризуется острым началом, болями в животе, обильным зеленоватым поносом с резким гнилостным запахом и примесью крови. Температура повышается до 39,5°С и выше. Быстро нарастает обезвоживание, может развиться гиповолемический шок. В крови значительный лейкоцитоз, снижение количества альбуминов.

Дифференциальный диагноз необходимо проводить со стафилококковым энтероколитом, который также может возникать при проведении антибиотикотерапии. Он также протекает тяжело и по клиническим проявлениям может напоминать клостридиозный колит. Диагноз базируется на отрицательных результатах исследований на клостридиоз.

Выделяемые возбудители: Clostridium difficile.

Обращаем внимание на необходимость предварительного приобретения стерильной пробирки с питательной средой, используемой при взятии биоматериала, в любом медицинском офисе ИНВИТРО.

Беда в том, что явление распространяется все шире. В пробах молока, которые берутся для анализа Ассоциацией животноводов (Apa) провинции Парма, доля положительных тестов на клостридии выросла с 9,0% в 1991 году до 23,54% в 2001 году. В 2003 году значение показателя превысило 30%. Последние данные по Области Ломбардия (2006 год) также отчетливо указывают на общее ухудшение ситуации.

Клостридии – это бактерии, которые развиваются в анаэробной среде (без воздуха), образуя вокруг себя защитную капсулу, позволяющую им поддерживать жизнедеятельность в грунте в течение ряда лет. Они устойчивы к высоким температурам (а значит – к пастеризации) и к распространенным дезинфицирующим препаратам.

Использование силосованного корма (фураж, который хранится в условиях отсутствия воздуха) является главной причиной развития клостридий в молоке. В случае применения традиционных кормов (на основе трав и сена) в молоке насчитывается менее 200 спор клостридий на литр. Если же речь идет о кормах на основе силоса, их может быть более 2000.

Недостаток методики в том, что земля и пыль, которые примешиваются к фуражу, в итоге попадают в состав корма, а там, благодаря воде, крахмалу и сахарам, как раз и начинают развиваться клостридии.

Речь идет о решениях, которые применимы только при определенном уровне технологичности производства и при условии глубокой переработки молока. Однако, несмотря на все перечисленные меры, проблема клостридий, обусловленная все более промышленной организацией питания животных, неуклонно обостряется.

22.5. Санитарно-микробиологические исследования молока и молочных продуктов 22.5.1. Метод определения промышленной стерильности

Этот метод основан на способности микроорганизмов, вы­державших стерилизацию, размножаться в стерилизованном молоке при оптимальных режимах термостатирования и вызы­вать в нем органолептические и физико-химические измене­ния.

Отобранные банки со сгущенным стерилизованным моло­ком выдерживают в термостате при 37±1 °С в течение 6 сут. По истечении этого срока банки с продуктом охлаждают до 20±5 °С и проводят внешний осмотр. При наличии вздутия крышки или донышка, не опадающего при нажатии пальцами, банку с продуктом считают бомбажной.

Банки без внешних дефектов вскрывают, сгущенное стери­лизованное молоко анализируют органолептически, по пока­зателям титруемой кислотности и микроскопически.

В сгущенном стерилизованном молоке после термостатиро­вания не должно быть органолептических и физико-химичес­ких изменений, а в микроскопическом препарате не должно отмечаться бактериальных клеток.

Определение количества мезофильных аэробных и факульта­тивно-анаэробных микроорганизмов. Метод основан на способ­ности мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов размножаться на плотном питательном агаре при 30±1 °С в течение 72 ч.

Количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного микробного обсеменения.

Для определения количества мезофильных аэробных и фа­культативно-анаэробных микроорганизмов выбирают те разве­дения, при посевах которых на чашках вырастает не менее 30 и не более 300 колоний. Каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1 см3 в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой и залито 10–15 см 3 расплавленной и охлажденной до температуры 40–45 °С питательной среды для определения количества мезофильных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

Допускается посев исследуемого продукта на чашки Петри из одного и того же разведения в количестве 1 и 0,1 см 3 . Сразу после заливки агара содержимое чашки Петри тщательно пере­мешивают путем легкого вращательного покачивания для рав­номерного распределения посевного материала.

После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в термостат с температурой 30±1 °С на 72 ч.

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке, поместив ее вверх дном на темном фоне, пользуясь лупой с увеличением в 4–10 раз. Каждую подсчитанную ко­лонию отмечают на дне чашки чернилами. При подсчете ко­лоний рекомендуется пользоваться счетчиками.

При большом числе колоний и равномерном их распреде­лении дно чашки Петри делят на четыре и более одинаковых секторов, подсчитывают число колоний на двух-трех секторах (но не менее чем на Уз поверхности чашки), находят среднее арифметическое число колоний и умножают на общее количе­ство секторов всей чашки. Таким образом находят общее ко­личество колоний, выросших на одной чашке.

Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэ­робных микроорганизмов в 1 см 3 или 1 г продукта (Х) в единицах вычисляют по формуле:

где n – количество колоний, подсчитанных на чашке Петри; m – число десятикратных разведений.

22.5.2. Определение бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

Метод основан на способности БГКП (цитробактер, энтеробактер, клебсиелла, серация) сбраживать в питательной сре­де лактозу с образованием кислоты и газа при 37±1 °С в течение 24 ч.

По 1 см 3 соответствующих разведений продукта засевают в пробирки с 5 см 3 среды Кесслера (рецепт 120). Посев 10 см 3 пастеризованного молока, 10 см 3 закваски на чистых культу­рах, 3 см3 кефирной закваски или 10 см 3 разведения 1:10 сгущенного молока и сливок с сахаром, какао и кофе со сгущенным молоком и сахаром в потребительской таре произ­водится в колбочки с 40–50 см 3 среды Кесслера.

Пробирки или колбы с посевами помещают в термостат при 37±1 °С на 18–24 ч. При исследовании мороженого пробирки с посевом выдерживают в термостате при 37±1 °С в течение 48 ч.

Просматривают пробирки или колбы с посевами. При от­сутствии газообразования в наименьшем из засеваемых объ­емов дают заключение об отсутствии в нем БГКП.

При наличии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов считается, что в нем обнаружены БГКП.

22.5.3. Определение Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах

Метод определения S. aureus с предварительным обогащением основан на высеве навески продукта и разведении его в жидкой селективной среде, инкубировании посевов, учете положительных пробирок (колб), пересеве на плотные селективные среды с последующим подтверждением принадлежности выросших колоний к S. aureus.

Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см 3 в пробирки или колбочки с солевым бульоном (рецепт 15).

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением и питательной средой 1:10. Пробирки и колбочки с посевами выдерживают в термо­стате при температуре 37±1 °С в течение 24 ч.

Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, вы­росших на солевом бульоне, к S. aureus делают пересев петлей из бульона для получения изолированных колоний на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрда–Паркера (ре­цепт 156), желточно-солевой агар или мол очно-солевой агар (рецепты 80, 81).

Чашки с посевами выдерживают в термостате при темпера­туре 37±1 °С в течение 24–48 ч. После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний.

На желточно-солевом агаре колонии S. aureus имеют форму плоских дисков диаметром 2–4 мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг ко­лоний образуются радужное кольцо и зона помутнения среды.

На мол очно-солевом агаре колонии S. aureus растут в виде непрозрачных, слегка выпуклых, круглых окрашенных коло­ний диаметром 2–4 мм.

На среде Байрда–Паркера колонии S. aureus растут в виде черных блестящих выпуклых колоний диаметром 1–1,5 мм, окруженных зоной просветления среды шириной 1–3 мм.

С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характер­ных колоний и пересеивают на поверхность скошенного пита­тельного агара, но без добавления хлористого натрия и жел­точной эмульсии. Посевы выдерживают в термостате при тем­пературе 37±1 °С в течение 24 ч. У выросших колоний опре­деляют отношение к окраске по Граму и коагулированию плаз­мы кролика (см. гл. 6, 9).

Результаты оценивают по каждой пробе отдельно. Морфо­логические, культуральные свойства и положительная реакция плазмокоагуляции свидетельствуют о присутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной массе продукта.

Метод определения количества S. aureus без предварительного обогащения основан на высеве продукта или его разведения на поверхность плотной среды, инкубировании, подсчете типич­ных колоний с последующим подтверждением выросших ко­лоний по плазмокоагулирующей способности.

1 см 3 жидкого продукта или его разведения наносят на поверхность питательных сред в 3 чашки Петри, тщательно растирают шпателем по поверхности питательной среды. Посевы инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 24–48 ч. Чашки Петри с посевами инкубируют дном вверх.

После термостатирования подсчитывают количество харак­терных колоний на каждой чашке Петри. С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных и(или) подозри­тельных колоний S. aureus, а в случае роста менее пяти – все колонии пересевают на поверхность скошенного питательного агара, разлитого в пробирки, но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии. Пробирки с посевами выдер­живают в термостате при температуре 37±1 °С в течение 24 ч.

У выросших культур определяют отношение к окраске по Граму и коагулирование плазмы кролика. Результаты оценива­ют по каждой пробе отдельно.

Если при изучении характерных колоний в 80 % случаев, т.е. не менее чем в 4 из 5 колоний, подтвержден рост S. aureus, то считают, что все типичные колонии, выросшие на чашках Петри, принадлежат к этому виду. В остальных случаях коли­чество S. aureus определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

Количество колоний S. aureus в 1 г или 1 см 3 после опре­деления его в определенной навеске продукта вычисляют по формуле

где Σn1, Σn2– количество колоний, выросших на всех чашках Петри в пределах одного разведения или засеянного объема; n – число десятикратных разведений.

Определение сальмонелл, бактерий L. monocytogenes, дрожжей и плесневых грибов в молоке и молочных продуктах изложены в общих требованиях к проведению микробиологического контроля пищевых продуктов.

4.3; 4.6; 4.7.1; 4.7.2; 4.7.3

6. ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2010 г.

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта сульфитредуцирующих клостридий и два метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и метод посева в агаризованную среду.

Методы основаны на высеве определенного количества продукта и (или) его разведений в железосульфитсодержащие среды, инкубировании посевов при (37±1) °С не более 72 ч, подтверждении принадлежности выросших микроорганизмов по культуральным, морфологическим и биохимическим признакам к сульфитредуцирующим клостридиям.

Метод определения количества сульфитредуцирующих клостридий посевом в агаризованную среду предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г более 150 или в 1 см более 15 сульфитредуцирующих клостридий.

Метод определения НВЧ предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г менее 150, но в 10 г более 3 или в 1 см менее 15, но в 100 см более 3 сульфитредуцирующих клостридий.

Требования настоящего стандарта являются обязательными.

1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ

Отбор и подготовка проб пищевых продуктов - по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669.

2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ

Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104* с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и пределом допускаемой погрешности ±2 мг (для взвешивания реактивов);

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и пределом допускаемой погрешности ±10 мг (для взвешивания продукта);

микроскоп световой биологический, обеспечивающий увеличение 900-1000:

стекла предметные по ГОСТ 9284;

стекла покровные по ГОСТ 6672;

железа (III) цитрат (СНОFе·5НО);

железа (III) аммония цитрат СНОFе·CHO(NH) или СНОFе·CHONH;

железо треххлористое, 6-водное (FeCl·6НО).

3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

3.1. Приготовление растворов и реактивов

3.1.1. Раствор сульфата железа (FeSO) концентрацией 80 г/дм: 8,0 г сульфата железа переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки. При использовании соли в виде кристаллогидратов проводят соответствующий пересчет на безводную соль.

3.1.2. Раствор аммония железа (III) сульфата Fe(NH)(SO)·12НО концентрацией 50 г/дм: 5,0 г аммония железа (III) сульфата переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.

3.1.3. Раствор железа (III) аммония цитрата концентрацией 50 г/дм: 5,0 г железа (III) аммония цитрата переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.

3.1.4. Раствор железа треххлористого (FeCl·6HO) концентрацией 80 г/дм: 8,0 г железа треххлористого гексагидрата переносят в колбу вместимостью 100 см, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.

3.1.5. Раствор сульфита натрия (натрия сернистокислого), концентрацией 100 г/дм: 10,0 г натрия сернистокислого переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.

3.1.6. Растворы, приготовленные по пп.3.1.1-3.1.5, стерилизуют текучим паром в течение 1 ч.

3.1.7. Раствор железа (III) цитрата (СНОFе·5НО) концентрацией 50 г/дм: 5,0 г железа (III) цитрата пентагидрата переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки. Раствор стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670.

3.1.8. Растворы и реактивы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1.

3.1.9. Растворы и реактивы для окраски бактериальных спор готовят по ГОСТ 10444.1.

3.1.10. Реактив для определения каталазы готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2. Приготовление питательных сред

3.2.1. Голодный агар готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2.2. Мясную воду готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2.3. Мясо-пептонный агар (бульон) с 0,1% глюкозы и дрожжевым экстрактом готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2.4. Среду из сухого питательного агара с глюкозой готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2.5. Железосульфитная среда: к 1 дм дистиллированной воды добавляют 10,0 г триптона, 0,5 г сульфита натрия, 0,5 г железа (III) цитрата, 15,0 г агара (при приготовлении агаризованной среды) или 1,5 г агара (при приготовлении вязкой среды). Растворяют компоненты при нагревании, после этого смесь охлаждают до (50±5) °С. Устанавливают рН среды таким образом, чтобы он составлял (7,1±0,1) (в пересчете на (25±1) °С). Среду разливают в пробирки по 10-12 см или колбы и стерилизуют при (121±1) °С в течение 15 мин.

Триптон может быть заменен на равноценную навеску сухого панкреатического гидролизата казеина или на десятикратный объем жидкого панкреатического гидролизата казеина, а триптон и 1 дм воды могут быть заменены на 1 дм мясной воды, приготовленной по п.3.2.2.

3.2.6. Триптозо-сульфит-циклосериновый агар готовят по ГОСТ 10444.9.

3.2.7. Дифференциальная улучшенная клостридиальная среда: в 800 см воды вносят 10,0 г пептона, 1,5 г дрожжевого экстракта или 7,5 см дрожжевого экстракта, приготовленного по ГОСТ 10444.1, 5,0 г уксуснокислого натрия. Отдельно 1,0 г растворимого крахмала вносят в небольшую порцию воды и при непрерывном помешивании переносят в кипящую воду, доводя объем до 200 см и получая крахмальный клейстер. Полученный клейстер смешивают с 800 см смеси, содержащей остальные компоненты, добавляют 15,0 г агара при приготовлении плотной среды или 1,5 г агара при приготовлении вязкой среды и кипятят 30 мин. Доводят объем среды до 1 дм, добавляют 1,0 г глюкозы и 0,5 г -цистеина гидрохлорида, охлаждают среду до (50±5) °С. Устанавливают рН таким образом, чтобы он составлял (7,1±0,1) (в пересчете на (25±1) °С). Среду разливают мерно в колбы и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 15 мин. Перед использованием к 100 см среды добавляют 0,4 см раствора сульфита натрия, приготовленного по п.3.1.5, и 2 см раствора железа (III) цитрата, приготовленного по п.3.1.7. При необходимости среду разливают в пробирки по 10-12 см.

3.2.8. Среда Вильсон-Блера (агаризованная), измененная для анаэробов: к 1 дм стерильного, расплавленного и охлажденного до (80±1) °С мясо-пептонного агара, приготовленного по п.3.2.3, или среды, приготовленной по п.3.2.4, добавляют 10 см раствора сульфита натрия, приготовленного по п.3.1.5, и 1 см раствора аммония железа (III) сульфата, приготовленного по п.3.1.2. Среду хранят в защищенном от света месте при (6±2) °С не более 7 сут.

В компании я работаю с 2018 г. В мои обязанности входят: технологическая поддержка по силосованию и использованию силосных инокулянтов, проведение опытов, сотрудничество с университетами и научными институтами, занимающимися исследованиями в области силосования кормов во всем мире.

Силос занимает основную часть в рационе крупного рогатого скота. Это продукт микробного брожения, и в зависимости от того, какие микроорганизмы, желательные или, наоборот, патогенные, доминировали в процессе силосования, конечный продукт будет улучшать производство молока или мяса, или ухудшать здоровье и увеличивать производственные затраты. Кроме того, все виды микроорганизмов, которые содержатся в силосе на момент его кормления будут найдены в последствии в конечных продуктах, например, молоке. Поэтому очень важно уметь приготовить силос отличного качества, не несущий риск для здоровья животных и, в конечном счёте, для людей.

Уверен, наша рубрика будет для Вас очень полезна.

Цикл перемещения Клостридий


Клостридии (лат. Clostridium spp.) — род грамположительных, облигатно анаэробных бактерий, способных продуцировать эндоспоры. Благодаря этому, они обладают исключительной способностью к выживанию и в состоянии пройти весь цикл от попадания в корм до конечного продукта молочной переработки, сыра.

В чем опасность Клостридий?

Вред, наносимый Клостридиями, многосторонний. В зависимости от вида Клостридии могут вызывать порчу (позднее вспучивание) сыров, силоса (масляно-кислое брожение), расстройства функций желудочно-кишечного тракта и воспаления у животных вплоть до летального исхода.

Успешное силосование для предотвращения Клостридий

Силос является основным источником попадания Клостридий в организм коровы и впоследствии в молоко. Силос — это конечный продукт брожения растительного сырья. Поэтому первостепенной задачей успешного силосования является быстрое понижение рН до этого критического уровня, который достигается, в первую очередь, за счёт синтеза молочной кислоты молочнокислыми бактериями. При оптимальных условиях получается силос с преобладанием молочной кислоты в конечных продуктах брожения.


Как Клостридии попадают в силос, и профилактические меры

Споры Клостридий попадают в почву и при уборке вместе с почвой на растения. В результате мы искусственно обсеменяем материал для силосования патогенными микроорганизмами и отдаём им контроль над брожением.

Зная эти причины, легко выработать мероприятия по профилактике во время уборки: Подвяливание массы до оптимальной влажности и недопущение загрязнения почвой за счёт регулирования высоты среза, правильной установкой техники для кошения, использование инокулянтов.

Молочнокислые бактерии против Клостридий

Читайте полную статью о Клостридиях и способах их предотвращения по ссылке ниже

Читайте также: