Посев на хеликобактер инвитро

Обновлено: 04.07.2024

Когда нужно сдавать анализ Хеликобактер, ДНК (Helicobacter pylori, ПЦР) кал, кач.?

Для диагностики заболеваний, вызываемых H. pylori;
С целью контроля эффективности эрадикации хеликобактерной инфекции.

Подробное описание исследования

Исследование позволяет определить ДНК Helicobacter pylori. Проводится методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Используется для дифференциальной диагностики заболеваний, вызываемых Helicobacter pylori.

H. pylori — грамотрицательная бактерия спиралевидной формы, активно функционирующая в кислой среде желудка. Возбудитель продуцирует аммиак, который делает его устойчивым к желудочному соку и позволяет разрушать слизистый барьер, что в последующем приводит к ульцерогенезу. Хеликобактерная инфекция ассоциирована с такими патологиями желудочно-кишечного тракта, как гастрит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, аденокарцинома и недифференцируемая лимфома желудка.

Инфицирование Helicobacter pylori является основной причиной хронического гастрита и язвенной болезни; также эпидемиологические исследования, проведенные в последние годы, подтвердили связь персистирующей инфекции с повышенным риском возникновения рака желудка. Кроме того, эта бактерия является причиной большинства случаев лимфомы (формы онкогематологических заболеваний, характеризующихся пролиферацией клеток лимфоидной ткани, связанной со слизистой оболочкой пищеварительного тракта). Установлено, что инфекция довольно широко распространена и среди очень молодых возрастных групп (детей и подростков). Основным резервуаром инфекции являются Н. pylori-положительные лица и внутрисемейные контакты между членами семьи являются наиболее важным путем передачи, в основном, в раннем детстве.

В развивающихся странах могут случаться и другие пути передачи, например, через воду. Инфекция развивается, во многих случаях, протекая бессимптомно. В случае появления сопутствующих клинических симптомов у пациентов обычно наблюдаются диспептические симптомы с дискомфортом и болью в животе, тошнотой, изжогой, отрыжкой, чувством полноты после еды. Выявление H. pylori IgG антител является стандартным инструментом для исследования эпидемиологии инфекции. Тест используется для скрининга бессимптомных лиц из семей больных с заболеваниями, связанными с инфекцией H. pylori.

Путь передачи инфекции — алиментарный.

Инфекция может как протекать бессимптомно, так и вызывать диспепсические расстройства различной выраженности. Имеется зависимость от локализации возбудителя:

Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori) - микроорганизм, инфицирование которым ассоциировано с появлением эрозий в желудке, развитием хронического гастрита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Передаётся хеликобактер пищевым путём, через грязные руки и зараженные предметы обихода. При длительном нахождении Helicobacter pylori в организме возможно развитие атрофического гастрита, который является предраковым состоянием, поэтому своевременная диагностика и лечение, направленное на устранение хеликобактера, имеют важное значение.

Антитела к хеликобактеру (Helicobacter pylori) IgG – белки иммунной защиты, которые вырабатываются через 3-4 недели после контакта с инфекцией, вслед за иммуноглобулинами М (IgM) и А (IgA) и сохраняются длительное время после выздоровления. Являются маркерами инфицирования организма. Исследование будет информативно для первичной диагностики инфекции хеликобактером. Для оценки эффективности проведенной терапии целесообразно использовать методы диагностики, направленные на поиск возбудителя в выдыхаемом воздухе: дыхательный уреазный тест или исследование антигена хеликобактера в кале.

В каких случаях обычно назначают исследование на определение уровня антител к хеликобактеру (Helicobacter pylori), IgG?

При язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки – в качестве скринингового первичного обследования
При симптомах хронического гастрита
При обследовании родственников пациентов с выявленной инфекцией Helicobacter pylori

Что означают результаты теста?

Результат 1,1 - антитела обнаружены

свидетельствует о наличии антител к хеликобактеру, что может быть при текущей инфекции либо еще какое-то время после проведенного лечения

Результат 0,9 – 1,1 - сомнительный результат.

рекомендуется повторное исследование через 1- 2 недели, в случае инфицирования в повторном исследовании антитела будут обнаружены (т.е. уровень антител повысится).

Сроки выполнения теста.

Как подготовиться к анализу?

Кровь можно сдать утром натощак или в течение дня через 3 часа после необильного приёма пищи.

В каких случаях обычно назначают исследование на определение уровня антител к хеликобактеру (Helicobacter pylori), IgG?

При язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки – в качестве скринингового первичного обследования
При симптомах хронического гастрита
При обследовании родственников пациентов с выявленной инфекцией Helicobacter pylori

Что означают результаты теста?

<0,9 МЕ/мл - антитела не обнаружены
0,9-1,1 МЕ/мл - анализ рекомендуется повторить через 1 неделю
>1,1 МЕ/мл - антитела обнаружены

Результат <0,9 - антитела не обнаружены

отсутствие инфицирования Helicobacter pylori
возможно, исследование сделано в ранний период инфекции, когда ещё не успели выработаться IgG.

Результат – >1,1 - антитела обнаружены

свидетельствует о наличии антител к хеликобактеру, что может быть при текущей инфекции либо еще какое-то время после проведенного лечения

Результат 0,9 – 1,1 - сомнительный результат.

рекомендуется повторное исследование через 1- 2 недели, в случае инфицирования в повторном исследовании антитела будут обнаружены (т.е. уровень антител повысится).

Сроки выполнения теста.

Как подготовиться к анализу?

Кровь можно сдать утром натощак или в течение дня через 3 часа после необильного приёма пищи.

Можно сдавать кровь в течение дня, не ранее, чем через 3 часа после приема пищи или утром натощак. Чистую воду можно пить в обычном режиме.

В статье представлены результаты бактериологического тестирования 48 штаммов Helicobacter pylori (H. pylori), выделенных от пациентов в Санкт-Петербурге. Антибиотикорезистентность штаммов H. pylori оценивали методом серийных разведений. Среди анализируемы

Resistance of Helicobacter pylori to antimicrobial preparations by the results of bacteriologic testing

The article describes the results of bacteriologic testing of 48 Helicobacter pylori (H. pylori) strains taken from the patients in Saint-Petersburg. Antibiotic resistance of H. pylori strains was evaluated by serial breeding method. Among the analysed isolates, 42,5% were resistant to metronidazole, 27,1% — to levofloxacin, 25% — to clarithromycin, 6,3% — to amoxicillin. All the tested strains were sensitive to tetracycline.

Эрадикация H. pylori у инфицированных пациентов, страдающих хроническим гастритом, язвенной болезнью, функциональной диспепсией и другими H. pylori-ассоциированными заболеваниями, является основной стратегией предотвращения развития некардиального рака желудка [1]. В любой клинической ситуации, при которой врач сомневается в необходимости диагностировать инфекцию H. pylori и провести уничтожение микроорганизма, дополнительным и крайне актуальным аргументом в пользу этих мероприятий должен стать профилактический эффект эрадикации относительно возникновения рака желудка, особенно у пациентов с отягощенным наследственным анамнезом [2].

Целью данной работы было получение данных о состоянии первичной антибиотикорезистентности штаммов H. pylori, выделенных от пациентов в Санкт-Петербурге.

Материал и методы исследования

Исследование по протоколу SHELF проводилось в Санкт-Петербурге с мая 2013 по июнь 2014 года. Одобрение было получено в центральном и локальном научном этическом комитете в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. В исследовании использовались гастробиоптаты пациентов, соответствующих следующим критериям.

Критерии исключения:

1) пациенты, ранее получавшие антимикробную терапию для эрадикации H. pylori;
2) пациенты, получавшие антибиотики из группы макролидов в течение одного года, предшествовавшего данному исследованию;
3) пациенты, участвующие в любых других клинических исследованиях;
4) пациенты, получавшие ингибиторы протонного насоса и препараты висмута в течение двух недель, предшествовавших данному исследованию;
5) больные, принимающие антибактериальную терапию на момент забора материала.

Критерии включения:

1) мужчины и женщины в возрасте от 18 до 65 лет;
2) пациенты с инфекцией H. pylori, подтвержденной быстрым уреазным тестом гастробиоптата, полученного при проведении эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС);
3) решение врача в рамках рутинной клинической практики и диагноза пациента провести ЭГДС с забором биоптата.

В качестве основы питательной среды для выделения и культивирования H. pylori использовался колумбийский агар. Каждый образец биопсии высевался параллельно на две чашки Петри с агаром, содержащим антибиотики в следующих концентрациях: ванкомицин в концентрации 6 мкг/мл, триметоприм, в концентрации 2 мкг/мл (растворяли в спирте) и амфотерицин В (или налидиксовую кислоту) в концентрации 2–10 мкг/мл.

Инкубация посевов осуществлялась в микроаэрофильных условиях при содержании кислорода около 5%. Для этих целей использовались анаэростаты системы GasPac100 c газогенерирующими пакетами типа GasPak (BBL CampyPak Plus Microaerophilic System envelopes with Palladium Catalyst).

На кровяной питательной среде на 5–7 сутки H. pylori формировал мелкие, круглые, гладкие, прозрачные, влажные колонии диаметром около 1 мм. Колонии H. pylori, полученные в результате первичного посева биопсийного материала, использовали для приготовления мазков, окраски их по Граму и постановки уреазного теста.

Решение вопроса о принадлежности выделенной культуры к роду Helicobacter выносили на основании характерной морфологии выделенных колоний, а также набора тестов: морфологии культуры в мазке, окрашенном по Граму, и наличии характерных биохимических свойств (способности к продукции уреазы). Типичные клетки H. pylori при микроскопии имели вид тонких изогнутых нежно-розовых палочек.

Антибиотикорезистентность выделенных штаммов H. pylori изучали, используя метод серийных разведений, который основан на регистрации ингибиции роста микроорганизма на питательном агаре, содержащем определенные концентрации антибиотика. Определяли чувствительность штаммов H. pylori к кларитромицину, амоксициллину, левофлоксацину, метронидазолу и тетрациклину. Рабочие концентрации исследуемых антибактериальных препаратах в агаре были следующими:

амоксициллин — 0,25; 0,12; 0,06 мкг/мл;
кларитромицин — 1,0; 0,5; 0,25; 0,12 мкг/мл;
левофлоксацин — 2,0; 1,0; 0,5 мкг/мл;
метронидазол — 16; 8; 4 мкг/мл;
тетрациклин — 2,0; 1,0; 0,5 мкг/мл.

Среды и растворы антибактериальных препаратов готовили непосредственно перед использованием.

На чашки Петри с ростом H. pylori добавляли по 1–2 мл стерильного физиологического раствора и снимали бактериальную массу. Инокулюм наносили бактериологической петлей на поверхность чашки Петри с селективной кровяной средой с определенной концентрацией антибиотика, равномерно распределяя по поверхности. Затем чашки Петри помещали в анаэростат и инкубировали при температуре 37 °С в течение 3–5 суток. После окончания инкубации отмечали чашку с концентрацией антибактериального препарата, вызывающей полное подавление роста микробов. Контроль чистоты роста культуры оценивали по посеву на чашку Петри с селективной кровяной средой без добавления антибиотиков.

Данный метод позволил подразделить штаммы H. pylori на чувствительные и устойчивые [9]. Критерии распределения штаммов по степени чувствительности приведены в табл. 1.

На каждого пациента, гастробиоптат которого использовался в исследовании, заполнялась индивидуальная регистрационная карта (ИРК), которая дублировалась в базе данных Microsoft Access Database и содержала демографические, анамнестические данные, результаты проведенных исследований.

Статистический анализ

Статистический анализ выполнялся с помощью программного пакета IBM® SPSS® Statistics, версия 21.0.

Демографические и анамнестические показатели анализировались с помощью методов описательной статистики. Для дихотомических показателей резистентности были представлены 95% доверительные интервалы для долей резистентности к тому или иному антибиотику. Подобный статистический анализ проводился в отношении выявления наличия H. pylori и выявления резистентности к антибиотикам.

Результаты исследования

В исследовании использовались гастробиоптаты 109 пациентов в возрасте от 18 до 64 лет. Возраст, пол и диагноз пациентов представлены в табл. 2.

У пациентов были диагностированы различные заболевания, ассоциированные с H. pylori. Наиболее частой нозологией являлся хронический гастрит — 78,9% (n = 86). Язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки (ДПК) диагностирована у 20,2% (n = 22), а язвенная болезнь желудка — у 0,9% (n = 1).

Инфицирование H. pylori было подтверждено у всех пациентов уреазным тестом. Бактериологическим методом микроорганизм выделен лишь у 56 пациентов, что составило 51,4% (95% ДИ: 42,0%, 60,8%). Такой процент отражает технические трудности, связанные с транспортировкой и культивированием микроаэрофильного микроорганизма.

Чувствительность H. pylori к антимикробным препаратам удалось определить у 48 выделенных штаммов. Из-за скудного роста культуры в 8 случаях оценить антибиотикограмму было невозможно.

Таким образом, в анализ резистентности были включены 48 штаммов хеликобактера, выделенных от 48 пациентов. Среди анализируемых изолятов H. pylori штаммов, 17 (42,5%) были резистентны к метронидазолу, 13 (27,1%) — к левофлоксацину, 12 (25%) — к кларитромицину. Кроме того, было выявлено 3 (6,3%) штамма, устойчивых к амоксициллину. Все тестируемые штаммы были чувствительны к тетрациклину. В случаях выявления резистентности к трем и более группам антимикробных препаратов, штамм хеликобактера относили к полирезистентным. В ходе исследования 5 (11,1%) микроорганизмов были полирезистентными (табл. 3).

Двойная резистентность к кларитромицину и метронидазолу обнаружена у 2 (4,4%) изолятов, метронидазолу и левофлоксацину — у 4 (8,3%) микроорганизмов. Все штаммы, резистентные к амоксициллину, были устойчивы к кларитромицину.

Частота встречаемости резистентных штаммов отличалась среди мужчин и женщин, однако данный факт сложно интерпретировать из-за малой выборки (табл. 4).

При анализе частоты резистентности к кларитромицину выявлены различия по нозологиям. Так, у 14 пациентов, страдающих язвенной болезнью, было 5 (35,7%) случаев выделения штаммов H. pylori, резистентных к кларитромицину. В то же время у 34 больных, у которых был диагностирован только хронический гастрит, частота выделения резистентных штаммов к кларитромицину была ниже — 7 (20,6%). Однако этот факт сложно интерпретировать из-за ограниченного числа наблюдений.

Согласно Маастрихтским рекомендациям IV пересмотра, уровень резистентности H. pylori к кларитромицину в популяции является определяющим фактором при выборе схемы эрадикации [10]. Подобно другим патогенам, хеликобактер имеет региональные особенности резистентности. Резистентность напрямую коррелирует с частотой назначения антимикробных препаратов и утвержденными протоколами выбора антибиотиков [11]. Невозможно экстраполировать данные о резистентности, выявленные в одной стране, на другую, в силу значительных региональных различий чувствительности микроорганизмов. Так, резистентность к кларитромицину в Нидерландах составляет всего 5,6%, тогда как резистентность H. pylori к данному антибиотику в Австрии достигает 35,4% [11]. Уровень устойчивости к метронидазолу в Пекине составил 63,9%, а на Юго-Восточном побережье Китая — 95,4% [16, 17]. Для анализа антибиотикорезистентности H. pylori в мире нами были отобраны наиболее масштабные исследования, проводимые с 2000 по 2013 год. Проанализировано 13 исследований, из которых 3 европейских, 5 азиатских, 2 африканских и 3 американских. Более подробно уровень резистентности к антибиотикам H. pylori в различных странах приведен в табл. 5.

При анализе результатов исследований по антибиотикорезистентности H. pylori на территории России обращает на себя внимание рост уровня резистентности H. pylori к кларитромицину. Так, в 1996 г. в г. Москве не было выявлено резистентных штаммов к кларитромицину. Уже в 1999 г. уровень резистентности H. pylori к кларитромицину составил 17,1%, в 2000 г. 16,6%, в 2001 г. 13,8%, а в 2005 г. уже 19,3% [24, 25]. При интерпретации показателей резистентности важно учитывать методику определения чувствительности. Так, при использовании только генотипического метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) возможны сложности в интерпретации результатов. Примером могут служить данные, полученные в Санкт-Петербурге — 39–40% резистентных штаммов по данным ПЦР [26, 27]. В то же время резистентность к кларитромицину при оценке дискодиффузионным методом, который тоже имеет определенные ограничения, составила всего 7,7% [28].

Наибольшую информативность представляют данные о резистентности, полученные методом серийных разведений. На основании тестирования 133 штаммов методом серийных разведений сделан вывод о низкой резистентности в Смоленске в 2010 г. [29]. В нашем исследовании, при использовании сходной технологии тестирования, резистентность составила 25%, что еще раз иллюстрирует межрегиональные различия чувствительности микроорганизмов.

Фенотипический метод определения чувствительности к антибиотикам рекомендован Институтом по клиническим и лабораторным стандартам (CLSI), EUCAST, а также Маастрихтским соглашением IV пересмотра в качестве основного метода определения чувствительности H. pylori к кларитромицину [38]. Культуральный метод является высокоспецифичным тестом, однако характеризуется низкой чувствительностью [39]. Определение чувствительности H. pylori к антибиотикам в нашей стране сопряжено с рядом трудностей. Успех бактериологического выделения H. pylori во многом связан с правильностью отбора биопсийных образцов и соблюдением условий транспортировки материала в лабораторию. Хеликобактер является труднокультивируемым микроорганизмом, что требует не только навыков работы с его чистой культурой, но и четкого соблюдения методики разведения рабочих концентраций исследуемых антибактериальных препаратов. Учитывая объективные сложности, описанные выше, становится понятным отсутствие широко представленных данных об истинном состоянии антибиотикорезистентности в различных регионах нашей страны. Большинство исследователей в своих суждениях об антибиотикорезистентности H. pylori опираются на метод ПЦР как единственную доступную альтернативу бактериологическому методу, который позволяет определить генетические мутации H. pylori и прогнозировать фенотипическую резистентность [7].

Такая стратегия была использована нами для лечения пациентов, гастробиоптаты которых использовались в данном исследовании. Применение стандартной тройной терапии с двойной дозой ингибиторов протонного насоса, усиленной препаратом висмута трикалия дицитрата, привело к уничтожению H. pylori у 93,2% пациентов, несмотря на выявленную высокую резистентность к кларитромицину [44].

Выводы и рекомендации

На основании проведенного бактериологического исследования антибиотикорезистентности штаммов H. pylori можно сделать следующие выводы и рекомендации:

Полученные данные о резистентности H. pylori в Санкт-Петербурге делают актуальным использование всех возможностей для повышения эффективности стандартного подхода: двойные дозы ингибиторов протонного насоса, увеличение длительности с 7 до 10–14 дней, добавление препаратов висмута и пробиотиков, поиск новых стратегий эрадикации.

Литература

За остальным списком литературы ? обращайтесь в редакцию.

В. И. Симаненков* , 1 , доктор медицинских наук, профессор
Н. В. Захарова*, доктор медицинских наук, профессор
А. Б. Жебрун**, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН
А. В. Сварваль**, кандидат медицинских наук
И. В. Савилова*
Р. С. Ферман**

* ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И. И. Мечникова, Санкт-Петербург
** НИИ ЭиМ им. Пастера, Санкт-Петербург

Хеликобактер пилори — это спиралевидная бактерия, поражающая слизистую оболочку желудка и 12-перстной кишки. Это одна из немногих бактерий, способных не просто жить, но и активно размножаться в агрессивной кислой среде, вызывать воспаление слизистой оболочки и нарушать нормальный пищеварительный процесс. Доказана связь Хеликобактер пилори с развитием рака желудка.

В каких случаях нужна диагностика

Хеликобактер пилори может быть причиной следующих заболеваний:

Гастрит, дуоденит, эзофагит.

Язва желудка и двенадцатиперстной кишки.

Инфекция распространена повсеместно и передается от человека к человеку при тесном контакте, пользовании общей посудой и предметами гигиены, через грязные руки, при поцелуях. Однако, несмотря на высокий процент инфицированности, для развития болезни необходимы предрасполагающие факторы.

Анализ на хеликобактер пилори необходим при следующих симптомах:

Дискомфорт, боль за грудиной, в области желудка

Затруднения при глотании еды

Тошнота, особенно после приема пищи, иногда - рвота.

Урчание в животе, вздутие живота, метеоризм.

Потеря веса без видимой причины

Методы диагностики инфекции Хеликобактер пилори

Дыхательный тест: пациента просят выдохнуть на специальную полоску с индикатором. Преимущества метода в скорости, доступности, низкой стоимости и отсутствии противопоказаний. Однако такой способ диагностики имеет низкую точность и может использоваться только в качестве скрининга при первичном обращении пациента.

Лабораторные методы диагностики

Исследование крови на антитела к Хеликобактер пилори методом иммуноферментного анализа (ИФА) либо иммунохемилюминесцентным методом указывает на инфицированность и может помочь в определении формы инфекции

Исследование кала на Хеликобактер пилори методом ПЦР направлено на выявление антигена бактерии в исследуемом материале и подтверждает активную форму инфекции

Инструментальные методы диагностики: эзофагогастродуоденоскопия с биопсией и последующим гистологическим исследованием. Самый точный метод диагностики, позволяющий не только определить инфицированность, но и оценить состояние слизистой оболочки пищевода, желудка, 12-перстной кишки.

В Независимой лаборатории Прогрессивные Медицинские Технологии можно сделать анализ крови на антитела к Хеликобактер пилори, а также пройти ПЦР диагностику. Наши высококвалифированные специлисты работают на новейшем оборудовании. Мы гарантируем точный результат исследования. А для постоянных клиентов у нас существуют бонусные программы!

Код анализа	Наименование	Время готовности	Стоимость
[19.13.1]	Антитела к хеликобактер IgG	2 часа с момента поступления биоматериала в лабораторию	360 руб.	Добавить
[21.НР2]	Анализ кала на выявление инфекции Хеликобактер пилори ПЦР ДНК (качественный)	до 4 дней с момента поступления биоматериала в лабораторию	610 руб.	Добавить

Лаборатория

Мы работаем на лабораторном оборудовании ведущих мировых производителей, которое обеспечивает максимально точные результаты в кратчайшие сроки.

Читайте также: