Посев на среду олькеницкого техника
Обновлено: 05.10.2024
Сухую среду в количестве 68г размешать в 1 л воды очищенной. Кипятить до полного расплавления агара, при необходимости профильтровать. Разлить по 7-8 мл в стерильные пробирки. Стерилизовать в течении 15 минут при температуре 121 °C. После стерилизации среду скосить, оставляя столбик 2,0 см.
Готовая к употреблению среда должна быть прозрачной красновато - розового цвета.
Готовую среду до использования можно хранить в темном месте не более 5 суток при температуре 2-8 °C.
Посевы исследуемы образцов инкубировать 20-24 часов при температуре 37°C.
При росте микроорганизмов, ферментирующих глюкозу, наблюдается пожелтение столбика среды. В случае образования сероводорода наблюдается почернение столбика. Расщепление мочевины сопровождается изменением в малиновый цвет всей среды или только скошенной ее части, при этом может наблюдаться маскировка ферментации глюкозы и лактозы.
Потенциальный риск применения набора – класс 1 (Приказ МЗ РФ № 4н от 06.06.2012г.). Меры предосторожности при использовании по назначению готовых питательных сред – соблюдение требований СП 1.32322-08 Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и гельминтами и возбудителями паразитарных инфекций.
Хранение - в упаковке предприятия-изготовителя в сухом, защищенном от света месте при температуре от 2°C до 25°C. Замораживание не допускается.
Ферментативная активность определена на жидких средах Гисса. Кроме питательной основы в состав среды добавлен углевод (0,5-1,0%) и индикатор бромкрезолпурпур. Исходный цвет среды фиолетовый. При ферментации углевода до кислоты рН среды сдвигается в кислую сторону, индикатор становится желтым и вся среда желтеет. При отсутствии ферментации среда сохраняет исходный цвет. Для улавливания газа а среду погружены поплавки. Образование сероводорода и индола определяют индикаторными бумажками. При образовании индола индикаторная бумажка, пропитанная насыщенным раствором щавелевой кислоты, розовеет. При образования сероводорода индикаторная бумажка, пропитанная уксуснокислым свинцом, чернеет. Если индол и сероводород не образуются, индикаторные бумажки не изменяются.
4. Рост сапрофитом кишечника и дизентерийных бактерий на среде Олькеницкого
Среда Олькеницкого представляет собой комбинированную среду. Она относится к дифференциально-диагностическим средам, содержит кроме питательной основы 1% лактозы, 1% сахарозы, 1% мочевины, 0,1% глюкозы, соль Мора и гипосульфит натрия, индикатор ВР(водный голубой и розоловую кислоту).
При посеве на среду Олькеницкого культурыкишечной палочки, которая ферментирует лактозу и глюкозу до кислоты и газа, среда Олькеницкого посинеет в столбике и в скошенной поверхности. Газообразование проявляется разрывами среды пузырьками газа.
При посеве протея на среду Олькеницкого, который разлагает мочевину и резко сдвигает рН среды в щелочную сторону, вся среда (и в столбике и скошенная поверхность) становится оранжевой. При посеве шигелл на среду Олькеницкого, которые в первые сутки разлагают только глюкозу, среда посинеет в столбике, скошенная поверхность цвета не изменит.
5. Реакция непрямой гемагглютинации
РНГА применяется для обоснования диагноза при стертых формах заболевания, характеризуется большей чувствительностью, чем реакция агглютинации. Ставят реакцию в пробирках или полистироловых пластинах. Сыворотку больного разводят от 1:100 до 1:280. К 0,5 мл каждого разведения сыворотки добавляют по 0,25 мл эритроцитарного диагностикума. Пробирки или пластинывстряхивают и помещают на 2-2,5 часа в термостат при 37 0 С. Обязательны контроли диагностикума в физиологическом растворе, и со стандартной сывороткой. Эритроцитарный диагностикум представляет собой 1% взвесь формализированных и сенсибилизированных антигенами из шигелл эритроцитов барана или человека (I группы); учет проводят по четырехбальной системе в плюсах :
++++ - вое эритроциты агглютинированы и покрывают дно лунки
+++ - агглютинированы почти все эритроциты, но на их фоне имеется малозаметное кольцоиз неагглютинированных эритроцитов
++ - наряду с равномерный агглютинатом на дне лунки имеется
осадок из неагглютинированных эритроцитов
+ - большинство эритроцитов не агглютинировано и осело в виде колечка в центре дна лунки
- - признаков агглютинации нет. Эритроциты осели в виде пуговки в центре лунки.
6. Препараты для специфической профилактики и терапии дизентерии
Поливалентный дизентерийный бактериофаг содержит смесь фильтратов, полученных из фаголизатов, активных в отношений возбудителей дизентерии (Зонне, Флекснера, Ньюкасла и др.). Препарат изготовлен в виде таблетки, которая содержит фаговые корпускулы, консерванти защищена оболочкой от действия желудочного сока. Дизентерийный фаг применяют через рот для профилактики, по эпидемическим показаниям и для лечения.
С профилактической целью дизентерийный бактериофаг применяют во время сезонного подъема заболеваемости в детских дошкольных учреждениях и среди работников пищевых предприятий и приравненных к ним контингентов.
По эпидемическим показаниям бактериофаг применяют в очагах с лечебной целью бактериофаг применяют с первого дня болезни. Бактериофаг дизентерийный жидкий представляет фильтрат фаголизата дизентерийных культур, содержит фаговые частицу, активные в отношении шигелл. По активности не отличается от сухого, показания к применению такие же, как и для сухого бактериофага.
Колибактерин – содержит живые бактерии кишечной палочки штамма M-I7 антагонистически активные в отношении шигелл Флекснера и Зонне. Для получения колибактерина культуру кишечной палочки выращивают в казеиновом бульоне в реакторе 6-9 часов, высушивают путем лиофилизации. Препарат применяют через рот для профилактики и долечивания дизентерии.
Бифидумбактерин - представляет собой высушенную, взвесь живых бифидумбактерий. Бифидумбактерин применяют через рот для лечения дизентерий как у детей, так и у взрослых. Особенно показан дня лечения детей первого года жизни.
Лактобактерин - лиофилизированная взвесь живых антагонистически активных штаммов молочнокислых бактерий. Применяют препарат через рот длялечения дизентерии.
Бификол - комплексный препарат, состоящий из высушенной взвеси живых антагонистически активных бифидобактерий и кишечных палочек М-17. Применяется Бификол через рот для предупреждения затяжного и хронического течения дизентерии, для нормализации микрофлоры кишечника.
Методические указания к практической работе
1. Знакомство со схемой лабораторного диагноза дизентерии по таблице.
Для постановки лабораторного диагноза проводят микробиологическое исследование. Материалом для исследования служат испражнения. При сборе испражнений нужно учитывать, что микробы находятся, главнымобразом, в слизи и в гное. Испражнения исследуют с первых дней болезни, до начала антибактериальной терапии. Фекалии собирают в дезинфицированный смытый горшок или подкладное судно, забирают 3-5 гр. фекалий из верхней части прямой и из сигмовидной кишок, помещают в консервант. При исследовании, на дизентерию не следует собирать последние жидкие порции испражнений, особенно после дачи слабительного, так как они могут быть содержимым тонкого кишечника.
Ферментативная активность изучена на пестром ряду. Кроме питательной основы и углевода к среде добавлен индикатор бромкрезолпурпур. Исходный цвет среды фиолетовый, при образовании кислоты цвет среды становится желтым. Газообразование улавливают с помощью поплавков – коротких стеклянных трубочек, запаянных с одного конца, помещенных в питательную среду, открытым концом вниз. Образование индола определено с помощью реактива Ковача: при положительной реакции конец бумажки окрашивается в малиново-розовыйцвет.
4. Знакомство со схемой лабораторного диагноза эшерихиоза по схеме(зарисовать табл.3)
Среди кишечных палочек встречаются представители, которые способны вызывать заболевания кишечника, варьирирующие от умеренной диареи до тяжелого холероподобного заболевания. В основном заболевания возникают у детей 1 года жизни, но могут возникать также у детей старшего возраста и взрослых.
Кишечные палочки, вызывающие поражения кишечника, разделяют на три группы:
1. Энтеропатогенные кишечныепалочки (ЭПКП)– поражают детей первого года жизни, особенно часто в коллективах (серогруппы 026,055, 0111 и др.)
2. Энтеротоксигенные кишечные палочки (ЭТКП)– поражают детей старше года и взрослых людей (серогруппы 01,05,06 и др.). Эта группа кишечных палочек характеризуется способностью продуцировать энтеротоксин, который реагирует с аденилциклазной системой клеток эпителия слизистой тонкого кишечника, нарушает их функции вызывает холероподобные заболевания.
3. Энтероинвазионные кишечные палочки (ЭИКП)– поражают детей старше года и взрослых людей (серогруппы 025,0124 и др.) Эта группа кишечных палочек обладает способностью к инвазии в клетки слизистой оболочки толстой кишки и вызывает дизентериеподобные заболевания.
Помимо перечисленных заболеваний, которые могут принимать эпидемический характер, кишечные палочки могут вызывать аппендицит, перитонит, цистит, пиелонефрит и т.д. В последние годы нередко кишечные палочки самостоятельно или в ассоциациях с другими бактериями вызывают внутрибольничные инфекции в хирургических, педиатрических стационарах и др.
Кишечные палочки, выделяемые от больных различными заболеваниями, как кишечной, так и не кишечной локализации, невозможно различить от представителей нормальной микрофлоры ни по морфологическим, ни по культуральным свойствам. Дифференциация их проводится на основе антигенной структуры.
Главной особенностью ЭПКП является антигенная структура, постоянная и характерная для каждого штамма. Учитывают соматический 0-антиген, соматический К-антиген и жгутиковый Н-антиген.
Общепризнано, что поставить клинический диагноз острой кишечной инфекции нельзя. Обязательна постановка лабораторного диагноза. Основным в лабораторной диагностике является бактериологический диагноз.
Исследуемый материал: испражнения, рвотные массы.
Испражнения в количестве 3–5 гр. помещают в пробирку с изотоническим раствором хлорида натрия или глицериновой смесью. Целесообразно брать последние порции, т.к. при колиэнтеритах поражается тонкий кишечник. У грудных детей материал для исследования берут с пеленок. Чем раньше от начала заболевания исследуют испражнения, тем вероятнее возможность выделения возбудителя. Рекомендуется забор материала сделать до начала лечения.
Бактериологический метод. Бактериологический диагноз основан на выделении чистой культуры и определении её серовара.
Исследуемый материал засевают на среду Эндо, предварительно разведя его физ. раствором. Через сутки изучают колонии, выросшие на среде. Кишечные палочки вырастают на среде Эндо в виде малиново-красных колоний с металлическим блеском или без него. Отбор колоний патогенных кишечных палочек проводят с помощью ориентировочной реакции агглютинации с диагностической сывороткой. Употребляют смесь ОКБ – сывороток против патогенных кишечных палочек, соединяя не более 5 сывороток. Для постановки ориентировочной реакции агглютинации исследуют не менее 10 колоний. Если ни одна из них не агглютинирует, дают ответ: "Патогенные кишечные палочки не обнаружены". Из колоний с положительной реакцией агглютинации делают посев в пробирки со средой Олькеницкого (Клиглера) или скошенным агаром и ставят в термостат на 18–20 часов.
На следующий день (3 день исследования) просматривают посевы на среде Олькеницкого и скошенном МПА. Состав среды Олькеницкого (трехсахарная среда с мочевиной): к 100 г МПА расплавленного и охлажденного добавляют I г лактозы, I г сахарозы, 0,1 г глюкозы, I г мочевины, 0,02 г соли Мора, 0,03 г гипосульфита и индикатор ВР (водный голубой и розоловая кислота). Среду разливают так, чтобы был столбик и скошенная поверхность. Посев культуры делают штрихом на скошенную поверхность и уколом в глубину столбика. Ферментация глюкозы происходит в анаэробных условиях (её в среде мало), в этом случае цвет изменится только в столбике (среда посинеет). При ферментации лактозы или сахарозы среда посинеет как в столбике, так и на скошенной поверхности. При разложении мочевины (рН сдвигается в щелочную сторону) цвет среды станет оранжевым. Газообразование определяют по разрывам среды. При образовании сероводорода среда чернеет.
На скошенном МПА энтеропатогенные кишечные палочки образуют влажный блестящий сероватый налет.
На среде Олькеницкого кишечная палочка вызывает посинение среды, как в столбике, так и на скошенной поверхности, наблюдаются разрывы среды пузырьками газа (ферментация лактозы и глюкозы до кислоты и газа). Выделенную культуру проверяют в реакции агглютинации на стекле сначала с той же смесью сывороток, а затем раздельно с каждой сывороткой, входящей в смесь.
При отсутствии реакции агглютинации дают отрицательный ответ. При положительной реакции агглютинации необходимо подтвердить принадлежность выделенной культуры к роду кишечных палочек. Для этого культуру засевают на жидкие среды Гисса с лактозой, глюкозой, маннитом, сахарозой, в пробирку с МПБ для обнаружения индола и сероводорода, определяют подвижность.
Для окончательной идентификации выделенной эшерихии ставят развернутую реакцию агглютинации с типовой коли-ОКВ-сывороткой. Реакцию ставят с живой культурой для установления К-антигена и с гретой культурой для установления О-антигена.
По результатам пестрого ряда и развернутой реакции агглютинации может быть дан окончательный ответ.
Серологическая диагностика при кишечных инфекциях используется для подтверждения этиологического значения выделенных эшерихий, заподозренных в качестве возбудителя, в научно-исследовательских целях для изучения патогенеза и иммунитета кишечных заболеваний.
Основана она на обнаружении антител в сыворотке крови. Обнаруживают О-антитела в реакции агглютинации, используя в качестве антигена культуру, выделенную от больного и кипяченую в течение 2 часов. Положительная реакция проявляется непостоянно, титр антител невысокий – ниже 1:100. В-антитела не обнаруживаются.
Ускоренные методы лабораторной диагностики. Классическое бактериологическое исследование длится 4–5 дней. Это не всегда устраивает и клиницистов и эпидемиологов, поэтому прилагается много усилий, чтобы сократить время исследования и ускорить ответ лаборатории. Для решения этой проблемы предложено использовать наиболее рациональные питательные среды, сокращать интервалы между исследованиями, а также применять методы, основанные на определении антигенной структуры кишечных палочек. Наиболее чувствительным и быстрым методом является метод иммунофлюоресценции, основанный на обнаружении специфического антигена кишечных палочек в исследуемом материале с помощью флюоресцирующих антител.
Этапы бактериологического исследования
при подозрении на эшерихиоз
1. Сделать посев испражнений больного на среду Эндо. Для этого взять немного материала пипеткой и эмульгировать его в физиологическом растворе или глицериновой смеси, каплю эмульсии нанести на среду Эндо петлей или пипеткой. Стерильным шпателем растереть каплю на небольшом участке среды, затем, не прожигая шпатель, втереть оставшийся на нем материал по всей поверхности. Чашки с посевом поставить в термостат на 24 часа.
2. Изучить посевы на среде Эндо, описать выросшие колонии.
Отобрать малиново-красные колонии с металлическим блеском или без него с помощью ориентировочной реакции агглютинации (не менее 10). Для постановки реакции стерильной петлей взять часть колонии и смешать с каплей агглютинирующей диагностической поливалентной сыворотки. Поливалентные сыворотки готовят в производственных условиях, они содержат антитела к нескольким сероварам эшерихий из одной серологической группы. При положительной реакции агглютинации оставшуюся часть колоний отсеять на скошенный агар или среду Олькеницкого. Если же ни одна из десяти колоний не дала агглютинации, выдать отрицательный ответ.
3. Изучить посевы на скошенном агаре и среде Олькеницкого.
3.1. Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с поливалентной сывороткой. Если реакция агглютинации положительна, поставить реакцию агглютинации на стекле с каждой типовой сывороткой, входящей в поливалентную.
3.2. Подтвердить принадлежность выделенной культуры к эшерихиям. Для этого изучить ферментативные свойства, сделав посев на жидкие среды Гисса с лактозой, глюкозой, маннитом, сахарозой, мальтозой. Сделать также посев на МПБ для определения образования индола и сероводорода.
3.3. Провести окончательную серологическую идентификацию культуры. Для этого поставить развернутую реакцию агглютинации с живой и гретой культурой. Диагностическую типовую сыворотку разводят от 1:100 до титра сыворотки, указанного на этикетке. Из разведений приготовить два ряда пробирок. Приготовить антиген. Для этого смыть культуру с поверхности среды 3–5 мл физиологического раствора, разлить взвесь в 2 стерильные пробирки. Одну из них прогреть на водяной бане при 100°С в течение часа. В первый ряд разведений сыворотки внести по 2 капли живой культуры, во второй – по 2 капли гретой культуры. После встряхивания пробирки поместить в термостат на 18–20 часов.
Учет результатов. Заключение по исследованию
4.1. Просмотреть посевы на пестром ряду. Для кишечной палочки характерна ферментация лактозы, глюкозы, мальтозы и маннита с образованием кислоты и газа, отсутствие ферментации, сахарозы, образование индола. Учет реакции агглютинации провести с помощью лупы. Агглютинация с живой культурой крупнохлопчатая (Н-агглютинация), с убитой – мелкозернистая (О-агглютинация).
1. Порядок отбора и подготовки проб.
Пробы берутся в объеме 10% от партии. Для бактериологического исследования от колбасных изделий отбирают не менее двух точечных проб длиной 15 см каждая от края батона. Из двух проб составляют объединенную, массой 50 грамм.
От сосисок, сарделек пробы отбирают не нарушая целостности, далее также составляют объединенную пробу. Отбор проб проводится согласно ГОСТу 9792-73.
Подготовка проб.
Изделия помещают в кювет, протирают тампоном со спиртом и дважды обжигают под пламенем. Затем батоны разрезают продольно на две половины, не повреждая оболочки с противоположной стороны. Пробу отбирают из нескольких участков. Из мясных продуктов (свинины, говядины, баранины) пробы вырезают з разных участков на глубине 2-3 см от поверхности. Изделия без оболочки исследуются и с поверхности.
Тампоны со смывами с поверхности помещаются в пробирки со средами ХБ, Хейфеца, Кесслера. Пробы из глубинных участков помещают в кювет и обжигают. Объединенную пробу (50 г.) помещают в чашку Петри. Из нее берут навеску массой 20 грамм. Помещают ее в стерильную посуду или пергамент. Затем навеску измельчают либо в гомогенезаторе, либо готовят взвесь в ступке, где продукт растирают с песком и добавляют 80 см3 физраствора (в соотношении 1:4). В 1см3 взвеси содержится 0,2 грамма продукта.
2. Определение КОЕ в 1 грамме продукта.
В основе метода лежит способность мезофильных аэробов и факультативных анаэробов расти на агаре при температуре 300С. Из каждой пробы делают не менее трех разведений 1:10, 1:100, 1:1000. Чашки заливают 12-15см3 охлажденного до 450С МПА и выдерживают при температуре 300С 72 часа.
После подсчитывают количество колоний, выросших в агаре и на его повнрхности. Для определения КОЕ в 1 грамме количество колоний умножают на степень разведения; среднее арифметическое результато подсчета двух или трех чашек является количеством КМАФАнМ в 1 грамме продукта.
3. Определение бактерий группы кишечной палочки в 1 грамме продукта.
Целью определения является прверка соблюдения режима варки колбас или санитарно-гигиеничесикх условий в процессе производства колбасных изделий.
Просмотр посевов. На среде Эндо БГКП образуют плотные или слегка выпуклые, красные или розовые колонии с металлическим блеском. На среде Левина образуются темно-фиолетовые или фиолетово-черные колонии. Из типичных колоний делают мазки и микроскопируют их.
Обнаружение ГР- палочек, не образующих спор, специфически изменяющих цвет среды и образующих характерные колонии на средах с лактозой, указывают на наличие в продукте БГКП.
4. Определение бактерий из рода Salmonella.
Из объединенной пробы отбирают навеску массой 25грамм. Вносят ее во флакон в котором находится одна из сред: Кауфмана, Мюллера. Помещают в термостат при температуре 370С на 16-24 часа.
Из флакона производят посев на чашки Петри со средой Эндо, Плоскирева, Левина, ВСА. Чашки помещают в термостат при 370С на 16-18 часов, а со средой ВСА – на 24-48 часов.
Просмотр чашек. На среде Эндо сальмонеллы образуют бесцветные или с розовым отливом колонии. На среде Плоскирева сальмонеллы образуют бесцветные колонии, меньшего размера, чем на Эндо. На среде Левина – прозрачные , бледные, нежно-розовые. На ВСА – черные или коричневые колонии с металлическим блеском.
Подозрительные колонии пересевают на среду Олькеницкого или в короткий цветной ряд.
На МПА делают отсев для РА. На бульон Хоттингера для определения индола и H2S.
Просмотр посевов. Определение индола. Подготовка и окраска мазков. Микроскопия. Проведение РА с О и Н сальмонеллезными сыворотками, если на среде Олькеницкого получен характерный рост (нежно-голубые колонии или сплошной голубой налет).
5. Выделение сульфитредуцирующих клостридий.
Просмотр посевов. Появление черных колоний или сплошного почернения указывает на присутствие клостридий. Для подтверждения делают пересев на среду Китта-Тароцци и термостатируют при 37 С, ежедневно просматривая в течение 5 дней.
Просмотр посевов. Мазки. Проверка на каталазную активность.
6. Определение микроорганизмов из рода Proteus.
Просмотр посевов. На МПА отмечается ползучий, вуалеобразный налет с голубоватым оттенком, поднимающийся из конденсата. На среде Плоскирева – прозрачные колонии, цвет среды вокруг них окрашивается в желтый цвет. Колонии отсевают на среду Олькеницкого.
Просмотр посевов. Среда Олькеницкого окрашивается в ярко-малиновый цвет. При выделении Pr. mirabilis и Pr. vulgaris столбик окрашивается в черный цвет. Делают мазки на подвижность (Н-формы – подвижные, О-формы – неподвижные).
7. Определение коагулазо-положительных стафилококков.
1 г продукта высевают в МПБ с 6,5% NaCl.
При наличии роста в МПБ с солью проводят микроскопию мазков. При обнаружении стафилококков делают пересев на ЖСА по 0,2 см3. Посевы термостатируют при 37 С – 24 часа.
На ЖСА вокруг колоний образуется радужный венчик (St. aureus).
В мазках из колоний обнаруживают Гр+ мелкие кокки, располагающиеся гроздьями, одиночно или попарно. Учитывают только патогенные стафилококки, т.е. те, которые коагулируют цитратную плазму крови кролика.
8. Определение Listeria monocytogenes.
Листерии (Listeria monocytogenes) при температуре 4°С способны, в отличие от других микроорганизмов, размножаться в пищевых, мясных и молочных, продуктах. Листерии во внешней среде сохраняют жизнеспособность до 3-4 месяцев,на загрязненных поверхностях - до 1-3 месяцев, в почве - до 600 дней. В охлажденном мясе количество жизнеспособных листерий снижается, но полной гибели возбудителя не происходит. В замороженном мясе, при минус 10-28°С, жизнеспособные листерии обнаруживаются до 10-14 месяцев и более. В мясе и шкурах, консервированных хлористым натрием, возбудитель листериоза сохраняется более 60 суток. При варке колбас, при температуре 80°С, возбудитель листериоза погибает только через 75-90 мин. Процесс хранения колбасных изделий при низких плюсовые температурах снижает число жизнеспособных листерий, но полностью их не инактивирует, что создает опасность заражения людей. Эти данные подтверждают, что подозреваемых на листериоз животных необходимо перед убоем подвергать более тщательному ветеринарному осмотру.
Читайте также: