Посев на тиогликолевую среду

Обновлено: 19.09.2024

1.1. Настоящие методические указания предназначены для специалистов органов, осуществляющих функции по контролю и надзору в сфере обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения, организаций и учреждений Роспотребнадзора, лечебно-профилактических и других организаций независимо от организационно-правовой формы и формы собственности.

1.2. Методические указания устанавливают методы санитарно-бактериологических исследований в учреждениях здравоохранения, других организациях лечебного профиля. Объектами санитарно-бактериологических исследований, на которые распространяются настоящие методические указания, являются:

· объекты окружающей среды, в т.ч. изделия медицинского назначения, зонды, катетеры, бужи, резиновые перчатки и другие изделия из резин и металлов, шовный материал, подготовленный к использованию, и прочее, спецодежда;

1.3. Номенклатура, кратность и объем санитарно-бактериологических исследований устанавливается действующими нормативно-методическими документами с учетом санитарно-эпидемиологической обстановки.

1.4. Для санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности изделий медицинского назначения в учреждениях здравоохранения и других организациях лечебного профиля могут быть использованы питательные среды лабораторного и промышленного приготовления, расходные материалы, биологические препараты, указанные в настоящих методических указаниях. Применение других коммерческих питательных сред (расходных материалов, биологических препаратов) допускается при наличии методик исследования, утвержденных и разрешенных к применению в установленном порядке.

3.1. Исследования бактериальной обсемененности воздушной среды

3.1.1. Исследования бактериальной обсемененности воздушной среды проводят в помещениях лечебных организаций в зависимости от их функционального назначения на санитарно-микробиологические показатели:

общее количество микроорганизмов в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3 );

количество колоний S . aureus в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3 );

количество плесневых и дрожжевых грибов в 1 м 3 воздуха.

3.1.2. Пробы воздуха отбирают аспирационным методом с помощью аппаратов и устройств, разрешенных к применению в установленном порядке.

Количество пропущенного воздуха должно составлять 100 дм 3 для определения общего количества микроорганизмов, дрожжевых и плесневых грибов и 250 дм 3 для определения S. aureus . Исследование воздуха седиментационным методом не допускается.

3.1.3. Для определения общего количества микроорганизмов в 1 м 3 воздуха забор проб проводят на питательный агар типа МПА, СПА, ГРМ-агар и другие, приготовленные согласно инструкций по применению. Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение (48 ± 2) ч, подсчитывают количество выросших колоний и производят перерасчет на 1 м 3 воздуха. При наличии роста колоний дрожжевых и плесневых грибов, их подсчитывают и делают пересчет на 1 м 3 воздуха. В протоколе количество дрожжевых и плесневых грибов указывают отдельно.

Примечание : При переносе аппаратов и устройств для отбора проб воздуха из одного помещения в другое их поверхность обрабатывают раствором дезинфицирующего средства. Столик, внутренние стыки, крышку и прочие части прибора с внутренней и внешней стороны протирают спиртом (70 %).

Для определения наличия S. aureus забор проб проводят на желточно-солевые среды на основе сред: элективно-солевой агар, стафилококк-агар, маннитолагар или среда № 10 по ГФ XII, агар Байд-Паркер. Чашки с посевами инкубируют в термостате при 37 °С (48 ± 2) ч.

2. Второй-третий день.

На вышеуказанных средах стафилококк растет в виде круглых, блестящих, маслянистых, выпуклых, пигментированных колоний. Следует учитывать, что стафилококки, выделенные от человека, дают положительную лецитовителлазную реакцию в 60 - 70 % случаев. Отвивка на скошенный агар для дальнейшего исследования не менее 2 колоний, подозрительных на стафилококк. Для исследования отвивают прежде всего колонии, дающие положительную лецитовителлазную реакцию (образование радужного венчика). При отсутствии на чашках таких колоний дальнейшему исследованию подвергаются пигментированные колонии, схожие по морфологии со стафилококком. При одновременном наличии на чашках колоний стафилококка, отличающихся по пигменту, следует отвивать не менее двух колоний различного вида. Пробирки с посевом помещают в термостат при 37 °С на (24 ± 2) ч.

3. Четвертый день.

После инкубации у выделенных штаммов проверяют морфологию, тинкториальные свойства (окраска по Граму) и наличие плазмокоагулирующей активности в реакции плазмокоагуляции (РПК).

Если культура обладает только плазмокоагулирующей или только лецитовителлазной активностью, то для окончательного ответа требуется учитывать другие признаки, позволяющие определить принадлежность штамма к виду S. aureus (ферментация маннита, гемолитическая активность).

При необходимости, после выделения чистой культуры, проводят определение чувствительности/устойчивости к антибиотикам, дезинфицирующим средствам, бактериофагам.

Учет результатов дополнительных тестов. Окончательная выдача ответа.

3.2. Исследования микробной обсемененности объектов внешней среды

3.2.1. Бактериологическое исследование микробной обсемененности объектов внешней среды предусматривает определение стафилококков, бактерий группы кишечных палочек, сальмонелл, синегнойной палочки. Отбор проб с поверхностей различных объектов осуществляют методом смывов. По эпидемиологическим показаниям номенклатура исследований микробной обсемененности объектов внешней среды может быть расширена.

3.2.2. Взятие смывов производят стерильными ватными тампонами, вмонтированными в пробирки. Для увлажнения тампонов в пробирки наливают по 2,0 мл стерильной 0,1 % пептонной воды с добавлением нейтрализаторов дезинфицирующих средств.

3.2.3. При контроле мелких предметов смывы забирают с поверхности всего предмета. При контроле предметов с большой поверхностью смывы проводят в нескольких местах исследуемого предмета общей площадью примерно 100 см 2 .

3.2.4. Для обнаружения стафилококков делают высев 0,2 - 0,3 мл смывной жидкости в пробирку с 5,0 мл 6,5 % солевого бульона. Засеянные пробирки инкубируют при 37 °С в течение (24 ± 2) ч, после чего делают высев на желточно-солевые среды на основе сред: элективно-солевой агар, стафилококкагар, манитолагар или среда № 10 по ГФ XII, агар Байд-Паркер. Дальнейшие исследования выделенных культур стафилококков проводят по п. 3.1.4.

3.2.5. Для обнаружения бактерий группы кишечных палочек делают высев 0,2 - 0,3 мл смывной жидкости в пробирку с 5,0 мл среды Кесслера. Засеянные пробирки инкубируют при 37 °С в течение (24 ± 2) ч и делают пересев на среду Эндо. Выросшие колонии на среде Эндо подвергают дальнейшему изучению для установления их возможной принадлежности к патогенным энтеробактериям.

3.2.6. Для обнаружения сальмонелл делают высев 0,2 - 0,3 мл смывной жидкости в пробирку с 5,0 мл одной из сред обогащения (магниевая, селенитовая или среда Раппапорта-Вассилиадиса). Засеянные пробирки инкубируют при 37 °С в течение 18 - 20 ч, делают пересев на среду Эндо и висмут-сульфит агар с последующим отбором подозрительных колоний и их идентификацией.

3.2.7. Для обнаружения синегнойной палочки делают высев на среду № 8 (бульон для накопления стафилококков и синегнойной палочки) и среду № 9 (для определения синегнойной палочки по наличию пигмента пиоцианина) или питательные среды в соответствии с ГФ XII. Колонии, подозрительные на синегнойную палочку (колонии с ровными или слегка волнистыми краями, гладкой блестящей поверхностью с характерным запахом и пигментом, однако, следует учесть, что запах и пигмент могут сильно варьировать или вообще отсутствовать), пересевают на скошенный агар.

P. aeruginosa - грамотрицательная, подвижная, оксидазоположительная палочка, окисляющая, но не ферментирующая глюкозу, дающая рост при 42 °С.

3.2.8. Ориентировочный перечень объектов, подлежащих санитарно-бактериологическому контролю методом смывов:

А. Операционный блок:

· маска наркозного аппарата;

· тройник наркозного аппарата;

· емкости и приспособления для мытья и обработки рук;

· фартуки (клеенчатые или полиэтиленовые);

· шланг вакуум-отсоса, внутренняя часть емкости;

· шланг кислородной подводки;

· стоики для введения лекарственных средств и вспомогательные приспособления;

· ручка бестеневой лампы;

· руки персонала, участвующего в операции;

· медицинские изделия многократного применения;

Б. Послеоперационные палаты, отделения, палаты реанимации и интенсивной терапии:

· кровать и постельное белье, подготовленные для больного;

· полотенца и приспособления для обработки рук персонала;

· шланг кислородной подводки;

· запасная наркозная аппаратура (набор реанимационной укладки);

· шланг вакуум-отсоса, внутренняя часть емкости;

· внутренняя поверхность шкафов и холодильников (для хранения лекарственных средств, градусников);

· медицинские изделия многоразового использования;

В. Перевязочные, процедурные:

· кушетка и приспособления для перевязок;

· полотенца и приспособления для обработки рук персонала;

· мебель (медицинские столы, тумбочки);

· оборудование для химической стерилизации (стойки, чехлы для хранения стерильных эндоскопов, емкости с крышкой для химической стерилизации);

· гибкая часть эндоскопов и оптика;

· внутренняя поверхность шкафов и холодильников для хранения лекарственных препаратов и изделий медицинского назначения;

· внутренняя и наружная поверхности бактерицидных камер для хранения простерилизованных изделий медицинского назначения.

4.1. Отбор проб на стерильность производит специалист после прохождения инструктажа по технике выполнения отбора проб для микробиологического анализа.

4.2. Все изделия медицинского назначения, подлежащие контролю, направляют в микробиологическую лабораторию в упаковке, в которой осуществляли их стерилизацию, дополнительно заворачивают в стерильную простыню или помещают в стерильную наволочку.

При стерилизации изделий в неупакованном виде в отделении отбор проб проводят в стерильные емкости, соблюдая правила асептики.

Контроль стерильности проводят путем прямого посева (погружения) изделий целиком (при их небольших размерах) или отдельных деталей (разъемные изделия) и фрагментов (отрезанные стерильными ножницами кусочки шовного, перевязочного материала и т.п.) в питательные среды. При посеве изделия или его части непосредственно в питательную среду количество среды в пробирке (колбе, флаконе и т.д.) должно быть достаточным для полного погружения изделия или его части.

При проверке стерильности более крупных изделий проводят отбор проб методом смывов с различных участков поверхности изделий: с помощью стерильного пинцета (корнцанга) каждый участок тщательно протирают марлевой салфеткой (размер салфетки 5 ´ 5 см), увлажненной стерильной питьевой водой. Каждую салфетку помещают в отдельную пробирку (колбу, флакон) с питательной средой.

У изделий, имеющих функциональные каналы, рабочий конец опускают в пробирку с питательной средой и с помощью стерильного шприца или пипетки 1 - 2 раза промывают канал этой средой.

4.3. Для контроля стерильности используют следующие питательные среды: тиогликолевую, бульон Сабуро (с ингибитором посторонней микрофлоры - теллурит калия или левомицетин).

При контроле изделий каждого наименования обязателен одновременный посев на обе указанные питательные среды.

На каждый вид исследуемого материала используют по две пробирки каждой среды.

При посеве изделия или его части непосредственно в питательную среду количество среды в пробирке (колбе, флаконе и т.д.) должно быть достаточным для полного погружения изделия или его части.

4.4. Посевы в тиогликолевой среде выдерживают в термостате при температуре 32 °С. Посевы в бульоне Сабуро - при температуре 20 - 22 °С в течение 14 суток при контроле изделий, простерилизованных растворами химических средств и газовым методом, в течение 7 суток - простерилизованных физическими методами (паровой, воздушный).

4.5. Учет результатов исследования на стерильность.

При отсутствии роста микроорганизмов во всех пробирках (колбах, флаконах) делают заключение о стерильности изделий. Материал не стерилен при росте микрофлоры.

5.1. Смывы с рук персонала производят стерильными марлевыми салфетками размером 5 ´ 5 см, смоченной в нейтрализаторе. Марлевой салфеткой тщательно протирают ладони, околоногтевые и межпальцевые пространства обеих рук. После отбора проб марлевую салфетку помещают в широкогорлые пробирки или колбы с физиологическим раствором и стеклянными бусами, встряхивают в течение 10 мин. Жидкость засевают глубинным способом на 2 чашки Петри с мясопептонным агаром (по 0,5 мл) и в 2 пробирки с 0,5 %-м сахарным бульоном (по 1 мл). Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение 48 ч.

5.2. Учет результатов.

Отсутствие роста патогенных и условно патогенных бактерий.

6.1. Требования к помещению для посева на стерильность

6.1.1. Контроль стерильности изделий проводят с соблюдением асептических условий, исключающих возможность вторичной контаминации изделий микроорганизмами.

Контроль стерильности изделий проводят в боксах с ламинарным потоком воздуха. При отсутствии боксов с ламинарным потоком воздуха контроль стерильности проводят в боксированных помещениях (бокс с предбоксником).

6.1.2. В боксированном помещении поверхность пола, стен, потолка, мебели должна быть гладкой, без щелей, устойчивой к многократному действию моющих и дезинфицирующих средств. Полы должны быть нескользкими, иметь гидроизоляцию. Поверхность столов не должна иметь швов и трещин.

6.1.3. Боксы оборудуют приточно-вытяжной вентиляцией (с преобладанием притока над вытяжкой) с подачей в них воздуха через бактериальные фильтры. В боксе и предбокснике устанавливают бактерицидные облучатели в соответствии с нормами, предусмотренными действующими нормативно-методическими документами.

6.2. Подготовка бокса, инструментов и персонала к работе

6.2.1. Перед проведением работы поверхности в помещениях бокса и предбоксника (стены, пол, оборудование и др.), а также внутренние поверхности бокса с ламинарным потоком воздуха обрабатывают раствором дезинфицирующего средства, разрешенного к применению в установленном порядке.

6.2.2. Через 45 - 60 мин после обработки в бокс вносят все необходимые для работы материалы и инструменты, кроме образцов изделий.

6.2.3. Перед началом работ бокс с ламинарным потоком воздуха включают на время, достаточное для обеспечения полного обмена воздуха, а затем помещают в него необходимый для работы материал.

6.2.4. В боксе и предбокснике перед работой включают бактерицидные облучатели.

6.2.5. Инструменты, посуду и спецодежду, используемые в работе, предварительно стерилизуют при следующем режиме: температура 32 °С, время стерилизационной выдержки - 90 мин; изделия из резин (перчатки и т.д.) - при температуре 120 °С в течение 60 мин.

6.2.6. Перед посевом исследуемый материал вносят в предбоксник, предварительно снимая наружную мягкую упаковку. В предбокснике пакеты, биксы протирают снаружи с помощью стерильного пинцета (корнцанга) стерильной салфеткой (ватным тампоном), обильно смоченной раствором дезинфицирующего средства, обладающего спороцидными свойствами, разрешенного к применению в установленном порядке, и оставляют на 30 мин. При поступлении изделий, упакованных в два слоя (бумага, перманганаты, ткани), первый слой снимают в предбокснике и изделия во внутренней упаковке сразу переносят в бокс.

6.2.7. Перед входом в бокс работники лаборатории тщательно моют руки теплой водой с мылом, вытирают их стерильным полотенцем (салфеткой), надевают в предбокснике бахилы, стерильные халаты, 4-слойные маски, шапочки и стерильные перчатки.

6.2.8. В процессе посева в боксе проверяют обсемененность воздуха. Для этого на рабочий стол ставят 2 чашки с мясопептонным агаром (МПА), открывая их на 15 мин, затем чашки помещают в термостат при температуре 37 °С на (48 ± 2) ч. Допускается рост не более трех колоний неспорообразующих сапрофитов.

Для контроля стерильности питательные среды после изготовления и стерилизации помещают в термостат при температуре 37 °С на (48 ± 2) ч.

Бульон Сабуро контролируют полностью (всю приготовленную серию пробирок или колб).

Для тиогликолевой среды термостатируют 1 % от общего числа приготовленных пробирок или колб каждой серии. Для проведения исследований материала на стерильность эту часть сред не используют.

Для приготовления жидкой тиогликолевой среды берут 0,50-0,75 г L-цистеина, 0,75 г гранулированного агара массовой долей влаги не более 15%, 2,5 г хлорида натрия, 5,0 г моногидрата глюкозы, 5,0 г водорастворимого дрожжевого экстракта, 15,0 г панкреатического гидролизата казеина, тиогликолевой кислоты, 0,3 см 3 или тиогликолята натрия, 0,5- 0,75 см 3 , доводят объем раствора дистиллированной водой до 1000 см 3 и нагревают до полного растворения. Затем добавляют 1,0 см 3 свежеприготовленного раствора резазурина натрия (1:1000), перемешивают и разливают в пробирки соответствующего объема. Среду автоклавируют при температуре 121 °С в течение 15 мин, рН среды после стерилизации (7,0±0,2).

Для приготовления жидкой соево-казеиновой среды берут 17,0 г панкреатического гидролизата казеина, 3,0 г гидролизата соевой муки, 5,0 г хлорида натрия, 2,5 г хлорида калия, 2,5 г калия фосфата двузамещенного, 2,5 г глюкозы, доводят объем раствора дистиллированной водой до 1000 см 3 и нагревают до полного растворения. Охлаждают до комнатной температуры. Если требуется, добавляют 1 моль/дм 3 раствор едкого натра, чтобы рН после стерилизации был 7,3±0,2. Фильтруют для получения прозрачной среды, разливают по пробиркам и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °С в течение 15 мин.

Для получения агаризованной питательной среды к приготовленной жидкой соево-казеиновой среде добавляют 10-20 г агара.

Для приготовления жидкой среды Сабуро в 1000 см 3 дистиллированной воды добавляют 10 г сухого ферментативного пептона, кипятят в течение 10 мин, фильтруют, прибавляют 40 г глюкозы, устанавливают соляной кислотой массовой долей 1%-2% рН (5,6±0,2), разливают в стерильные пробирки и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин.

Для получения агаризованной питательной среды к приготовленной жидкой среде Сабуро добавляют 10-20 г агара.

7.5.9.1 Для приготовления жидкой среды Хейфлика готовят основу среды: берут 90,0 см 3 бульона из экстракта говяжьего сердца, 10,0 см 3 дрожжевого экстракта концентрацией 250 г/дм 3 , 5,0 см 3 раствора фенолового красного концентрацией 0,6 г/дм 3 , доводят до кипения и кипятят в течение 10 мин. Среду стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин.

7.5.9.2 Затем основу среды охлаждают до температуры 40 °С - 45 °С и добавляют 20,0 см стерильной лошадиной сыворотки, не подвергнутой нагреву и проверенной на контаминацию микоплазмами, 1,20 см 3 стерильного раствора дезоксирибонуклеиновой кислоты концентрацией 2 г/дм 3 и 0,25 см 3 пенициллина с содержанием пенициллина 20000 МЕ/см 3 . Значение рН доводят до 7,8 раствором едкого натра массовой концентрацией 10%. Среду не стерилизуют.

7.5.9.3 Для приготовления твердой среды к основе жидкой среды Хейфлика по 7.5.9.1 добавляют агар в концентрации 15 г/дм 3 , стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин, охлаждают до температуры 40 °С - 45 °С, а затем добавляют компоненты по 7.5.9.2.

Для приготовления жидкой среды Фрея смешивают 90,0 см 3 бульона из экстракта говяжьего сердца, 2,0 см 3 раствора моногидрата глюкозы концентрацией 500 г/дм 3 , 12,0 см свиной сыворотки, инактивированной при 56 °С в течение 30 мин, 5,0 см 3 раствора фенолового красного концентрацией 0,6 г/дм 3 . Стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин, охлаждают до температуры 40 ° С - 45 °С, а затем добавляют 0,25 см 3 пенициллина (20000 МЕ/см 3 ), 0,025 см смеси витаминов по 7.5.1, 1,0 см 3 раствора -Никотинамидадениндинуклеотда концентрацией 10 г/см 3 и 1,0 см 3 раствора цистеина гидрохлорида концентрацией 10 г/дм 3 . Значение рН среды доводят до 7,8 добавлением раствора едкого натра массовой концентрацией 10%.

Для приготовления твердой среды Фрея смешивают 90,0 см 3 бульона из экстракта говяжьего сердца, 2,0 см 3 раствора моногидрата глюкозы концентрацией 500 г/дм 3 , 12,0 см свиной сыворотки, инактивированной при 56 °С в течение 30 мин, 5,0 см 3 раствора фенолового красного концентрацией 0,6 г/дм 3 , 1,4 г очищенного агара, значение рН доводят до 7,8, стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин, затем охлаждают до температуры 40 ° С - 45 °С и добавляют 0,25 см 3 пенициллина (20000 МЕ/см ), 0,025 см 3 смеси витаминов, 1,0 см 3 раствора -Никотинамидадениндинуклеотда концентрацией 10 г/см 3 и 1,0 см 3 раствора цистеина гидрохлорида концентрацией 10 г/дм 3 .

Для приготовления жидкой среды Фриса берут 800 см 3 сбалансированного модифицированного солевого раствора Хенкса, 67 см 3 дистиллированной воды, 135 см экстракта из сердца и мозгов, 248 см 3 бульона PPLO, 60 см 3 дрожжевого экстракта концентрацией 170 г/дм 3 , 250 мг бацитрацина, 250 мг метициллина, 4,5 см 3 фенолового красного концентрацией 5 г/дм 3 . Среду стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин, затем охлаждают до температуры 40 ° С - 45 °С, значение рН доводят до 7,40-7,45 и добавляют стерильно 165 см 3 лошадиной сыворотки, 165 см 3 свиной сыворотки, проверенных на контаминацию микоплазмами.

Для приготовления твердой среды Фриса смешивают 800 см 3 сбалансированного модифицированного солевого раствора Хенкса, 200 мг DEAE - декстрана и 15,65 мг очищенного агара. Полученную смесь стерилизуют автоклавированием в течение 15 мин при температуре 121 °С и добавляют к 1740 см 3 жидкой среды Фриса.

7.6.2 Жидкие питательные среды промышленного производства, готовые к употреблению, хранят в плотно укупоренных сосудах при условии сохранения их стерильности и ростовых свойств в течение срока годности, указанного производителем.

7.6.3 Сухие питательные среды промышленного производства хранят в сухом, защищенном от света месте в соответствии с инструкцией производителя. После вскрытия упаковки необходимо написать дату вскрытия и далее хранить при комнатной температуре до окончания срока годности. По истечении срока годности, указанного производителем, среды уничтожают.

7.6.4 Приготовленные из сухих смесей и разлитые во флаконы питательные среды хранят в течение 1 мес при комнатной температуре или 3 мес при температуре от 2 °С до 8 °С. Срок годности питательных сред, разлитых в чашки Петри, составляет 7 сут при температуре 2 °С до 8 °С.

7.6.5 Если при хранении тиогликолевой среды, содержащей резазурин, верхний слой среды (более 1/3 объема) окрасится в розовый цвет, то среду можно регенерировать нагреванием на кипящей водяной бане в течение 10-15 мин до исчезновения розовой окраски с последующим быстрым охлаждением. Если окраска не исчезает после нагревания, то среду считают не пригодной к употреблению. Регенерацию среды можно проводить только один раз.

7.7.1 Определение ростовых свойств проводят для каждой партии коммерческой среды (сухой и готовой к использованию), а также для каждой партии среды, изготовленной в лаборатории.

7.7.2 При испытании ростовых свойств питательных сред, используемых для определения бактерий и грибов, в две пробирки со средой вносят культуру тест-штамма, каждого отдельно, согласно таблице 3 в количестве 10-100 КОЕ.

Таблица 3 - Тест-микроорганизмы для проверки ростовых свойств питательных сред, используемых для определения бактерий, грибов и микоплазм

Питательная среда для контроля стерильности лекарственных средств и медицинских изделий, сухая.

Тиогликоливая среда Оболенск — Цена за упаковку 0,25 кг

Питательная среда для контроля стерильности сухая (Тиогликолевая среда Оболенск) предназначена для проведения испытаний на стерильность лекарственных средств и медицинских иммунобиологических препаратов и представляет собой гомогенный, гигроскопичный, светочувствительный порошок светло-желтого цвета.

Тиогликоливая среда Оболенск Приготовление:

31,0 г препарата размешивают в 1л дистиллированной воды, кипятят в течение 2 мин (в случае необходимости добавляют в горячую среду 0,5 г тиогликолята натрия или 0,3 мл тиогликолевой кислоты), фильтруют через бумажный фильтр, разливают в соответствующие стерильные емкости и стерилизуют авто-клавированием при температуре 121°С в течение 15 мин. Готовая среда должна иметь рН 7,0±0,2.

Тиогликоливая среда Оболенск Контроль:

Контроль приготовленной тиогликолевой среды должен предусматривать оценку ее качества по ростовым и нейтрализующим свойствам, а также по показателю стерильности. Проверку ее нейтрализующих свойств осуществляют только в том случае, если среду используют для контроля стерильности препаратов, содержащих ртутный консервант (мертиолят).

Тиогликоливая среда Оболенск Оценка стерильности:

После стерилизации пробирки (или другие емкости) со средой в количестве не менее 2 % от партии помещают в термостат при температуре (37±1)°С. Учет результатов проводят через 46-50 ч путем визуального осмотра всех пробирок со средой. В случае обнаружения пророста (помутнение среды) в оставленных на контроль пробирках бракуют всю партию. Образцы среды, выдержанные при температуре (37±1)°С для проверки стерильности препаратов, не используют.

Тиогликоливая среда Оболенск Срок годности:

Приготовленную среду хранят при температуре 2-8°С, перед использованием регенерировать путем нагревания ее в кипящей водяной бане в течение 15-20 мин и последующего охлаждения в холодной воде.

Партия тиогликолевой среды, качество которой не соответствует требованиям по нейтрализующим свойствам, может быть использована (при положительных результатах контроля по другим показателям) для проверки стерильности препаратов, не содержащих ртутный консервант.

Учет результатов проводят визуально ежедневно в течение 14 сут инкубации при температуре 34-35°С. Наличие роста микроорганизмов оценивают по появлению мутности, отдельных шарообразных колоний и других макроскопических изменений в среде. Выявленный рост микроорганизмов необходимо подтвердить микроскопированием мазков, окрашенных по Граму. Испытуемый препарат считают стерильным при отсутствии роста микроорганизмов.

Тиогликолевую среду необходимо хранить в герметично закрытой упаковке в сухом защищенном от света месте при температуре от 2 до 30°С.

ИНСТРУКЦИЯ
ПО КОНТРОЛЮ СТЕРИЛЬНОСТИ КОНСЕРВИРОВАННОЙ КРОВИ, ЕЕ КОМПОНЕНТОВ, ПРЕПАРАТОВ, КОНСЕРВИРОВАННОГО КОСТНОГО МОЗГА, КРОВЕЗАМЕНИТЕЛЕЙ И КОНСЕРВИРУЮЩИХ РАСТВОРОВ

Первый Заместитель Министра здравоохранения РФ А.Д.Царегородцев 29 мая 1995 г.

Начальник Управления организации медицинской помощи населению А.Н.Деменков 29 мая 1995 г.

Медицинские иммунобиологические препараты (МИБП) - консервированная кровь, ее компоненты, препараты, консервированный костный мозг, а также кровезаменители и консервирующие растворы должны быть стерильны. Стерильность препаратов достигается соблюдением необходимых санитарно-гигиенических условий их изготовления и режима стерилизации.

1.1*. Отбор образцов для анализа

* Нумерация соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

Определение стерильности образцов проводят в условиях асептики с применением одной универсальной тиогликолевой среды. Тиогликолевая среда обеспечивает выявление различных микроорганизмов и нейтрализует действие ртутного консерванта (мертиолята), прибавляемого в различные препараты.

1.1.1. Отбор образцов при производственном контроле проводят ежедневно от работы каждого бокса, парового стерилизатора (автоклава), стерилизующей системы, сублимационного аппарата.

1.1.2. Каждая доза заготовленной цельной крови или компонентов крови, предназначенных для переливания, составляет одну серию, в связи с этим нельзя испытывать их на стерильность с помощью метода, при котором герметичность емкости (бутылки, полимерного контейнера) нарушается до переливания. Поэтому контроль стерильности крови и ее компонентов осуществляют путем исследования образцов, выборочно изъятых из общего количества заготовленных емкостей.

1.1.3. Количество проб консервированной крови составляет 2% от числа заготовленных бутылок. Если количество бутылок менее 100, на бактериологический контроль направляют один образец. Кровь, заготовленную в полимерные емкости, контролируют в количестве 1% от числа неиспользованных контейнеров, с истекшим сроком хранения.

1.1.4. Консервированный костный мозг (донорский или кадаверный) отбирают для контроля в количестве 3-5 мл от каждого образца в пустой стерильный флакон.

1.1.5. Компоненты крови - эритроцитную массу, эритроцитную взвесь, нативную плазму, плазму нативную концентрированную, криопреципитат и др. отбирают на бактериологический контроль в стерильные сухие флаконы в количестве не менее 5 мл в начале, середине и конце работы производственного бокса. Компоненты, заготовленные в полимерные контейнеры, отбирают на контроль выборочно в количестве 1 образца от числа заготовленных емкостей.

Плазма гипериммунная, заготовленная методом плазмафереза, контролируется выборочно из числа неиспользованных емкостей (1%) с истекшим сроком хранения.

Концентраты лейкоцитов, тромбоцитов и отмытые размороженные эритроциты контролю не подлежат, так как они используются по инструкции в течение 24 часов после заготовки крови.

1.1.6. Препараты крови - растворы альбумина (5, 10, 20%), протеин, плазмол, фибриноген, полибиолин, тромбин, фибринолизин, препараты иммуноглобулинов, аминокровин и др. контролируют в процессе стерилизующей фильтрации и розлива. Для контроля берут в стерильные сухие флаконы не менее 5 мл раствора в начале, середине и конце розлива.

При розливе препаратов, которые в дальнейшем подвергаются лиофильной сушке, необходимо оставлять до окончания контроля стерильности высушенной продукции утроенное количество образцов разлитого препарат герметически укупоренного. Эти образцы исследуют в случае пророста образцов высушенного препарат для выяснения инфицирования.

1.1.7. Препараты крови: плазма сухая (с глюкозой, с викасолом), фибриноген, криопреципитат сухой и др. отбирают на контроль по 1 образцу от каждой кассеты, этажерки или полки.

1.1.8. Тромбин в мелкой расфасовке отбирают по 2 флакона (ампулы) от кассеты.

1.1.9. Губку гемостатическую и биологический антисептический тампон отбирают на контроль в количестве 2% от серии.

1.1.10. Пленку фибринную изогенную, подвергающуюся стерилизации паром под давлением, отбирают в количестве не менее 2-х образцов из различных мест парового стерилизатора.

1.1.11. Кровезаменители и консервирующие растворы, подвергающиеся стерилизации паром под давлением, отбирают в количестве не менее 3-х образцов из различных мест парового стерилизатора.

1.1.12. Кровезаменители, подвергающиеся стерилизующей фильтрации и розливу, отбирают на контроль по одному флакону, в начале, середине и конце розлива.

1.2. Отбор образцов отделом технического контроля

В отдел технического контроля предъявляют готовую серию препарата. За одну серию препарата крови, кровезаменителей, консервирующих растворов, полимерных контейнеров принимают:

а) для жидких препаратов - количество продукции, подвергающейся стерилизующей фильтрации и розливу из одной емкости в течение не более одного дня;

б) для сухих препаратов - количество бутылок, флаконов и ампул с препаратом, высушенных в одном аппарате за один цикл сушки;

в) для продукции, подвергавшейся стерилизации паром под давлением - количество бутылок, ампул и др. с препаратом, полимерных контейнеров простерилизованных в одном паровом стерилизаторе.

1.2.1. Образцы готовой продукции отбирают для контроля от каждой серии в количествах, зависящих от вида стерилизации и числа единиц (ампул, флаконов и т.д.) в серии. В случае, если продукцию стерилизуют насыщенным паром при избыточном давлении 0,11+/-0,02 МПа (1,1+/-0,2 кгс/см) и температуре (+121+/-1) °С, образец состоит из 10 единиц. При других видах стерилизации минимальное количество образцов для анализа определяют по формуле

где - число единиц в образце, а - число единиц в исследуемой серии препарата, при этом должно быть не менее 3-х и не более 40.

Кроме образцов, направленных непосредственно на анализ, отбирают также дубликаты в тройном количестве, которые используются в случае необходимости для повторного контроля.

При отсутствии роста в первичных посевах дубликаты, предназначенные для повторного контроля, подлежат реализации.

При контроле стерильности препаратов крови, если серия включает в себя менее 100 бутылок, флаконов, ампул и др., количество контролируемых образцов должно быть не менее 2, при 150 - 3, при 250 - 4, при 300 - 5, при 500 и более - не менее 10. Количество образцов растворов и гемоконсервантов, отбираемое ОТК для контроля, может соответствовать тем количествам, которые предусмотрены для препаратов крови.

Примечание: При необходимости, с учетом особенностей технологии изготовления отдельных видов препаратов и особенностей фасовки, в соответствующей технологической документации могут быть регламентированы дополнительные требования в отношении необходимого количества контролируемых емкостей, обеспечивающих надежность контроля стерильности.

Оставшуюся продукцию после посева на стерильность (кровь, протеин, альбумин, плазмы, аминокровин и т.д.) передают в отдел фракционирования или в любое другое подразделение СПК для последующей переработки.

1.2.2. При проведении предварительного и арбитражного Государственного контроля направляется по 2 бутылки от серии; флаконов, ампул и др. - не менее 4 от серии.

1.2.3. При проведении последующего Государственного контроля направляется по 1 бутылке от серии; флаконов, ампул и др. - не менее 2 от серии.

1.2.4. Все образцы, идущие на контроль стерильности, сопровождаются специальным направлением (форма N 205/у).

2. Техника проведения контроля стерильности

2.1. В предбоксе бутылки, ампулы, флаконы, полимерные контейнеры с исследуемыми препаратами проверяют визуально на целостность укупорки и затем обрабатывают 3% раствором перекиси водорода или 70% спиртом.

При поступлении изделий в матерчатой или бумажной упаковке наружный слой снимают в предбоксе и изделие во внутренней упаковке сразу переносят в бокс.

2.2. В предбоксе сотрудники лаборатории тщательно моют руки с мылом, вытирают их стерильным полотенцем, надевают стерильные халаты, шапочки или косынки, четырехслойные марлевые маски, а также тапочки или бахилы.

2.3. Перед началом работы в боксе руки обрабатывают 70% спиртом. Для работы используют простерилизованные инструменты, которые во время работы находятся в емкостях с 70% спиртом.

2.4. Перед посевом жидких препаратов содержимое ампул или бутылок необходимо встряхивать, т.к. микробы - контаминанты могут осесть на дно. Перед вскрытием концы ампул или горлышки бутылок обжигают над пламенем горелки.

Образцы сухих препаратов предварительно растворяют тем стерильным растворителем и в том же объеме, которые указаны на этикетке. Препараты в бутылках, флаконах, ампулах без этикеток контролю на стерильность не подлежат.

Примечание: 1. Запрещается прокаливать концы ампул и пастеровские пипетки в пламени горелки.

2. Запрещается производить посев пипеткой ртом, без груши или резиновой трубки со стеклянным мундштуком.

2.6. Для контроля стерильности МИБП применяют только тиогликолевую среду. Для контроля стерильности кровезаменителей и консервирующих растворов, растворов глюкозы 5 и 40% раствора, натрия хлорида изотонического 0,9%, буферных растворов - тиогликолевую среду и жидкую среду Сабуро. При этом используют метод прямого посева в питательную среду или метод мембранной фильтрации.

При испытании МИБП посевы в тиогликолевой среде инкубируют при температуре от +20° до +25 °С и от +30° до +35 °С.

При испытании кровезаменителей и консервирующих растворов посевы в тиогликолевой среде инкубируют при температуре от +30° до +35 °С, а в среде Сабуро - от +20° до +25 °С. Продолжительность инкубации посевов в обеих питательных средах составляет 14 суток.

2.7. Исследуемый на стерильность препарат из бутылки, ампулы и др. засевают стерильной пастеровской пипеткой приблизительно (но не менее чем) по 1 мл в 2 пробирки, содержащие по 20 мл тиогликолевой среды.

2.8. При посеве образцов крови и компонентов, заготовленных в полимерные контейнеры, трубку контейнера пережимают зажимом выше узла и отрезают стерильными ножницами между узлом и зажимом. Обрезанный конец трубки быстро проводят через пламя, ослабляют зажим и надавливанием на контейнер, расположенный вертикально основанием вверх, свернув свободную от крови или компонента часть контейнера, вытесняют необходимое количество посевного материала (не менее чем по 1 мл) в пробирки с питательной средой. После посева контейнер вновь герметизируют завязыванием двух узлов на трубке.

2.9. Посевы образцов консервированной крови, эритроцитной массы, эритроцитной взвеси, нативной плазмы, плазмы нативной концентрированной, нативной гипериммунной плазмы, фибринолизной крови и костного мозга выдерживают 2 суток при соответствующих температурах, затем производят пересев по 0,5 мл из каждой пробирки в другие 2 пробирки, содержащие по 10 мл тиогликолевой среды. Пересевы выдерживают при тех же температурах, что и пробирки, на которых был произведен высев. Результаты регистрируют через 72 часа после первичного посева.

2.10. При контроле образцов препаратов, не вызывающих помутнение питательной среды (протеин, растворы альбумина 5, 10, 20%, препараты иммуноглобулинов, растворители для сухих препаратов, кровезаменители, консервирующие растворы и др.), посевы выдерживают в течение 14 суток при указанных выше температурах, после чего производят учет результатов.

2.11. При контроле образцов препаратов, вызывающих помутнение питательной среды (тромбин, фибриноген, фибринолизин, полибиолин, плазма сухая; в том числе гипериммунная сухая) через 5-7 суток из каждой пробирки производят пересев по 0,5 мл в другие пробирки с 10 мл тиогликолевой среды, которые выдерживают после пересева соответственно при тех же температурах. Общий период инкубации первичного посева и пересева составляет 14 суток.

Примечание: Пробирки, на которых произведен пересев препаратов, сохраняют до окончания контроля стерильности.

2.12. Образцы (кусочки) гемостатической губки, фибринной изогенной пленки, консервированной ткани, биологический антисептический тампон засевают в 2 пробирки с 20 мл тиогликолевой среды. Посевы выдерживают при температуре +30-35 °С и +20-25 °С 14 суток.

2.13. Стерильность растворителя, используемого для растворения сухих препаратов и приготовления буферных растворов, проверяют путем посева по 1 мл в 2 пробирки, содержащие по 20 мл тиогликолевой среды. Если при посеве сухих препаратов используют несколько бутылок растворителя, стерильность каждой проверяют аналогичным способом.

2.14. Если объем содержимого одной единицы продукции превышает 100 мл, то, согласно ВФС 42-1844-88* (испытание на стерильность) предпочтительнее использовать метод мембранной фильтрации.

* Документ в информационных продуктах не содержится. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Метод мембранной фильтрации. Испытание продукции на стерильность проводят с использованием фильтрационной установки, включающей фильтродержатель, соединенный с колбой-приемником. Фильтродержатель состоит из воронки с крышкой и основания из пористой пластины, на которую помещают мембрану. Используют мембраны с размером пор 0,45+/-0,02 мкм, диаметром около 47 мм. Испытания проводят под вакуумом 93,3 кПа (70 см рт.ст.) при скорости вытекания воды 55-75 мл в мин. Допускается использование аппарата, представляющего собой стерильную замкнутую систему и работающего также по принципу фильтрации растворов.

2.15. Фильтровальную установку в собранном виде стерилизуют насыщенным паром при избыточном давлении 0,11+/-0,02 МПа (1,1+/-0,2 кгс/см) и температуре (+121+/-1) °С в течение 20 мин (температура и время критические). Стерилизацию можно осуществлять любым другим способом, обеспечивающим сохранность рабочих характеристик мембраны, а также стерильность мембраны и всей установки (ионизирующее излучение, окись этилена и т.п.).

2.16. Фильтрование отобранных образцов проводят в асептических условиях. Испытуемый раствор пропускают с помощью вакуума через одну или несколько мембран.

2.17. После фильтрования мембраны извлекают, разрезают стерильными ножницами на две равные части, каждую из которых помещают в отдельную колбу с 100 мл тиогликолевой среды. Питательные среды с помещенными в них фильтрами выдерживают при температуре от +30 до +35 °С и от +20 до +25 °С в течение 7 суток при ежедневном просмотре.

2.18. Для контроля стерильности препаратов, выпускаемых в виде порошков, лиофилизированных препаратов и пр. содержимое каждой емкости предварительно растворяют в стерильном растворителе. Приготовленный раствор немедленно фильтруют. После отмывания фильтра, как указано выше, каждую половину его помещают в колбы с тиогликолевой средой и выдерживают при +30-35 °С и +20-25 °С.

2.19. При испытании продукции, разлитой в емкости большого объема, через фильтры пропускают содержимое 5-10 емкостей, если объем каждой емкости составляет от 100 до 500 мл. При наличии в емкости более 500 мл раствора стерильность испытывают по 500 мл содержимого каждой из 5-10 емкостей на 2-3 мембранах.

2.20. При испытании препаратов, представляющих собой вязкую жидкость или медленно фильтрующиеся суспензии, необходимо предварительно добавить растворитель, указанный в частной статье, для увеличения скорости фильтрации.

Для контроля стерильности условий, в которых проводят испытания, необходимо фильтровать растворитель без испытуемого препарата с последующим воспроизведением всех вышеописанных операций.

Читайте также: