Посев продуктов на микробиологию

Обновлено: 05.10.2024

Принципы, которыми руководствуются микробиологи при санитарно-микробиологических исследованиях, исходят из основной задачи, разрешаемой ими: определение возможности присутствия в исследуемом объекте патогенных микроорганизмов или токсинов, образующихся при их жизнедеятельности, а также обнаружение и оценка степени порчи изучаемого объекта (особенно пищевых продуктов). Эти принципы можно охарактеризовать следующим образом:

2. Проведение серийных анализов. Этот принцип исходит из особенностей исследуемых объектов. Как правило, вода, почва, воздух и другие объекты содержат разнообразные микроорганизмы, распределение которых неравномерно, к тому же микроорганизмы, находясь в биоценотических отношениях, подвергаются взаимному влиянию, что ведет к гибели одних и активному размножению других. Поэтому берут серию проб из разных участков исследуемого объекта, по возможности большее количество проб, что позволит получить более достоверную характеристику объекта. Доставленные в лабораторию пробы смешивают, затем точно отмеряют необходимое количество материала — среднее по отношению к исследуемому материалу в целом.

3. Повторное взятие проб. Данная операция необходима для получения сопоставимых результатов. Это связано прежде всего с тем, что исследуемые объекты весьма динамичны (вода, воздух и т.п.), сменяемость микрофлоры в них во времени и пространстве очень велика. Патогенные микроорганизмы попадают в окружающую среду, как правило, в небольшом количестве, к тому же и распределяются в ней неравномерно. Поэтому повторное взятие проб позволяет более точно определить биологическую контаминацию объектов окружающей среды.

4. Применение стандартных методов исследования, утвержденных соответствующими ГОСТами и инструкциями, что дает возможность в различных лабораториях получать сравнимые результаты.

5. Использование одновременно комплекса тестов для получения разносторонней санитарно-микробиологической характеристики. Применяют прямой метод обнаружения патогенных микроорганизмов и косвенный, позволяющий судить о загрязнении объектов окружающей среды выделениями человека и животных и его степени. К косвенным тестам относится определение общего микробного числа, количественного и качественного состава санитарно- показательных микроорганизмов. Применение косвенных методов оценки потенциальной возможности загрязнения объектов окружающей среды патогенными микроорганизмами, использование обходного пути для изучения обсемененности материалов, является особенностью санитарно- микробиологических исследований.

6. Проведение оценки исследуемых объектов по совокупности полученных результатов при использовании санитарно-микробиологических тестов с учетом других гигиенических показателей, указанных в соответствующих ГОСТах и нормативах (органолептических, химических, физических и т. д.). Всегда необходимо учитывать, что развитие микробов тесно связано с другими факторами окружающей среды, которые могут оказывать как благоприятное, так и неблагоприятное влияние, усиливая или ограничивая возможности размножения патогенных микроорганизмов и накопления их токсинов. Следует учитывать и то, что почти любой объект исследования имеет собственную микрофлору, которая вызывает специфические биохимические процессы, и те изменения в объектах, которые обусловлены посторонними микроорганизмами. Грамотный микробиолог должен хорошо знать ход биохимических процессов, происходящий в норме в исследуемом объекте (почва, вода), технологию производства, уметь определить характер вредного воздействия попавших микробов, возможные последствия такого воздействия и рекомендовать конкретные мероприятия по их предупреждению.

7. Ответственность специалистов за точность обоснования выводов и заключений о состоянии исследуемых объектов. При санитарно-микробиологическом исследовании выявляется степень порчи пищевых продуктов (или других объектов), пригодность их к употреблению, возможная опасность для здоровья населения. Запрещение использовать пищевые продукты, воду водоемов и др., закрытие предприятия из-за санитарного неблагополучия наносят определенный экономический ущерб. Ответственность за такое решение несет врач санитарной службы.

В целях предотвращения попадания и развития патогенных микроорганизмов на пищевые продукты на предприятиях пищевой и перерабатывающей промышленности, общественного питания постоянно проводят санитарно- микробиологический контроль всех объектов, контактирующих с продукцией — воздуха, воды, оборудования, тары, упаковочных материалов, рук обслуживающего персонала, а также непосредственных источников обсеменения продукции — сырья, вспомогательных материалов.

Общая характеристика методов саиитарио-микробиологических исследований

При организации планового санитарно-микробиологического контроля на предприятиях пищевого профиля используют, прежде всего, косвенные методы определения присутствия патогенных микроорганизмов. При этом для оценки санитарного состояния объектов окружающей среды используют количественные и качественные микробиологические показатели.

Количественные показатели характеризуют степень обсемененности данного объекта микроорганизмами, т.е общее микробное число в единице веса (объема) — обычно в 1г (1см3). Существует два метода определения микробной обсемененности: метод прямого подсчета и метод количественного посева проб исследуемого объекта или его разведений на питательные среды.

Прямой подсчет микроорганизмов в исследуемом объекте проводится под микроскопом в счетных камерах Горяева или в камерах, специально сконструированных для счета бактерий. Предварительно пробу исследуемого объекта подвергают обработке, чтобы получить гомогенную взвесь. Для лучшего учета бактерий в исследуемую суспензию добавляют краситель, чаще всего эритрозин. Можно проводить прямой подсчет и на мембранных фильтрах, через которые пропускают исследуемую жидкость или взвесь.

Метод количественного посева исследуемого материала на плотные питательные среды применяется наиболее часто. Из приготовленных серийных десятикратных разведений исследуемой жидкости или суспензии по 1 мл переносят в стерильные чашки Петри (начиная с большего разведения, каждое разведение отдельной пипеткой) и заливают расплавленным и остуженным до 45—50 °С мясопептонным агаром — МПА (глубинный посев). Для равномерного смешивания чашки слегка двигают по поверхности стола и после застывания агара помещают в термостат.

После инкубации подсчитывают число выросших колоний и с учетом разведения высчитывают число жизнеспособных микробов в единице объема исследуемого объекта. Если посевы выращивали при 30°С, то показателем общей обсемененности исследуемого материала является КМАФАнМ (или МАФАнМ). КМАФАнМ не определяют только у продуктов, при производстве которых используют заквасочные культуры. В зависимости от вида продукта и способа его производства этот показатель может свидетельствовать об общем санитарно- эпидемиологическом состоянии продукта, свежести или начальной стадии порчи внешне доброкачественного продукта, хотя во многих случаях метод считается приблизительным из-за невозможности выявить все микроорганизмы в объекте на одной питательной среде, т.к. их физиолого-биохимические свойства различны. Кроме того, режим инкубации также не соответствует требованиям всех микроорганизмов в ассоциации, не дают роста микробы, находящиеся в комочках исследуемого объекта, а если и наблюдается рост колоний, то, возможно, не из одной особи. Наконец, часть микроорганизмов теряет способность к размножению в силу антагонизма, конкуренции и других причин. Несмотря на недостатки этого показателя, для многих продуктов КМАФАнМ нормируется.

В обязательном порядке контролируются санитарно- показательные микроорганизмы, обнаружение которых также является косвенным показателем биологической контаминации исследуемого материала патогенными микроорганизмами. Превышение нормативов по допустимому содержанию санитарно-показательной микрофлоры свидетельствует о возможном присутствии тех или иных патогенных микробов.

Для количественной характеристики применяются две группы методик: определения титра и индекса.

Титр — это тот наименьший объем исследуемого материала (в миллилитрах) или весовое количество (в граммах), в котором обнаружена хоть одна особь санитарно-показательного микроорганизма. Например, для определения титра кишечной палочки в воде засевают несколько разных объемов (от 100 до 0,1 или до 0,01 мл в зависимости от предполагаемой степени загрязнения объекта) в жидкие сахарные питательные среды. Размножение в них кишечных палочек регистрируется по наличию брожения-расщепления углевода до кислоты и газа. Пересев на плотные дифференциально-диагностические среды и идентификация выросших колоний позволяют выяснить те объемы, в которых присутствовала кишечная палочка. Затем с помощью специальных таблиц, определяют ко ли-титр. Набор таблиц входит в ГОСТ.

Индекс — количество особей санитарно-показательного микроба, обнаруженного в определенном объеме (количестве) исследуемого объекта. Для воды, молока, других жидких продуктов — в 1 л, для почвы, и пищевых продуктов — в 1 г. Индекс — величина, обратная титру, поэтому перерасчет титра в индекс и обратно можно производить по формуле:

Соответственно для почвы и пищевых продуктов:

титр =———— ; индекс = —-—. (2)

Индекс чаще определяют путем применения мембранных фильтров или посева различных разведений исследуемых субстратов на питательные среды.

Выбор того или иного санитарно-показательного микроорганизма зависит от исследуемого объекта и конкретной задачи. Соответственно говорят, например, о титре или индексе протея или маслянокислых бактерий и т.п. Нередко (и во многих ГОСТах это узаконено) одновременно исследуется и ведется количественный учет двух или более санитарно-показательных микроорганизмов.Качественные показатели указывают на отсутствие (присутствие) микробов конкретных видов в определенной массе продукта.

Прямое выявление в пищевых продуктах патогенных или условно-патогенных микробов и их ядов проводится в соответствии с существующими нормативными документами. Обычно проверяют наличие микроорганизмов p.p.Salmonella, Staphylococcus, Cl.botulinum и их токсинов, Cl.perfringens, Bac.cereus и др. Согласно требованиям ГОСТов патогенные микроорганизмы и их токсины должны отсутствовать в определенном объеме (массе) материала, подвергнутого исследованиям (25, 50 г и т.д.).

Санитарно-микробиологическое исследование объекта на присутствие патогенных микроорганизмов проводится работниками СЭС в плановом порядке, а также внепланово — по эпидемическим показаниям. Для определения патогенных микроорганизмов могут быть использованы следующие методы :

• прямой посев исследуемого материала в питательные среды;

• предварительная концентрация патогенных микроорганизмов пропусканием исследуемого объекта (жидкой консистенции) через мембранные фильтры или посевом в среды накопления;

• обнаружение патогенных микроорганизмов методом заражения чувствительных животных (биопроба);

• применение ускоренных методов: серологических, люминесцентно-серологических и радиоизотопного.

Для иллюстрации последней группы методов ниже представлена общая характеристика ускоренных методов исследования воды. Наибольшее применение получил метод люминесцентно-серологический, который в настоящее время рекомендуется для обнаружения в воде микроорганизмов
p.p.Escherichia, Salmonella, Shigella, Vibrio и др. Метод иммунофлюоресценции основан на способности антител, предварительно обработанных различными флюорохромами (флюоресцеина изотиоцианат, родамина сульфохлорид, родамина сульфофторид и др.), адсорбироваться на поверхности микробной клетки и вызывать ее свечение. Метод флюоресцирующих антител применяется в трех модификациях: прямой, непрямой и непрямой метод с добавлением комплемента. При прямом методе_капшо исследуемой воды, в которой предполагается наличие патогенных бактерий, помещают на предметное стекло, обрабатывают специфической к искомому микроорганизму люминесцирующей сывороткой и наблюдают под люминесцентным микроскопом. На темном фоне препарата при положительном результате видна яркая флюоресценция по периферии клеток.
При непрямом методе обработка препаратов происходит в два этапа: специфической иммунной сывороткой выявляют присутствие соответствующих бактерий, на следующем этапе обнаруживают образовавшийся комплекс обработкой меченой иммунной сывороткой, содержащей антитела к глобулинам специфической сыворотки. Этот метод имеет существенное преимущество перед прямым, так как для выявления любых бактерий используется одна меченая сыворотка против антител — глобулинов, содержащихся в специфической сыворотке (как правило, глобулинов кролика).

При непрямом методе с добавлением комплемента препарат обрабатывают в 3 этапа: сначала специфической к искомому микробу иммунной сывороткой, затем — комплементом, который адсорбируется на комплексе антиген — антитело, и, наконец, иммунной противокомплементарной флюоресцирующей сывороткой.

Для повышения эффективности метода следует предварительно концентрировать бактерии в исследуемой воде на мембранных фильтрах центрифугированием или посевом в среды обогащения. В этом случае люминесцентно- серологическим методом удается обнаружить энтеробактерии при наличии в пробах воды даже единичных клеток в 1 мл. Метод флюоресцирующих антител рекомендуется применять при индикации в воде возбудителей туляремии, чумы, бацилл сибирской язвы. Однако люминесцентно-серологический метод является только сигнальным методом индикации патогенных бактерий в воде, и при положительном его результате должно проводиться тщательное бактериологическое исследование воды.

Для ускоренного обнаружения БГКП в воде был предложен радиоизотопный метод (Корш J1.E., 1978). Принцип метода заключается в определении количества БГКП по количеству метаболической двуокиси углерода, выделяемой при жизнедеятельности бактерий из элективных сред, меченных 14С. Результат можно получить через 5-6 ч.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Общие правила микробиологических исследований

Microbiology. Food stuffs. General rules for microbiological examinations

ОКСТУ 9209, 9210

Дата введения 2001-01-01

1 РАЗРАБОТАН Временным творческим коллективом с участием членов Технического комитета по стандартизации ТК 116 “Продукты переработки птицы, яиц и сублимационной сушки”

ВНЕСЕН ТК 116 “Продукты переработки птицы, яиц и сублимационной сушки”

2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 22 декабря 1999 г. N 601ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает общие правила проведения микробиологических исследований.

Стандарт способствует обоснованности исследований, обеспечению идентичности общих технических условий приемов исследований, применяемых в различных лабораториях, достижению сопоставимости результатов, полученных в разных лабораториях, и содействию по защите здоровья персонала лаборатории путем устранения опасности заражения.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ИСО 6887-83* Микробиология. Общее руководство по приготовлению разбавлений для микробиологического исследования

* Действует до введения в действие ГОСТ Р, разработанного на основе ИСО.

3 Требования к помещениям

Общее размещение лаборатории и ее инфраструктура должны удовлетворять требованиям [1]. Лаборатория должна иметь разрешение на работу с микроорганизмами III-IV групп патогенности в соответствии с [1].

3.1 Классификация помещений

Помещения лаборатории подразделяют на следующие зоны:

1) рабочая зона для выполнения следующих операций:

- приема, хранения, подготовки и обработки проб,

- приготовления и стерилизации питательных сред и оборудования,

- проведения исследования путем взвешивания, приготовления разведений, посева, пересева, термостатирования, сохранения штаммов и других лабораторных работ,

- обеззараживания и очистки оборудования, ликвидации отходов исследований;

2) дополнительные зоны, включающие следующие помещения:

- входы, коридоры, лестницы, лифты,

- административные помещения - секретарская и офисная комнаты, комната для работы с документами и другие,

- рездевалки и туалеты,

3) при работе с патогенными для человека микроорганизмами помещения рабочей и дополнительных зон должны быть разделены также на “заразную” и “чистую” в соответствии с [1].

3.2 Требования к расположению помещений

Окружающие условия, в которых проводят микробиологические исследования, не должны влиять на их достоверность.

Помещения следует располагать таким образом, чтобы избежать опасности перезаражения. Для достижения этой цели необходимо организовать поточность прохождения чистых и загрязненных материалов и обеспечить непересечение потоков.

Следует обеспечить защиту от экстремальных условий, таких как повышенная температура, запыленность, влажность, пар, шум, вибрация, воздействие прямых солнечных лучей и т.д.

Площадь рабочей зоны должна быть достаточно большой для поддержания в ней чистоты и порядка. Во всех аналитических помещениях для каждого аналитика рекомендуется рабочее место площадью примерно 20 м.

Во время проведения испытаний в рабочую зону следует допускать только персонал, участвующий в проведении исследований.

Должны быть предусмотрены отдельные комнаты и/или отдельные зоны и/или специально огороженные участки для следующих операций:

- прием и хранение проб;

- подготовка проб, особенно в случае необработанного сырья (например порошкообразных продуктов, содержащих большое количество микроорганизмов);

- работа с патогенами (например Salmonella, Listeria monocytogenes);

- приготовление и стерилизация питательных сред и оборудования;

- мойка стеклянной посуды и другого оборудования, а также обеззараживание оборудования и контаминированных питательных сред;

- проверка на стерильность пищевых продуктов.

Может быть также предусмотрено выделение следующих зон:

- для приготовления питательных сред и помещения для стерилизации питательных сред и оборудования;

- для обеззараживания и моечной.

Термостаты, холодильники, морозильные камеры могут быть размещены в отдельных, специально подготовленных комнатах.

3.3 Требования к оборудованию помещений

3.3.1 Чтобы уменьшить опасность загрязнения пылью и, следовательно, микроорганизмами, помещения для проведения испытаний должны быть устроены следующим образом:

- стены, потолок и пол должны быть гладкими, легко очищаемыми, устойчивыми к действию детергентов и дезинфицирующих веществ, используемых в лаборатории, полы не должны быть скользкими;

- помещения не должны пересекать водопроводные трубы, если они герметично не изолированы;

- окна с наружной стороны должны быть оборудованы системой защиты от прямого солнечного излучения (за исключением особых случаев);

- во избежание сквозняков во время проведения испытаний окна и двери должны закрываться герметично. Их конструкция должна препятствовать скоплению пыли и облегчать очистку.

3.3.2 Температура и качество окружающего воздуха (содержание микроорганизмов, влажность, запыленность и другое) должны соответствовать требованиям, предъявляемым к проведению испытаний. Для этого рекомендуется притяжная вентиляционная система, снабженная фильтрами. Допускается установка кондиционеров в рабочих помещениях и боксах в соответствии с [1].

Если для испытаний требуется очень чистая атмосфера, то помещение должно быть оборудовано ламинарным шкафом с очисткой воздуха и/или безопасным боксом. Это оборудование должно быть снабжено соответствующими инструкциями.

3.3.3 Верхняя поверхность лабораторного инвентаря и мебели должна быть изготовлена из гладкого непроницаемого материала, легко очищаемого и дезинфицируемого. Для предупреждения накопления пыли шкафы должны достигать потолка.

Конструкция лабораторной мебели не должна затруднять уборку помещения (например передвижная мебель).

Документация, используемая при работе с пробами, питательными средами, реактивами и т.д., должна храниться в закрытых шкафах.

Примечание - Редко используемые документы и книги желательно размещать вне рабочий зоны.

3.3.4 В помещениях должно быть хорошее освещение, без мешающих световых бликов. Следует избегать попадания прямого солнечного света на рабочее место и чувствительное оборудование, в частности, термостаты.

3.4 Требования по уходу и контролю

Полы, стены, полки, лабораторный инвентарь и мебель следует содержать в чистоте и ремонтировать, чтобы избежать образования трещин, которые могут способствовать скоплению грязи и тем самым являться источником заражения.

Для поддержания в помещениях условий, пригодных для выполнения исследований, проводят регулярную уборку и дезинфекцию. Дезинфекцию различных объектов при работе с микроорганизмами III-IV групп патогенности проводят в соответствии с [1].

Постоянно проводят проверку исправности вентиляционных установок и их фильтров, в случае необходимости фильтры заменяют.

Регулярно контролируют микробиологическое состояние поверхностей стен, рабочих мест и воздуха в помещениях рабочей зоны.

Загрязнение поверхностей может быть определено наложением на них контактных пластин, содержащих подходящие нейтрализующие соединения. Качество воздуха может быть установлено путем экспонирования в течение 15 мин открытых чашек Петри, содержащих неселективную агаровую питательную среду (например МПА - мясопептонный агар).

Примечание - При определении загрязнения поверхностей и воздуха могут быть использованы и другие методы.

4 Аппаратура и оборудование

Вся аппаратура и оборудование должны содержаться в чистоте и в рабочем состоянии. Операции по обслуживанию и ремонту должны контролироваться. Приборы, оборудование и средства измерений должны быть аттестованы и подвергнуты метрологическому контролю в установленные сроки, иметь технический паспорт и другую документацию в соответствии с требованиями [1].

4.1 Микробиологические боксы

4.1.1 Бокс (боксированные помещения или помещения, оснащенные боксами биологической безопасности) - защищенное от пыли рабочее место, оборудованное установкой для горизонтального или вертикального ламинарного потока воздуха. В микробиологии используют безопасные боксы с улавливанием микроорганизмов фильтрами. При работе с патогенными микроорганизмами устройство боксов и их эксплуатация должны проводиться в соответствии с [1].

По степени очистки от пыли боксы условно делят на классы в соответствии с максимально допустимым количеством частиц размером более 0,5 мкм/м. Для боксов, применяющихся в пищевой микробиологии, количество частиц не должно превышать 4000 в кубическом метре.

Боксы могут быть двух типов:

а) бокс биологической безопасности с очисткой воздуха, который предназначен для защиты продукта от внешнего заражения и сведения к минимуму заражения, связанного с оператором;

б) боксированное помещение, предназначенное для предохранения продукта от внешнего заражения, а также защиты оператора и окружающей среды.

При всех работах с патогенами следует использовать, как минимум, боксированные помещения.

4.1.2 Требования к обслуживанию и контролю

Эффективность работы боксов биологической безопасности должна проверяться квалифицированным персоналом при вводе в эксплуатацию и далее не реже одного инспектирования в год. Если боксы оснащены фильтрами притяжной вентиляции, последние должны систематически заменяться.

После работы боксы убирают и дезинфицируют. Периодический контроль на всевозможные микробные загрязнения рабочих поверхностей и стен бокса проводят в помощью обычного оборудования. Например, путем экспонирования в течение 30 мин в каждом боксе нескольких открытых чашек Петри, содержащих неселективную агаровую питательную среду (например МПА). Могут быть использованы и другие методы.