Определение протеолитических ферментов производят при посеве на

Обновлено: 05.10.2024

Методы определения протеолитической активности

Enzyme preparations.
Methods for determination of proteolytic activity

МКС 07.100.30
65.120
ОКСТУ 9291

Дата введения 1989-01-01

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Министерством медицинской и микробиологической промышленности СССР

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 02.03.88 N 440

4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Обозначение НТД, на который дана ссылка

Номер раздела, пункта

5. Ограничение срока действия снято по протоколу N 3-93 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 5-6-93)

6. ИЗДАНИЕ с Изменением N 1, утвержденным в декабре 1989 г. (ИУС 4-90)

Настоящий стандарт распространяется на ферментные препараты и устанавливает методы определения протеолитической активности ферментных препаратов микробного происхождения.

1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ - по ГОСТ 20264.0

2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (ПС)
(модифицированный метод Ансона)

2.1. Метод основан на гидролизе казеината натрия исследуемым ферментным препаратом до пептидов и аминокислот с последующим их определением.

За единицу протеолитической активности принята способность фермента превращать за 1 мин при температуре 30 °С казеинат натрия в неосаждаемое трихлоруксусной кислотой состояние в количестве, соответствующем 1 мкмолю тирозина.

Протеолитическую активность выражают числом указанных единиц в 1 г испытуемого препарата.

Активность грибных и бактериальных протеиназ определяют при значениях рН в следующих диапазонах:

2,5±0,2 и 5,5±0,2 - кислые протеиназы;

7,2±0,2 - нейтральные протеиназы;

9,5±0,2 - щелочные протеиназы.

2.2. Аппаратура, материалы, реактивы, растворы

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104*;

* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001.

2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г;

1-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г или 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 20 г.

Прибор для определения рН среды в диапазоне от 0 до 14 с погрешностью измерения ±0,1 единиц рН.

Мешалка магнитная любого типа, обеспечивающая 3000 об/мин.

Термостат любого типа, обеспечивающий температуру нагрева 40±0,2 °С.

Колориметр фотоэлектрический лабораторный, обеспечивающий измерения в интервалах длин волн 630-670 нм с погрешностью ±1% (по коэффициенту пропускания) или 0,01 (по оптической плотности).

Термометры 0-150 °С по ГОСТ 28498 с ценой деления 1 °С.

Холодильник бытовой любой марки.

Электроплитка с терморегулятором по ГОСТ 14919.

Баня водяная любого типа.

Холодильник ХСВО 10 ХС по ГОСТ 25336.

Стаканы любого типа и исполнения вместимостью 100, 250, 600, 1000 и 2000 см по ГОСТ 25336.

Стаканчики для взвешивания СВ-19/9 или СВ-24/10 по ГОСТ 25336.

Колбы типов П и Кн любого исполнения вместимостью 100, 250, 500, 1000 см по ГОСТ 25336.

Колбы типов К-1-2000-45/40 ТС, К-2-200-45/40 ТС по ГОСТ 25336.

Колбы мерные исполнения 1 или 2, любого класса точности, наливные вместимостью 50, 100, 200, 250, 500, 1000 и 2000 см по ГОСТ 1770.

Пробирки П1-16-150 ХС, П2-16-180 ХС по ГОСТ 25336.

Цилиндры любого исполнения вместимостью 50 и 100 см по ГОСТ 1770.

Пипетки любого исполнения вместимостью 1, 2, 5 и 10 см по ГОСТ 29227.

Воронки стеклянные типа В по ГОСТ 25336.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Кислота уксусная по ГОСТ 61, раствор концентрации 0,1 моль/дм.

Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552, раствор с массовой долей кислоты 85% и раствор концентрации 0,1 моль/дм.

Кислота борная по ГОСТ 9656, раствор концентрации 0,1 моль/дм.

Натрий вольфрамовокислый 2-водный по ГОСТ 18289.

Натрий молибденовокислый по ГОСТ 10931.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, концентрированная, раствор концентрации 1 моль/дм и 0,2 моль/дм.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор концентрации 1 моль/дм и 0,1 моль/дм.

Натрий казеиновокислый (казеинат натрия).

Натрий углекислый по ГОСТ 83, раствор концентрации 0,5 моль/дм.

Кислота трихлоруксусная (ТХУ).

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

1. Все реактивы должны быть марки х.ч. или ч.д.а., кроме трихлоруксусной кислоты, которая используется марки ч.

2. Допускается использование импортной посуды и приборов с аналогичными техническими характеристиками.

2.3. Подготовка к испытанию

2.3.1. Приготовление универсального буферного раствора концентрации 0,1 моль/дм

Протеолитическая активность микробов направлена на расщепление белков до промежуточных (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или конечных (сероводород, индол, аммиак) продуктов. Действие протеолитических ферментов изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном.

Тест на желатиназу. Культуру микроорганизмов засевают уколом в столбик питательного бульона, содержащего 12% желатины. Посевы выдерживают при комнатной температуре (20-22°С) в течение нескольких (5-7) дней, при этом регистрируют не только наличие разжижения, но и его характер. Разжижение может быть послойным, что свойственно бактериям сине-зеленого гноя; холерный вибрион разжижает желатину в виде гвоздя; стафилококки – в виде чулка. Рост сибиреязвенных бацилл напоминает елочку, перевернутую вершиной вниз (характер разжижения послойный).

Тест на растворение свертка казеина. Культуру засевают на обезжиренное молоко. Культура расщепляет молочный сахар (лактозу) и за счет закисления среды наблюдается свертывание молочного белка (казеина). При выделении протеолитических ферментов казеин постепенно растворяется – пептонизируется, в результате чего молоко просветляется и приобретает легкий кремовый оттенок, а на дне пробирки формируется осадок.

Тест на свернутой сыворотке крови. Культуру исследуемых аэробных микробов засевают на чашки, анаэробных — уколом в столбик свернутой лошадиной сыворотки, инкубируют в термостате при 37 °С. Штаммы, продуцирующие протеолитические ферменты, разжижая питательную среду, образуют углубления вокруг колоний или на поверхности столбика среды.

Некоторые виды патогенных микробов с выраженной протеолитической активностью обладают способностью расщеплять белок и пептон до продуктов глубокого распада: индола, сероводорода, мочевины и аммиака. При определении видов и дифференциации разновидностей патогенных микробов наибольшее значение имеет выявление двух первых продуктов: индола и сероводорода.

Определение индола. Для обнаружения индола по способу Мореля узкие полоски фильтровальной бумаги смачивают горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушивают. Индикаторную бумажку помещают между стенкой пробирки с МПА и пробкой, предварительно произведя посев исследуемой культуры. При выделении индола на 2-3-й день нижняя часть полоски бумаги приобретает розовый цвет. Индол образуется при наличии у бактерий фермента триптофаназы при расщеплении сложной гетероциклической кислоты - триптофана.

Определение сероводорода. Сероводород является конечным продуктом расщепления аминокислот: цистина, цистеина и метионина, содержащих серу. Петлю исследуемой культуры микробов засевают в пробирку с мясопептонным бульоном. Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца, которую закрепляют между стенкой засеянной пробирки и пробкой. При взаимодействии сероводорода и ацетата свинца бумага чернеет в результате образования сульфида свинца.

Тест на аммиак.Аммиак определяют при помощи увлажненной розовой лакмусовой бумажки, помещенной между стенкой и пробкой засеянной пробирки. Посевы инкубируют в термостате 1-5 суток. Посинение лакмусовой бумажки свидетельствует о выделении аммиака.

Определение окислительно-восстановительных ферментов бактерий

Изучение сахаролитических и протеолитических ферментов часто оказывается достаточным для определения вида, но в некоторых случаях возникает необходимость включать в изучение другие ферменты: уреазу, каталазу, цитохромоксидазу, нитратредуктазу и др.

Тест на уреазу. Наличие уреазы определяют на среде с мочевиной и индикатором фенолротом (начальный цвет среды-желтый). При расщеплении мочевины на аммиак и углекислый газ накапливается аммоний, что сдвигает рН в щелочную сторону и изменяет цвет индикатора на красный.

Тест на нитратредуктазную активность. Этот тест используют для идентификации отдельных видов бактерий. Он позволяет определить способность восстанавливать нитраты в нитриты. Выявление нитратредуктазы (фермента восстанавливающий нитраты в нитриты) характерно в основном для факультативных анаэробов. Способность к восстановлению NO₃ в N0₂, определяют культивированием в МПБ, содержащем 1% раствор KNO₃. Для определения нитритов в среду добавляют несколько капель реактива Грисса, содержащий уксусную кислоту. Появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитритов.

Тест на каталазу. Каталаза — это фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и кислорода. Каталазу содержат аэробы и факультативные анаэробы, но она отсутствует у облигатных анаэробов, на которых перекись водорода оказывает губительное действие. Бактериологическую петлю исследуемой культуры с плотной питательной среды суспезируют в капле 3% раствора перекиси водорода на предметном стекле. Образование пузырьков газа свидетельствует о проявлении каталазной активности.

Тест на оксидазу (цитохромоксидазу). Цитохромоксидаза — это фермент, обеспечивающий перенос электронов на кислород в процессе аэробного дыхания. Активность цитохромоксидазы учитывают при дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae и др. Обнаружение цитохромоксидазы у аэробов проводится путем нанесения и растирания петли культуры на индикаторную бумажку, пропитанную спиртовым раствором альфа-нафтола и 1% водным раствором ментола. О наличии цитохромоксидазы судят по синему окрашиванию, появляющемуся через 2—5 мин.

Тест на плазмокоагулазную активность. Плазмокоагулаза - фермент, свертывающий плазму крови животных. Петлю агаровой культуры стафилококка суспензируют в 0,5 мл цитратной кроличьей плазме, разведенной 1:5. Результаты регистрируют через 1, 2, 4 и 18 часов инкубации проб в термостате при температуре 37°С. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка свидетельствует о наличии плазмокоагулазы.

Тест на гемолитическую активность. Определяется при посеве испытуемых микроорганизмов на кровяной агар. Гемолитическая активность характеризуется появлением зоны просветления среды вокруг колоний.Различают β-гемолиз (полный гемолиз), когда образуются зоны просветления вокруг колоний, α-гемолиз или неполный гемолиз, при наличии зон зеленого цвета вокруг колоний. Отсутствие гемолиза обозначается как γ-гемолиз.

При идентификации многих микроорганизмов используют реакцию Фогеса — Проскауэра на ацетоин — промежуточное соединение при образовании бутандиола из пировиноградной кислоты. Положительная реакция свидетельствует о наличии бутандиолового брожения. Определение образования ацетона проводится при добавлении к культуре 40% КОН и 5% альфа-нафтола. При наличии ацетоина жидкость приобретает красное окрашивание, т.е. в щелочных условиях ацетон образует с альфа-нафтолом соединение красного цвета - ацетилметилкарбинол.

Цель занятия:изучить ферментативные (сахаролитические и протеолитические, гемолитические и редуцирующие) свойства микробов и другие методы обязательные для идентификации возбудителя; продолжить выделение чистой культуры аэробов и анаэробов (3 и 4 день)

Вопросы для обсуждения

1. Ферменты микроорганизмов. Классы ферментов.

2. Секреция продуктов жизнедеятельности микробной клетки: пигменты, аромат, газообразование, светящиеся микроорганизмы, микробные токсины.

3. Идентификация бактерий по биохимическим свойствам: сахаролитические, протеолитические, гемолитические, липолитические свойства. Редуцирующие (окислительно-восстановительные) свойства микробов.

4. Современные методы биохимической идентификации бактерий.

5. Выделение чистой культуры (3-4 дни: аэробы; 3-5 дни: анаэробы).

Оформление протокола практического занятия (сделать дома)

1) Проверить записи по самостоятельной работе, выполненной на занятиях № 7 и 8. Сделать описание хода и результатов самостоятельной работы (первый день микробиологического исследования:…; второй день микробиологического исследования:…).

3) Записать понятия и зарисовать примеры определения следующих свойств:

- сахаролитических свойств на жидких средах Гисса (рис 9.1) и среде Олькеницкого (рис 9.3) (какие свойства и по изменению какой части среды определяются на среде Олькеницкого);

- протеолитических свойств – определение образования индола, сероводорода и аммиака, и формы разжижения желатина (рис 9.4 и 9.5);

3) Подготовить Таблицу 9.1. для заполнения на занятии.

Задания для выполнения практической работы

1. По демонстрационным препаратам:

- определить способность микроорганизмов вырабатывать ферменты: каталазу, оксидазу, плазмокоагулазу, гиалуронидазу;

- заполнить таблицу 9.1

2. Сделать фото всех демонстрационных препаратов для оформления в протокол самостоятельной работы.

МАТЕРИАЛ К ИЗУЧЕНИЮ.

Ферменты микробов.Ферменты состоят из белковой (апофермент) и небелковой частей (простетическая группа). Простетическая группа обеспечивает специфичность действия каждому ферменту, поэтому он взаимодействует только с одним субстратом.

Ферменты классифицируются:

а) по характеру вызываемых превращений: гидролазы, оксидоредуктазы, трансферазы, лиазы, изомеразы, лигазы;

б) по локализации и месту действия: эндо- и экзоферменты;

в) по времени образования: конститутивные, индуцибельные;

г) по расщепляемому субстрату: сахаролитические, протеолитические, липолитические.

При биохимической дифференциации микробов определяют их свойства:

1 - сахаролитические – способность сбраживать углеводы и многоатомные спирты с образованием кислоты и газа или только кислоты;

2 - протеолитические – способность разлагать белковые продукты с образованием сероводорода, индола и других веществ;

3- гемолитические – способность лизировать эритроциты на кровяном агаре (КА) или на бульоне с отмытыми эритроцитами;

4 - редуцирующие – способность восстанавливать некоторые химические вещества (краски и др.).

Рис. 9.1. Изучение сахаролитической активности микроорганизмов.

Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, Левина, Плоскирева. Микроорганизмы, сбраживая до кислоты находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу), образуют окрашенные колонии — кислота изменяет цвет имеющегося в среде индикатора. Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны.

Рис.9.2. Рост энтнробактерий на среде Эндо: 1 – лактозонегативные; 2 – лактозопозитивные.

Рис 9.3. Рост на трехсахарном железосодержащем агаре (среде Олькеницкого):

1. Контроль (незасеянная среда)

3. род Escherichia

5. род Salmonella

Молоко при росте микробов, сбраживающих лактозу, свертывается.

При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщепление. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя — цвет среды не изменяется. Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

Определение протеолитических свойств микробов проводят на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном.

Пептон – промежуточный продукт распада белков, представляет собой смесь полипептидов и аминокислот. Хорошо растворяется в воде и не свертывается при нагревании. Получают пептон из рубцов крупного и мелкого рогатого скота.

Желатин – животный клей, состоящий из белка сухожилий, костей, хрящей. Светло-коричневого цвета, без запаха и вкуса. Плавится при температуре 32–34 о С, застывает при температуре 16 о С. При посеве уколом в столбик желатиновой среды микробы, разлагающие желатин, разжижают среду.

Действие микроорганизмов, разлагающих казеин (молочный белок), проявляется в пептонизации молока, которое приобретает вид молочной сыворотки.

В процессе ферментации пептонов микроорганизмы образуют индол (С₈Н₇N), сероводород (Н₂S), аммиак (NH₃) и другие соединения.

Рис. 9.4. Определение протеолитических свойств бактерий - формы разжижения желатина: 1- в форме гвоздя; 2- в форме чашечки; 3 – воронкообразное; 4 – в форме треугольника; 5 – послойное; 6 – мешкообразное.

Методика определения сероводорода.Над культурой исследуемых микробов помещают полоску фильтровальной бумаги, смоченную раствором уксуснокислого свинца или сульфатом железа (бумага закрепляется между пробкой и стенкой пробирки). Пробирки помещают до трех суток в термостат. Почернение бумаги происходит при выделении сероводорода, который превращает уксуснокислый свинец в сернокислый или в нерастворимый сульфид железа. Продукцию сероводорода можно определить также путем посева исследуемой культуры микробов уколом в столбик с питательной средой, содержащей различные соли (сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфит натрия). При образовании Н₂S среда окрашивается в черный цвет за счет образования сульфида железа (FeS).

Методика определения индола.Определение индола по методу Морелли осуществляют с помощью полоски фильтровальной бумаги, обработанной горячим насыщенным 12 % водным раствором щавелевой кислоты и высушенной в термостате. Бумагу закрепляют между пробкой и стенкой пробирки. Пробирки с исследуемой культурой помещают в термостат на трое суток. Порозовение нижней части индикаторной бумаги указывает на наличие индола. Также индол можно определить по методу Эрлиха. Для этого в пробирку с исследуемой культурой микробов добавляют 2-3 мл эрифа, энергично перемешивают и прибавляют несколько капель реактива Эрлиха (спиртовой раствор параметиламидобензальдегид с хлористоводородной кислотой). При наличии индола наблюдается розовое окрашивание или розовое кольцо.

Методика определения аммиака. Над культурой исследуемых микробов помещают полоску увлажненной красной лакмусовой бумаги (бумага закрепляется между пробкой и стенкой пробирки). Пробирки помещают в термостат. В присутствии аммиака бумага синеет.

В бактериологической практике иногда ограничиваются изучением сахаролитических и протеолитических свойств исследуемых бактерий, если этого достаточно для их идентификации.

Рис 9.5. Определение протеолитических свойств бактерий: II – определение сероводорода; III - определение индола; IV – определение аммиака. 1- контроль, 2 - положительный результат.

Редуцирующие свойства микробов.Редукцией или восстановлением того или иного вещества называется химический процесс, состоящий в отнятии кислорода от данного вещества или замене его водородом. Имеются вещества, которые при редукции легко обесцвечиваются.

Тест на оксидаза - используются для дифференциации представителей родов Neisseria, Alcaligenes, Aeromonas, Vibrio, Campylobacter и Pseudomonas (обладают оксидазной активностью) от энтеробактерий (оксидазоотрицательные). Для постановки этого теста, например, используется флакончик, в котором находятся стерильные диски из фильтровальной бумаги, пропитанные оксалатом N,N-диметил-парафенилендиамина, аскорбиновой кислотой и a -нафтолом.

Для осуществления дыхания (биологического окисления с целью получения энергии) у некоторых бактерий имеется цитохромоксидаза, либо индофенолоксидаза – железосодержащий белок, гемопротеин, который катализирует перенос электронов от вещества-донора (например, НАД-Н) к веществам-реципиентам (обычно О₂). Бесцветный N,N-диметил-парафенилендиамин служит искусственным реципиентом электронов. В ходе оксидазного теста из него в результате окислительно-восстановительных реакций с участием микробной оксидазы образуется индофенол – вещество синего цвета. В случае положительной реакции (наличие цитохромоксидазы) из оксалата N,N-диметил-парафенилендиамина и a -нафтола образуется синий индофенол.

Оксидазный тест проводят путем снятия микробной колонии и растирания ее по оксидазному диску. Учет реакции ведут в течение 5–10 секунд при 25–30°С. Замедленные положительные реакции появляются через 10–60 секунд. Отсутствие изменения цвета на диске или развитие окраски через 60 и более секунд расценивают, как отрицательную реакцию.

Важным признаком у микробов является способность к образованию фермента каталазы. Для ее обнаружения на предметное стекло наносят каплю 1-3% раствора перекиси водорода и в нее вносят бактериологической петлей исследуемую культуру микробов. При положительном результате наблюдают выделение пузырьков газа в результате разложения Н₂О₂ на кислород и воду.

При необходимости исследуют другие признаки, например способность восстанавливать нитраты в нитриты, карбоксилировать аминокилоты, образовывать оксидазу, плазмокоагулазу, фибринолизин и другие ферменты.

Ряд ферментов (нейраминидаза, гиалуронидаза, коагулаза и др.) способствуют проявлению патогенных свойств у возбудителей некоторых инфекционных заболеваний, поскольку субстратом их действия являются вещества, входящие в состав клеток и тканей организма человека.

Плазмокоагулаза — выявляется в пробирочном опыте путем определения скорости свертывания испытуемым микробом цитратной кроличьей или человеческой плазмы.

Гемотоксин— вызывает лизис эритроцитов. Определяется при посеве испытуемых микробов на кровяной агар. Вокруг колонии наблюдается зона просветления среды.

Лецитиназа— разрушает лецитовителлин яичного желтка. Обнаруживается при посеве испытуемых микробов на желточно-солевой агар (ЖСА) по образованию вокруг колоний зоны помутнения с радужным венчиком.

Гиалуронидаза — расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав соединительной ткани. В пробирку с испытуемой культурой вносится гиалуроновая кислота и после 30-минутной экспозиции при 37 °С добавляется 2 капли крепкой уксусной кислоты. При наличии фермента гиалуроновая кислота утрачивает способность образовывать сгусток.

Фибринолизин — растворяет фибрин плазмы крови, добавленной к питательной среде.

Современные методы биохимической идентификации бактерий

Для ускоренной идентификации выделенных чистых культур применяются наборы коммерческих тест-систем. Они позволяют быстро и надежно определить ферментативные свойства микроорганизмов. Тест-системы представляют собой наборы микропробирок или микроконтейнеров с определенными субстратами, дисками или полосками бумаги, пропитанными различными ингредиентами, наборы индикаторных карандашей и др. Такие системы значительно сокращает время анализа. Ниже приводятся некоторые из наиболее часто используемых в практике микробиологических исследований микросистем.

2. Система АР1-20Е — пластиковая полоска с 20 микроконтейнерами, в которых имеется набор сухих индикаторных питательных сред. В их составе дифференцирующие аминокислоты, углеводы, желатин, мочевина, реактивы на сероводород, индол, ацетоин и др.

3. Система Micro Id включает 15 биохимических тестов для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae и представляет собой набор бумажных индикаторных дисков,размещенных в лунках пластикового лотка.

4. Набор Patho Tec Rapid ID состоит из бумажных полосок, снабженных индикаторными поясками для выявления ферментов или конечных продуктов обмена веществ. Этот набор позволяет определить до 10 признаков в течение 1-4 ч.

5. Системы индикаторные бумажные (СИБ) используются для ускоренной диагностики энтеробактерий и холерных вибрионов. Это диски или полоски бумаги, пропитанные различными субстратами (углеводами, аминокислотами) и индикаторами. Наша промышленность выпускает несколько таких систем разного целевого назначения. Например, набор № 2А (малый) включает 9 тестов и предназначен для межвидовой дифференциации энтеробактерий. Набор № 2Б (расширенный) состоит из 25 субстратов с индикаторами для видовой дифференциации энтеробактерий.

Тест на желатиназу.Культуру микроорганизмов засевают уколом в столбик питательного бульона, содержащего 12% желатины. Посевы выдерживают при комнатной температуре (20-22°С) в течение нескольких (5-7) дней, при этом регистрируют не только наличие разжижения, но и его характер. Разжижение может быть послойным, что свойственно бактериям сине-зеленого гноя; холерный вибрион разжижает желатину в виде гвоздя; стафилококки – в виде чулка. Рост сибиреязвенных бацилл напоминает елочку, перевернутую вершиной вниз (характер разжижения послойный).

Тест на растворение свертка казеина.Культуру засевают на обезжиренное молоко. Культура расщепляет молочный сахар (лактозу) и за счет закисления среды наблюдается свертывание молочного белка (казеина). При выделении протеолитических ферментов казеин постепенно растворяется – пептонизируется, в результате чего молоко просветляется и приобретает легкий кремовый оттенок, а на дне пробирки формируется осадок.

Тест на свернутой кровяной сыворотке. Культуру исследуемых аэробных микробов засевают на чашки, анаэробных — уколом в столбик свернутой лошадиной сыворотки, инкубируют в термостате при 37 °С. Штаммы, продуцирующие протеолитические ферменты, разжижая питательную среду, образуют углубления вокруг колоний или на поверхности столбика среды.

Определение индола.Для обнаружения индола по способу Мореля узкие полоски фильтровальной бумаги смачивают горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушивают. Индикаторную бумажку помещают между стенкой пробирки с МПА и пробкой, предварительно произведя посев исследуемой культуры. При выделении индола на 2-3-й день нижняя часть полоски бумаги приобретает розовый цвет. Индол образуется при наличии у бактерий фермента триптофаназы при расщеплении сложной гетероциклической кислоты - триптофана.

Определение сероводорода.Сероводород является конечным продуктом расщепления аминокислот: цистина, цистеина и метионина, содержащих серу. Петлю исследуемой культуры микробов засевают в пробирку с мясопептонным бульоном. Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца, которую закрепляют между стенкой засеянной пробирки и пробкой. При взаимодействии сероводорода и ацетата свинца бумага чернеет в результате образования сульфида свинца.

Тест на аммиак. Аммиак определяют при помощи увлажненной розовой лакмусовой бумажки, помещенной между стенкой и пробкой засеянной пробирки. Посевы инкубируют в термостате 1-5 суток. Посинение лакмусовой бумажки свидетельствует о выделении аммиака.

Читайте также:

Определение протеолитических ферментов производят при посеве на

1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ - по ГОСТ 20264.0

2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (ПС)(модифицированный метод Ансона)

2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (ПС)
(модифицированный метод Ансона)