Посев методом серийных разведений
Обновлено: 05.10.2024
Позволяют количественно оценить чувствительность выделенного микроба к антибактериальным средствам и определить МИК препарата. Методы серийных разведений основаны на прямом определении величины МИК.
Для определения величины МИК заданные концентрации антибиотиков вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма. После инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.
В зависимости от характера используемой питательной среды различают метод серийных разведений в бульоне, метод серийных разведений в агаре.
В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют также методы серийных макро – и микроразведений.
Разновидностью метода серийных разведений является также метод, основанный на использовании только двух концентраций антибиотиков или даже одной концентрации, соответствующих пороговым (то есть концентрациям, отделяющим чувствительные микроорганизмы от промежуточных и промежуточные от резистентных). Метод обеспечивает получение качественных результатов, позволяющих отнести исследуемый микроорганизм к определенной категории чувствительности, и часто используется в коммерческих тест-системах.
Метод серийного разведения антибиотика в питательной среде (бульоне).
Первоначально готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотиков в специальном растворителе. Из него готовят ряд убывающих разведений антибиотиков в пробирках с бульоном (чаще двухкратные) и добавляют испытуемую культуру (обычно 10 5 -10 6 бактериальных клеток). Контролем служит пробирка с бульоном и культурой без антибиотиков. Сроки инкубации зависят от вида микроорганизма (чаще сутки). Определяют МИК, которая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста (прозрачная питательная среда). Для определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) из нескольких последних пробирок с задержкой роста делают посев петлей на сектора чашки Петри. За МБК, которая, как правило, на несколько разведений меньше МИК, принимают концентрацию препарата в последней пробирке, посев из которой не дал роста.
Метод серийных разведений в плотной питательной среде.
Этот метод более чувствителен и точен, чем метод бумажных дисков. Каждый антибиотик испытывают, как правило, в трех концентрациях (исходя из уровней чувствительности микроорганизмов), которые добавляют к расплавленному и охлажденному агару. Агар с антибиотиками разливают в чашки Петри. Контролем служит чашка с агаром без антибиотиков. Посев производят петлей или лучше штампом-репликатором, который позволяет одновременно определить чувствительность к трем концентрациям антибиотиков 25-50 культур (в зависимости от числа лунок в штампе). Учет роста в термостате осуществляют спустя сутки. Культура считается чувствительной, если на месте посева нет роста ни одной колонии.
- чувствительные культуры – их рост подавлен всеми тремя концентрациями (можно применять антибиотики в средней терапевтической дозе);
- среднечувствительные (можно применять антибиотики только в увеличенной дозе) – рост подавляют вторая и третья концентрация антибиотиков;
- умеренно-устойчивые подавляет только третья наиболее высокая концентрация (антибиотики применяют только местно);
- устойчивые (антибиотики применять нельзя по тестам in vitro) - растут на всех трех концентрациях.
Метод серийных разведений в плотных средах для определения чувствительности к антибиотикам ( антибактериальным средствам ). Диффузионные методы. Метод дисков.
Диффузионные методы. Метод дисков.
Диффузионные методы менее точны, чем методы разведений, но более просты в исполнении и позволяют определять чувствительность к нескольким ЛС одновременно. Поэтому их чаще применяют на практике. Исходный метод. Чашки Петри заполняют питательной средой, соответствующей пищевым потребностям возбудителя, слоем в 4-5 мм.
После застывания агар подсушивают в термостате при 37 "С в течение 20 мин. Посев тест-культуры можно осуществлять внесением в полуостывший агар, но чаще микробную взвесь наслаивают на агар. После равномерного распределения по поверхности излишки взвеси удаляют, а чашки подсушивают в термостате. В агаре пробивают лунки и в каждую вносят по 0,1 мл раствора исследуемых препаратов, после чего инкубируют 18 ч при 37 °С (срок инкубации может варьировать в зависимости от скорости роста микроорганизма). Активность учитывают, измеряя диаметр зоны подавления роста для каждого препарата.
Метод дисков. В настоящее время вместо классического (исходного) метода повсеместно применяют модификацию, предложенную Кирби и Бауэром и признанную стандартным тестом. После посева тест-культуры на агар наносят диски из фильтровальной бумаги, пропитанные различными антимикробными препаратами (используют коммерческие образцы, содержащие известные концентрации). После инкубации при 37 "С в течение времени, необходимого для роста выделенного возбудителя, проводят определение диаметра зоны торможения роста. Размеры зон, полученные в опыте, сравнивают с величинами зон задержки роста, указанными в инструкциях, прилагаемых к дискам, после чего выделенные микроорганизмы относят к чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным.
Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.
Метод серийных разведений в агаре позволяет одновременно определить МПК партии штаммов (от 15 до 30 клинических штаммов + контрольные штаммы, в зависимости от используемой модели инокулятора).
Процедура
Принцип метода заключается в посеве тестируемых микроорганизмов на чашки Петри с агаром, содержащим последовательные двойные разведения антибиотиков. Одновременно проводится тестирование партии клинических штаммов и соответствующих контрольных штаммов, а также контроль роста микроорганизмов на чашках без АБП и контроль чистоты культуры путем высева образцов инокулюма на неселективные питательные среды.
Приготовление серийных разведений АБП
Из основного раствора исследуемого АБП готовят рабочий раствор в концентрации в 10 раз превосходящей максимальную из используемых в конкретном исследовании. Затем говят серию двукратных разведений рабочего раствора. Таким образом, концентрация в АБП в каждом последующем разведении должна быть в 2 раза меньшей чем в предыдущем. Для приготовления серии разведений используются любые стерильные химически инертные лабораторные ёмкости с завинчивающимися крышками объёмом не менее 10 мл (для удобства размешивания).
Питательная среда
Сухая агаризованная питательная среда растворяется и автоклавируется в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования колбы с питательной средой помещаются на водяную баню при 48 - 50 °С, где выдерживаются до достижения указанной температуры, после чего в них асептически вносят рабочие растворы антибиотиков (1 часть рабочего раствора АБП на 9 частей расплавленного агара) и, при необходимости, термолабильные питательные добавки. Затем среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри, толщина слоя питательной среды должна быть 3 - 4 мм.
Вторым способом приготовления чашек Петри с агаром, содержащим разведения АБП, является смешивание питательной среды и раствора АБП непосредственно в чашке Петри. Для приготовления стандартных пластиковых чашек диаметром 90 мм необходимо к 2 мл раствора АБП добавить 18 мл разогретого до 50 °С жидкого агара. Чашки предварительно маркируются с указанием препарата и его концентрации. Очень важно тщательно перемешивать агар до того, как он начнёт застывать для равномерного распределения АБП по всей толще питательной среды. Перемешивание производится на горизонтальной поверхности последовательно плавными разнонаправленными круговыми движениями чашки. После приготовления чашек агар должен затвердеть в горизонтальном положении. Нельзя резко передвигать, переносить чашки до полного застывания агара.
Параллельно с чашками Петри, содержащими растворы антибиотиков, для контроля роста готовят чашки Петри без антибиотиков. Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания и подсушивания на 10 - 12 ч.
Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно, однако допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах при + 4 - + 8 °С в течение 5 сут. При этом необходимо иметь в виду, что некоторые бета-лактамные антибиотики (прежде всего, ампициллин, цефаклор, имипенем), особенно при низких концентрациях не выдерживают даже указанный срок хранения. В этой связи стабильность антибиотиков в приготовленных в лаборатории чашках Петри целесообразно устанавливать экспериментально с использованием референтных штаммов.
Приготовление инокулюма и инокуляция
Конечная посевная доза исследуемого микроорганизма на поверхности питательной среды должна составлять 10 4 КОЕ. Поскольку коммерческие инокуляторы или стандартная бактериологическая петля диаметром 3,0 мм переносят 1 - 2 мкл жидкости, концентрация микроорганизмов в исходной суспензии должна быть 10 7 КОЕ/мл. Такую концентрацию можно получить при разведении стандартной микробной суспензии, соответствующей стандарту 0,5 по МакФарланду, в 10 раз. Полученную суспензию необходимо инокулировать на поверхность агара в течение 15 мин. после приготовления, при этом образуется пятно диаметром 5 - 8 мм.
Для контроля качества приготовления суспензий периодически рекомендуется проводить подсчет реальных колониеобразующих единиц путем высева образца приготовленного инокулюма на неселективные питательные среды.
Инкубация
После инокуляции чашки оставляют при комнатной температуре для подсыхания, далее переворачивают и инкубируют при температуре 35 °С в течение 18 - 24 ч (в зависимости от вида тестируемого микроорганизма).
Учет результатов
Учет результатов проводят, поместив чашку на темную не отражающую свет поверхность. За МПК принимают концентрацию, вызвавшую полную ингибицию видимого роста. Для дифференцировки нежного роста от налета, оставшегося после инокулята, в ряде случаев целесообразно использовать увеличение. Появление единственной колонии на чашке с концентрацией на 1 разведение выше, чем явная МПК, можно не учитывать. Результат оценки антибиотикочувствительности имеет смысл учитывать только при подтверждении чистоты культуры (см. контроль качества).
Контроль качества
При постановке методов серийных разведений в агаре необходимо проводить контроль роста культуры на чашке Петри с питательной средой, не содержащей АБП. Важнейшим требованием контроля качества является высев, использованной для инокуляции суспензии на плотную неселективную среду для подтверждения чистоты культуры! Каждая партия тестируемых штаммов сопровождается внутренним контролем качества исследования с использованием соответствующих контрольных (референтных) штаммов.
Общие замечания по методам серийных разведений
Несмотря на то, что методы серийных разведений являются наиболее точными и информативными, их постановка в практических лабораториях сопряжена со значительными методическим трудностями. Прежде всего речь идет о необходимости использования субстанций антибиотиков с известным уровнем активности, строгого соблюдения режимов хранения, тщательного выполнения контроля качества питательных сред, трудоемкости приготовления рабочих растворов антибиотиков.
Использование коммерческих тест-систем на основе метода микроразведений позволяет избегать трудоемких процедур по стандартизации подготовительных этапов, но при этом обеспечивает получение достоверных количественных результатов по уровню антибиотикорезистентности. Весьма экономичным и простым в исполнении является также вариант метода серийных микроразведений, основанный на использовании двух пороговых концентраций, позволяющий получить качественные результаты (т.е. распределить штаммы по чувствительности на три категории).
Приготовление растворов антибиотиков. Различают основные растворы антибиотиков (пригодные для хранения) и рабочие — те, которые необходимо использовать ex tempore для приготовления питательных сред.
Для приготовления основных растворов антибиотиков используют субстанции препаратов с известной активностью; лекарственные формы непригодны. Для приготовления навесок антибиотиков следует использовать аналитические весы или другие равного класса точности.
Основные растворы антибиотиков готовят в концентрации 1000 мкг/мл и выше. Навески антибиотиков для приготовления основных растворов готовят с учетом их активности. Расчет навески антибиотика для приготовления основного раствора проводят по формуле
Масса навески = (Объем растворителя ∙ Необходимая концентрация):(Активность субстанции (содержание антибиотика))
В связи с тем что антибактериальные препараты существенно различаются по растворимости, в ряде случаев используют разные растворители, а для доведения их до заданной концентрации — разбавители. В тех случаях, когда растворители и разбавители являются разными веществами, для солюбилизации антибиотика необходимо использовать минимально возможное количество растворителя.
Основные растворы необходимо хранить при температуре не выше —20 °С (сроки хранения отдельных антибиотиков при этой температуре существенно различаются). Оптимальные условия для хранения основных растворов антибиотиков — температура —60 °С и ниже, продолжительность не более 6 мес. При этом необходимо иметь в виду, что основные растворы бета-лактамных антибиотиков могут терять активность и в более ранние сроки.
Извлеченные из холодильника флаконы с основными растворами не открывают и доводят до комнатной температуры для предотвращения конденсации влаги. Размороженные основные растворы должны быть использованы для приготовления рабочих растворов; повторное замораживание не допускается.
Из основных растворов готовят рабочие 2-кратные концентрации антибиотиков. За основу принимают конечную концентрацию антибиотика в питательной среде — 1 мкг/мл (более высокие — 2, 4, 8 и т. д.; более низкие — 0,5, 0,25, 0,125 и т. д.). При этом, рассчитывая реальные концентрации рабочих растворов, учитывают фактор разбавления раствора антибиотика в питательной среде (обычно 1 : 10). Для приготовления рабочих растворов используется дистиллированная вода. Диапазон концентраций зависит от целей исследования.
Метод серийных разведений в агаре. Приготовление чашек Петри с растворами антибиотиков. Сухую агаризованную питательную среду растворяют и автоклавируют в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования колбы с питательной средой помещают на водяную баню, где выдерживают до достижения 48…50 °С. После этого в них асептически вносят рабочие растворы антибиотиков (1 часть рабочего раствора антибиотика на 9 частей расплавленного агара) и при необходимости термолабильные питательные добавки. Затем среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри; толщина слоя должна быть 3…4 мм.
Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах при 4…8 °С в течение 5 сут, однако некоторые бета-лактамные антибиотики (прежде всего ампициллин, цефаклор, имипенем), особенно при низких концентрациях, не выдерживают даже указанный срок хранения. В этой связи стабильность антибиотиков в приготовленных в лаборатории чашках Петри целесообразно устанавливать экспериментально с использованием референтных штаммов.
Для контроля роста используют чашки Петри без антибиотиков.
Инокуляция, инкубация. Конечная посевная доза исследуемого микроорганизма на поверхности питательной среды должна составлять 10 4 КОЕ. Поскольку коммерческие инокуляторы или стандартная бактериологическая петля диаметром 3 мм переносят 1…2 мкл жидкости, концентрация микроорганизмов в исходной суспензии должна быть 10 7 КОЕ/мл.
Полученную суспензию необходимо инокулировать на поверхность агара в течение 15 мин после приготовления, при этом образуется пятно диаметром 5…8 мм.
После засева чашки Петри оставляют при комнатной температуре для подсыхания, затем переворачивают и инкубируют при 37 °С в течение 16…20 ч.
Для контроля качества приготовления суспензий периодически проводят подсчет реальных колониеобразующих единиц путем высева на неселективные питательные среды.
Важнейшим требованием контроля качества применения метода оценки антибиотикочувствительности является высев использованной для инокуляции суспензии на плотную неселективную среду (например, МПА) для контроля чистоты культуры.
Оценивать антибиотикочувствительностъ имеет смысл только при подтверждении чистоты культуры.
Учет результатов. Учет результатов проводят, поместив чашку на темную неотражающую поверхность. За МПК принимают концентрацию, вызвавшую полную ингибицию видимого роста. Для дифференцировки нежного роста от налета, оставшегося после инокулята, в ряде случаев целесообразно использовать лупу. Наличие единственной колонии на чашке с концентрацией на одно разведение выше, чем явная МПК, можно не учитывать.
Методы серийных разведений в бульоне. Различают два основных варианта метода серийных разведений в бульоне: макрометод (пробирочный) и микрометод (при величине конечного объема 0,2 мл и меньше).
Рабочие растворы антибиотиков для макро — и микрометодов готовят по одинаковой схеме, аналогичной той, которая была описана для метода серийных разведений в агаре. Отличие заключается в том, что для приготовления используют не дистиллированную воду, а жидкую питательную среду. Необходимо также рассчитать концентрацию рабочего раствора антибиотика так, чтобы после инокуляции конечная его концентрация была равна заданной.
Жидкую питательную среду, прошедшую предварительный контроль качества, готовят в соответствии с инструкцией изготовителя.
При постановке методов серийных разведений необходим контроль роста культуры в среде без антибиотика и качества с использованием референтных штаммов. Выбор референтного штамма определяется видом исследуемого микроорганизма. Необходимо также контролировать чистоту суспензии микроорганизма, использованной для инокуляции, путем высева на неселективные среды.
Макрометод серийных разведений в бульоне. Наиболее распространен следующий способ.
Рабочие растворы антибиотиков в жидкой среде, приготовленные в асептических условиях в концентрациях, в 2 раза превышающих заданные, вносят по 1 мл в пробирки.
Суспензию исследуемого микроорганизма готовят из бульонной или агаровой культуры на стерильном изотоническом растворе. Затем ее разводят в жидкой питательной среде до концентрации 10 6 КОЕ/мл и вносят по 1 мл в пробирки с растворами антибиотиков. Таким образом, конечная концентрация микроорганизмов в инкубационной среде будет равна 5 ∙ 10 5 КОЕ/мл.
Пробирки закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками или металлическими колпачками, инкубируют при 37 °С в течение 16…20 ч.
Микрометод серийных разведений в бульоне. Метод серийных разведений в бульоне легко поддается модификациям для разработки коммерческих тест-систем. При использовании коммерческих тест-систем следует пользоваться инструкциями изготовителей.
Постановка метода в системах, изготовленных в лабораторных условиях, во многом сходна с методом серийных макроразведений. Наиболее удобно для постановки метода в лабораторных условиях использовать 96-луночные планшеты для иммунологических исследований. Значительным преимуществом метода микроразведений является возможность одновременно применять достаточное количество планшетов, хранить их и использовать по мере необходимости.
Первым этапом является изготовление планшетов, пригодных для хранения. Концентрацию рабочих растворов антибиотиков, вносимых в лунки планшетов, рассчитывают исходя из схемы последующей инокуляции, которая должна основываться на необходимости создания в лунке конечной концентрации исследуемого микроорганизма 5 ∙ 10 5 КОЕ/мл. После внесения рабочих растворов антибиотиков в лунки запаянные в полиэтилен планшеты могут храниться при температуре ниже —60 °С до момента использования. Повторное замораживание не допускается.
Для проведения исследования планшеты после извлечения из холодильника выдерживают до достижения ими комнатной температуры. Суспензию исследуемого микроорганизма готовят из агаровой или бульонной культуры и доводят до заданной концентрации.
Инокуляцию проводят в течение 15 мин после приготовления суспензии. Инкубацию осуществляют при 37 °С в течение 16…20 ч. Для предотвращения высыхания содержимого лунок планшеты закрывают крышкой.
Учет результатов при постановке макро — и микрометодов проводят визуально по появлению видимой мутности или спектрофотометрически. За МИК принимают минимальную концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста.
Общие замечания по методам серийных разведений. Несмотря на то что методы серийных разведений наиболее точные и информативные, их постановка в практических лабораториях сопряжена с определенными методическими трудностями: необходимость использования антибиотиков с четко известным уровнем активности, соблюдения жестких низкотемпературных режимов хранения, контроля качества питательных сред и трудоемкость приготовления рабочих растворов антибиотиков.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ
К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ
Дата введения: с момента утверждения
1. РАЗРАБОТАНЫ: Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии (Н.А.Семина, С.В.Сидоренко); Государственным научным центром по антибиотикам (С.П.Резван, С.А.Грудинина); Научно-исследовательским институтом антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии (Л.С.Страчунский, О.У.Стецюк, Р.С.Козлов, М.В.Эйдельштейн); Кафедрой микробиологии и химиотерапии Российской медицинской академии последипломного образования (Е.А.Ведьмина, Л.Г.Столярова, И.В.Власова); Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (З.С.Середа).
2. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 4 марта 2004 г.
3. ВВЕДЕНЫ ВЗАМЕН "Методических указаний по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков", утв. Заместителем Главного государственного санитарного врача СССР В.Е.Ковшило 10 марта 1983 г. N 2675-83.
1. Область применения
1.1. В настоящих методических указаниях изложены стандартные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (методы серийных разведений и диско-диффузионный метод).
1.2. Методические указания предназначены для применения в микробиологических лабораториях учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы и здравоохранения.
2. Общие сведения
Определение чувствительности микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека к антибактериальным препаратам (АБП) - приобретает все более важное значение в связи с появлением и широким распространением антибиотико-резистентности у бактерий. Стандартные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП (диско-диффузионный и серийных разведений) были разработаны во второй половине 60-х - начале 70-х годов XX века и с тех пор с методической точки зрения не претерпели принципиальных изменений.
Однако внедрение в клиническую практику значительного количества новых АБП и появление новых механизмов антибиотико-резистентности у микроорганизмов потребовало более строгой стандартизации процедуры тестирования, разработки новых подходов к интерпретации результатов, внедрения современной системы внутреннего контроля качества на каждом этапе исследования.
В настоящих методических указаниях систематизированы современные подходы к определению чувствительности бактериальных возбудителей инфекционных заболеваний человека, учитывающие рекомендации Европейского комитета по определению чувствительности к антибиотикам, а также Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам США.
Исследования чувствительности микроорганизмов к АБП осуществляются для решения следующих задач:
- обоснование целенаправленной индивидуальной антибактериальной терапии для лечения конкретной инфекционной болезни отдельным пациентам;
- обоснование эмпирической терапии отдельных нозологических форм инфекционных болезней в пределах лечебных учреждений или географических регионов;
- осуществление наблюдения за распространением антибиотико-резистентности в отдельных учреждениях или географических регионах;
- исследование новых химических соединений на наличие антибактериальной активности.
3. Показания для исследования чувствительности микроорганизмов
к антибактериальным препаратам
В ходе повседневной деятельности в бактериологических лабораториях из различных биологических материалов и объектов внешней среды выделяют множество бактерий, относящихся к различным таксономическим группам. Однако определение чувствительности выделенных микроорганизмов к АБП показано далеко не во всех случаях. Определение показаний для исследования чувствительности микроорганизмов к АБП является обязанностью врача-бактериолога.
Определять чувствительность к АБП представителей нормальной микрофлоры человека, при их выделении из естественных мест обитания, бактерий, выделенных из объектов внешней среды, за исключением случаев проведения специальных исследований, нецелесообразно.
Обязательному исследованию на чувствительность к АБП подлежат все микроорганизмы, выделенные из первично стерильных жидкостей, органов и тканей человека. В остальных случаях оценке чувствительности должна предшествовать оценка клинической значимости выделенного микроорганизма.
Определение чувствительности выделенного штамма микроорганизма показано, если уровень его устойчивости к АБП не может быть предсказан на основании данных идентификации или вероятной таксономической принадлежности микроорганизма. Практически важной задачей является выявление приобретенной резистентности к АБП у природно-чувствительных к ним микроорганизмов. Подтверждение природной чувствительности или резистентности микроорганизма к АБП не является целью практических исследований.
Исследованию по оценке антибиотикочувствительности подлежат чистые культуры микроорганизмов или материал изолированных колоний с плотных питательных сред после первичного посева образца клинического материала, в последнем случае параллельно необходимо провести идентификацию культуры.
При обнаружении на плотных питательных средах после первичного посева смешанной культуры исследовать антибиотикочувствительность до идентификации и оценки этиологической значимости отдельных микроорганизмов нецелесообразно.
Прямое определение чувствительности с использованием клинического материала (без выделения чистой культуры) возможно только в исключительных случаях при условии подтверждения однородности культуры и высокой степени обсемененности при окраске по Граму, причем исследование следует повторить после выделения чистой культуры микроорганизма.
Следует уделять особое внимание определению чувствительности микроорганизмов, относящихся к таксономическим группам, для которых характерна высокая частота распространения приобретенной резистентности.
У микроорганизмов, проявляющих универсальную чувствительность к каким-либо АБП, т.е. когда случаев резистентности не описано (например, Streptococcus pyogenes - все штаммы чувствительны к пенициллину), проводить определение чувствительности к этим препаратам в повседневной практике нецелесообразно.
Факты выявления резистентности у микроорганизмов, для которых этот феномен ранее не был описан в научной литературе, следует оценивать с крайней осторожностью и рекомендуется обращаться за консультациями в лаборатории, занимающиеся изучением антибиотико-резистентности.
Не следует в практических целях исследовать микроорганизмы, для которых методы определения чувствительности в настоящее время не стандартизованы и отсутствуют критерии интерпретации результатов. Результаты, полученные в данном случае, не могут служить основанием для назначения антибактериального препарата, если соответствующая нозологическая форма не приведена в утвержденной инструкции по его применению.
4. Методы определения чувствительности микроорганизмов
к антибактериальным препаратам
4.1. Общая характеристика методов
Современные стандартизованные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП подразделяют на методы серийных разведений и диффузионные.
Методы серийных разведений основаны на прямом определении основного количественного показателя, характеризующего микробиологическую активность АБП - величины его минимальной подавляющей концентрации (МПК).
МПК - минимальная концентрация, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма в бульонной культуре или на плотной среде.
Для определения МПК заданные концентрации АБП вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма и после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.
В зависимости от характера используемой питательной среды различают методы серийных разведений в агаре или в бульоне. В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют методы серийных макро- и микроразведений.
Разновидностью метода серийных разведений является также метод, основанный на использовании только двух концентраций АБП, соответствующих пограничным значениям МПК (см. ниже). Этот принцип исследования широко используется в автоматизированных системах для определения чувствительности микроорганизмов.
Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диффузии АБП из носителя в плотную питательную среду и подавлении роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация АБП превосходит МПК.
В настоящее время существуют две основные модификации диффузионного метода: диско-диффузионный и Е-тест.
В диско-диффузионном методе в качестве носителя АБП используют бумажный диск. Образование зоны подавления роста происходит в результате диффузии АБП из носителя в питательную среду. В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК. Однако диско-диффузионный метод позволяет лишь косвенно судить о величине МПК, а результатом исследования является отнесение микроорганизма к одной из категорий чувствительности (чувствительный, промежуточный или резистентный).
Е-тест представляет собой узкую полоску полимера (0,5х6,0 см), на которую нанесен градиент концентраций АБП (от минимальных до максимальных). Подавление роста микроорганизма вокруг полоски Е-теста происходит только в той зоне, где концентрация АБП, диффундирующего из носителя, выше МПК, при этом образуется каплевидная зона ингибиции. Значения концентрации АБП в каждом участке носителя типографским способом нанесены на наружной (обращенной к исследователю) поверхности Е-теста. Величину МПК учитывают в том месте, где граница зоны подавления роста вплотную подходит к носителю. Детальные инструкции по определению чувствительности с использованием Е-тестов прилагаются изготовителем к набору реактивов.
4.1.1. Основные этапы проведения тестирования
Оценка антибиотикочувствительности, независимо от конкретного метода, предполагает последовательное выполнение нескольких этапов:
- приготовление питательных сред;
- приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулюма);
- учет и интерпретация результатов, формулировка рекомендаций по лечению.
Диффузионные методы включают также этап наложения дисков или полосок Е-теста на плотную питательную среду.
4.1.2. Приготовление питательных сред для определения чувствительности
Для оценки чувствительности используют специально предназначенные для этой цели среды, разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке и по своим характеристикам удовлетворяющие требованиям, приведенным в разделе 5. Внутрилабораторный контроль качества среды проводят при использовании всех сред, разрешенных к применению в Российской Федерации в установленном порядке.
Вид питательной среды для оценки чувствительности определяют выбранным методом проведения исследования (агар или бульон), а также видом тестируемого микроорганизма.
Агар разливают по чашкам слоем толщиной 4 мм (на чашку диаметром 100 мм требуется 25 мл агара, на чашку диаметром 90 мм - 20 мл). Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах в холодильнике при 4-8 °С в течение 5 суток.
4.1.3. Приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулюма)
Общим и принципиально важным для всех методов тестирования является стандартизация суспензии исследуемого микроорганизма, ее концентрация должна составлять 1,5·10 КОЕ/мл. Практически наиболее приемлемым методом оценки концентрации бактериальной суспензии является измерение ее оптической плотности. Оптическая плотность бактериальной суспензии с концентрацией 1,5·10 КОЕ/мл при визуальном контроле соответствует стандарту мутности 0,5 по МакФарланду. Контроль оптической плотности суспензии можно также осуществлять спектрофотометрически (денситометрически). Существуют коммерчески доступные стандарты мутности и спектрофотометры. Бактериальную суспензию можно готовить либо из бульонной, либо из агаровой культуры.
Приготовление инокулюма из агаровой культуры
Для приготовления инокулюма используют чистую суточную культуру микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах. Отбирают несколько однотипных, четко изолированных колоний, выросших на неселективных плотных питательных средах. Петлей переносят незначительное количество материала с верхушек колоний в пробирку со стерильным физиологическим раствором или питательным бульоном, доводя плотность инокулюма точно до 0,5 по стандарту МакФарланда. Инокулюм следует использовать в течение 15 мин после приготовления.
Приготовление инокулюма из бульонной культуры
При определении чувствительности быстро растущих бактерий с обычными питательными потребностями для приготовления инокулюма также можно использовать 5-6-часовую бульонную культуру микроорганизма. Для этого отбирают несколько однотипных изолированных колоний, петлей переносят незначительное количество материала в пробирку с 4,0-5,0 мл жидкой неселективной питательной средой. Инкубируют при 35 °С. Через 5-6 ч инкубации плотность микробной суспензии приблизительно соответствует необходимой, и ее точно доводят до 0,5 по МакФарланду путем добавления стерильного бульона или физиологического раствора.
Стандарт МакФарланда может быть либо приобретен, либо приготовлен в лаборатории.
4.1.4. Приготовление стандарта 0,5 по МакФарланду
К 0,5 мл раствора ВаСl в концентрации 0,048 моль/л (1,175% раствор ВаСl·2HO) медленно при тщательном перемешивании добавить 99,5 мл раствора HSO в концентрации 0,18 моль/л (1%) до получения гомогенной суспензии.
Полученную суспензию необходимо разлить по 4-6 мл в пробирки с герметично закрывающимися крышками. Пробирки должны быть такого же диаметра, как и используемые для приготовления бактериальной суспензии.
Хранить пробирки с суспензией необходимо в темноте при комнатной температуре.
Перед использованием пробирки необходимо тщательно встряхивать и оценивать однородность суспензии. При появлении видимых частиц пробирки изымаются из употребления.
Стандарт мутности необходимо обновлять или проверять его оптическую плотность ежемесячно.
4.2. Методы серийных разведений
4.2.1. Приготовление растворов АБП для методов серийных разведений
Общим и крайне важным этапом для всех методов серийных разведений является приготовление растворов АБП. Различают "основные" растворы АБП (пригодные для хранения) и "рабочие" - те, которые необходимо использовать "ех tempore" для приготовления питательных сред.
Для приготовления основных растворов АБП необходимо использовать субстанции АБП с известной активностью, лекарственные формы не пригодны. Для взвешивания субстанций необходимо использовать электронные лабораторные весы с точностью до 4 знака, для измерения объемов - калиброванные дозаторы и пипетки.
Читайте также: