Посев на мясопептонный агар

Обновлено: 05.07.2024

(МПА) - основная плотная питательная среда, используемая для выращивания хемоорганотрофных бактерий. Готовят на основе МПБ, добавляя к нему 1,5 - 3% агара(см.), или на мясной воде, добавляя к ней 1 % пептона, 0,5% натрия хлорида и 1,5 - 3% агара. Смесь кипятят до растворения, осветляют, пропускают в горячем виде через ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН, разливают в бутыли и стерилизуют при 120°С в течение 15 -30 мин. См. Питательные среды бактериологические.

Смотреть что такое "Мясопептонный агар" в других словарях:

агар мясопептонный — (МПА) плотная или полужидкая питательная среда для культивирования микробов, состоящая из мясопептонного бульона и агара (0,5 2%); служит основой многих питательных сред … Большой медицинский словарь

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ — ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ, искусственные среды того или иного состава, предназначенные для культивирования микробов и простейших в лабораторных условиях. Впервые были введены для изолирования отдельных видов бактерий Р. Кохом в 1881 году, что создало… … Большая медицинская энциклопедия

Бактерии — под именем бактерий в науке известны мельчайшие, микроскопической величины организмы, принадлежащие к растительному царству. По своей организации, по своим морфологическим особенностям, Б. ближе всего стоят к так называемым циановым или… … Энциклопедический словарь Ф.А. Брокгауза и И.А. Ефрона

Пита́тельные сре́ды — субстраты, состоящие из компонентов, обеспечивающих необходимые условия для культивирования микроорганизмов или накопления продуктов их жизнедеятельности. Питательные среды различаются по назначению, консистенции и составу. По назначению их… … Медицинская энциклопедия

Мико́зы — (лат. mycoses; греч. mykēs грибок + ōsis) заболевания, вызываемые паразитическими грибками. Выделяют М. убиквитарные, т.е. распространенные повсеместно (например, актиномикоз, кандидамикоз, трихофития), и эндемичные, т.е. имеющие ареалы… … Медицинская энциклопедия

Питательная среда — Питательная среда вещество или смесь веществ, применяемая для культивирования макро и микроорганизмов. Существует множество стандартных биологических питательных сред. Содержание 1 Требования, предъявляемые к средам 2 Классификация … Википедия

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ — Аг антиген АЕ антитоксическая или антигенная единица антибактер. антибактериальный Ат антитело АТФ аденозинтрифосфорная кислота бактер. бактериальный бактериол бактериологический бактериоскоп. бактериоскопический БАС бактерицидная активность… … Словарь микробиологии

Питательные среды для бактерий — Под этим именем подразумевают различного рода субстраты, приготовляемые для изучения жизнедеятельности микроорганизмов при определенных условиях, изменяемых по воле экспериментатора. Микрохимические анализы и опыты искусственной культуры выяснили … Энциклопедический словарь Ф.А. Брокгауза и И.А. Ефрона

Физиологические и биохимические свойства лучистых грибков — Лучистые грибки очень неразборчивы в выборе пищи. Они могут развиваться на скалах, где имеются только ничтожные количества питательных веществ, в грунтах, содержащих углеводороды, и в почвах, разлагая при этом гумусовые вещества,… … Биологическая энциклопедия

К мясо — пептоному бульону добавляют 2% морской водоросли агар-агара, который плавится при 100°С и затвердевает при комнатной температуре. После стерилизации в автоклаве мясо — пептонный агар, разлитый в пробирки, оставляют застыть столбиком или готовят скошенный агар, укладывая пробирки в наклонном положении под углом 20°С.

Питательные среды должны отвечать следующим требованиям:

1. питательность - среды должны содержать доступные источники азота, углерода и энергии;

2. изотоничность - они должны содержать набор солей для поддержания осмотического давления;

3. оптимальный показатель рН (для большинства бактерий 7,2-7,6);

4. оптимальный окислительно-восстановительный (редокс) потенциал - высокий для аэробов, низкий для анаэробов;

5. прозрачность, чтобы был виден рост бактерий;

6. стерильность, чтобы не было других бактерий.

28.Классификация сред.

По происхождению среды подразделяют на естественные (природные), искусственные и синтетические.

-Естественные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворотка, желчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения.

-Искусственные среды изготовлены по определённым рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.

-Синтетические среды – содержат определённые химические соединения в точно указанных концентрациях.

По концентрации среды бывают жидкие, полужидкие, плотные, сыпучие, сухие.

По назначению среды подразделяют на основные (простые: 1%-ная пептонная вода, мясопептонный бульон/агар, бульон/агар Хоттингера и сложные: сахарный бульон/агар, сывороточный бульон/агар, кровяной агар, желчный бульон, желточно-солевой агар); специальные (обогащенные, среды для хранения), элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие, транспортные, накопительные.

-основные (МПА, МПБ) – простые по составу и применяются для культивирования большинства неприхотливых бактерий;

-обогащенные – на основе простых + кровь, сыворотка, асцитическая жидкость и др. Используют для накопления определенной группы бактерий за счет создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто в качестве подобных агентов используют различные красители и химические вещества – соли желчных кислот, тетратионат Na⁺, теллурит K⁺; антибиотики, фуксин, генциановый фиолетовый, бриллиантовый зеленый и др.

-дифференциально-диагностические - позволяют различить бактерии по их росту, биохимической активности и другим признакам. В состав этих сред, кроме питательных веществ, обычно включают субстрат, по отношению к которому дифференцируются бактерии, и индикатор. Если микроб ферментирует субстрат, входящий в состав среды, то сдвигается рН среды, и в результате колонии окрашиваются в цвет индикатора;

-элективные - используют для избирательного культивирования микроорганизмов определенных видов при подавлении роста других микроорганизмов за счет добавления в среду различных ингибиторов роста микробов, изменения показателя рН, состава питательных веществ в среде и др.

-среды накопления - на которых одни виды размножаются быстрее других;

-транспортные и консервирующие среды предупреждают отмирание патогенов и подавляют рост сапрофитов, их применяют для временного сохранения микроорганизмов после взятия исследуемого материала.

29.1) лаг-фаза (англ. lag — запаздывание) — период между посевом бактерий и началом их размножения, продолжительностью 4-5 часов;

Z) фаза логарифмического (экспоненциального) роста — период интенсивного деления бактерий, продолжительностью 5-6 часов;

3) фаза стационарного роста, при которой количество жизнеспособных клеток не изменяется, составляя максимальный уровень (М-концентрация);

4) фаза гибели бактерий.

Указанные методы пригодны для посева аэробных и факультативно анаэробных бактерий, а также нестрогих анаэробов.

-Биологический метод получения чистых культур бактерий. Исследуемым материалом заражают лабораторное животное, чувствительное к какому-то одному микроорганизму, содержащемуся в патологическом материале. У животного возникает инфекционный процесс с накоплением возбудителя во внутренних органах, из которых и выделяют чистую культуру.

-Физический метод получения чистых культур бактерий. Используется для получения чистых культур спорообразующих бактерий. Исследуемый патологический материал подвергают кипячению в течение 5 минут для уничтожения не образующих спор ассоциантов, после чего засевают материал на питательные среды.

-Химический метод получения чистых культур бактерий. Используется для получения чистых культур кислотоустойчивых микроорганизмов, главным образом, микобактерий. Исследуемый патологический материал обрабатывают 5%-м раствором серной кислоты, под действием которого погибают некислотоустойчивые ассоцианты. После нейтрализации кислоты материал засевают на питательные среды

-Метод механического разобщения для получения чистых культур бактерий.

а) Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель переносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й – минимальное. В зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на одной из чашек вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры микроорганизма.

б) Рассев петлей (посев штрихами). Метод принципиально не отличается от предыдущего, но более экономичен. Берут одну (. ) чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки.

31. Анаэробы. Посевы анаэробных бактерий в жидких средах заливают вазелиновым или другим маслом. При использовании плотных сред посевы культивируют в специальных устройствах — анаэростатах (откуда откачивают воздух) либо заливают посевы тонким слоем агара. Анаэробные условия можно создать химическим путём, поместив посевы в эксикаторы, на дно которых заливают щелочной раствор пирогаллола, поглощающего кислород. Также можно использовать методы Фортнера, Цейсслера и Вёйнберга.

Метод Фортнера. Посевы проводят на чашку Петри с толстым слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. На одну половину засевают культуру аэробных бактерий, на другую — анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробов, а затем (после поглощения кислорода) — рост анаэробов.

Метод Цейсслера используют для выделения чистых культур спорообразующих анаэробов. Для этого проводят посев на среду Китта-Тароцци, прогревают 15 мин при 80°С (для уничтожения вегетативных форм), заливают вазелиновым маслом и инкубируют 24 ч. Затем проводят посев на сахарно-кровяной агар для получения чистых культур. После 24-часового культивирования подозрительные колонии изучают и отсевают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Метод Вёйнберга используют для получения чистых культур строгих анаэробов. Культуры, выращенные на среде Китта-Тароцци, вносят в сахарный бульон. Затем пастеровской пипеткой с запаянным концом материал переносят в узкие пробирки (трубки Виньяля) с сахарным МПА, погружая пастерку до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают холодной водой, что позволяет зафиксировать отдельные бактериальные клетки в толще затвердевшего агара. Пробирки инкубируют, и изучают выросшие колонии. При обнаружении подозрительной колонии на её месте делают распил, колонию быстро отбирают и засевают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

32. На первом этапе для получения изолированных колоний делают посев исследуемого материала, как правило, на плотные питательные среды, выбор к-рых обусловливается свойствами предполагаемого возбудителя. Применяют по возможности элективные среды, на к-рых растет только данный вид бактерий, или дифференциально-диагностические среды, позволяющие отличить предполагаемого возбудителя от других микроорганизмов.

На втором этапе проводят исследование колоний бактерий, происходящих от одной бактериальной клетки и выросших на плотной питательной среде (колония и является чистой культурой возбудителя).

Третий этап заключается в идентификации выделенной чистой культуры возбудителя и определении его чувствительности к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам. Идентификацию выделенной бактериальной культуры осуществляют по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным, токсигенным свойствам.

33. Культуральные свойства бактерий - питательные потребности, условия роста и характер роста бактерий на бактериол. средах. В питательные потребности включают источники углерода, азота и ростовых факторов, способность бактерий расти на определенных питательных средах, в условия роста - рН, Eh, концентрацию О2 плотность, осмотическое давление среды, температуру роста; в характер роста - скорость роста (быстрый, медленный), внешний вид к-ры на жидких, плотных и полужидких средах, изменения, к-рые наступают в среде или отдельных ее компонентах в процессе роста микробов. Сведения о К.с. используют при выборе способов культивирования и при идентификации выделенной к-ры.

Для выделения, культивирования и идентификации микроорганизмов в лабораторных условиях используют различные искусственные питательные среды, которые в зависимости от назначения подразделяют на группы:

-обычные, или простые, - для выращивания большинства аэробов и факультативных анаэробов;

-специальные - для культивирования микробов, которые не растут или дают слабый рост на простых питательных средах;

-селективные - для выделения культур одною рода или вида, имеющих преимущество в размножении перед другими представителями микрофлоры;

-дифференциально-диагностические предназначенные для выявления культурально-биохимических особенностей бактерий,

-среды накопления (обогащения) - употребляемые для увеличения численности микробов, наличие которых в исследуемом материале незначительно, при подавлении роста посторонней микрофлоры.

Основой большинства питательных сред животного происхождения является мясная вода, для некоторых - печеночная вода.

Мясная вода. Свежую нежирную говядину или конину освобождают от костей, жира и сухожилий, пропускают через мясорубку или нарезают мелкими кусочками, заливают дистиллированной (водопроводной) водой в соотношении 1 : 2 (на 500 г мяса 1000 см3 воды) и выдерживают 15 - 18 ч в прохладном месте. Затем настой кипятят в течение 40 мин - 1 ч и снимают накипь. После кипения мясную воду остужают для застывания жира, который легко при этом удаляется, фильтруют через ватно-марлевый фильтр до полной прозрачности, затем доливают дистиллированной (водопроводной) водой до первоначального объема, разливают в бутыли и стерилизуют в течение 20 мин при температуре 120 °С и давлении;

Печеночная вода. Свежую говяжью печень, освобожденную от жира пленок, Измельчают на мясорубке и заливают водопроводной водой из расчета 1 : 2, настаивают в течение 1 ч и кипятят 30 мин при постоянно помешивании. После отстаивания фарш удаляют, доводят до первоначального объема дистиллированной водой и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Разлитую по колбам печеночную воду стерилизуют 30-40 мин при температуре 112 °С и давлении 0,05 МПа.

Основной раствор (перевар) Хоттингера. 1000 г мяса (говядины или конины), освобожденного от жира и сухожилий, нарезают кусками по 1-2 см, которые опускают небольшими порциями в кастрюлю с 2000 см3 кипящей водопроводной воды. Кипятят в течение 15-20 минут до свертывания белков (цвет мяса станет серым). Мясо вынимают шумовкой и пропускают через мясорубку, а оставшуюся жидкость фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают pH 8,0. Затем фильтрат соединяют с фаршем, охлаждают до температуры 40 °С в открытой кастрюле и добавляют дважды измельченную поджелудочную железу, предварительно очищенную от жира, соединительной ткани, в количестве 10% к полученной взвеси (на 1000 см3 жидкости 100 г железы) или 0,9 -1,0 % сухого панкреатина (в зависимости от его активности).

Через 1-2 ч после добавления поджелудочной железы или панкреатина проверяют реакцию, устанавливают pH 7,4-7,6 и оставляют смесь для переваривания на 7 -16 сут при комнатной температуре до образования осадка. Первые 3-4 сут переваривания ежедневно встряхивают жидкость не менее трех раз в сутки, в дальнейшем встряхивать можно реже. За 1- 2 сут до окончания переваривания встряхивание прекращают, чтобы гидролизат отстоялся.

Можно ферментативное переваривание проводить в термостате при температуре 40-42 °С в течение 2 сут. Содержимое бутыли взбалтывают 2-3 раза в сутки с открыванием пробки. Конец переваривания характеризуется следующими признаками: жидкость над осадком просветляется и принимает соломенно-желтый цвет. Готовый перевар фильтруют через полотняный или бумажный фильтр, сливают в бутыль и стерилизуют в течение 30 мин при температуре 120 °С. Приготовленный гидролизат можно хранить пять месяцев. Перед употреблением жидкость вновь фильтруют.

Химические показатели готового перевара Хоттингера должны быть следующими: общего азота 900-1200 мг%, амииного азота 600- 750 мг%, триптофана 200-300 мг%

(Свободный триптофан можно обнаружить в качественной реакции, происходящей в кислой среде при взаимодействии его с препаратами хлора; с этой целью к 5 куб. см. питательной среды добавляют 2 капли уксусной кислоты, тщательно перемешивают и вносят несколько капель1%-го водного раствора хлорамина - появление розовой окраски свидетельствует о наличии триптофана.).

Пептонная вода. К 1000 см3 дистиллированной воды добавляют 10-20 г пептона и 5 г хлорида натрия, кипятят 30 мин до растворения пептона, устанавливают pH 7,2-7,4, фильтруют через бумажный фильтр до полной прозрачности, после чего стерилизуют 30 мин при давлении 0,1 МПа и температуре 120 °С.

Пептонная вода может быть использована взамен мясо-пептонного бульона.

Мясо-пептонный бульон (МПБ). К 1000 см3 мясной воды добавляют 10 г сухого пептона и 5 г хлорида натрия, кипятят в течение 30 мин, устанавливают необходимую реакцию, после чего добавляют воду до первоначального объема. Бульон фильтруют через бумажный фильтр, окончательно устанавливают насыщенным раствором гидрокарбоната натрия (питьевой соды) или 10 %-ным раствором гидроксида натрия требуемую реакцию, стерилизуют 15 -20 мин при температуре 120 °С и давлении 0,1 МПа.

Мясо-пептонный бульон предназначен для культивирования аэробных микроорганизмов и изучения показателей роста в жидкой питательной среде по помутнению среды, наличию и характеристике осадка, образованию пристеночного кольца, пленки.

Мясо-пептонный агар (МПА). К 1000 куб.см. мясо-пептонного бульона перед стерилизацией добавляют 20 г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного его растворения.

Мясо-пептонный агар, охлажденный до температуры 50-55 °С, осветляют яичным белком (из расчета один белок на 1000 см3 мясо-пептонного агара), помещают в автоклав, не завинчивая крышку автоклава, или в кипящую водяную баню, чтобы белок свернулся. Горячий мясо-пептонный агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают в нем pH 7,2-7,4, разливают в колбы или пробирки и 20 мин стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С.

Мясо-пептонный агар предназначен для культивирования аэробов и изучения характера роста микробов по величине и форме колоний, линии края, цвету, блеску, прозрачности, консистенции и некоторым другим признакам.

Полужидкий агар (ПЖА). К 1000 куб.см. мясо-пептонного бульона добавляют 3-4 г агара и на слабом огне расплавляют при постоянном помешивании, фильтруют через тканевый фильтр до полной прозрачности, разливают в пробирки по 5 см3 и стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С и давлении 0,1 МПа в течение 30 мин.

Готовый полужидкий агар охлаждают столбиком, среда должна быть совершенно прозрачной.

Полужидкий агар используют для определения подвижности микроорганизмов. С этой целью посев тест-культур проводят уколом в столбик среды, не прокалывая до дна 5-6 мм: подвижные культуры дают диффузный рост и вызывают помутнение всей питательной среды, неподвижные - растут по уколу, среда остается прозрачной, штаммы, обладающие слабой подвижностью, дают помутнение отдельных участков агара обычно вблизи укола.

Питательный желатин (МПЖ). К 1000 см3 мясо-пептонного бульона прибавляют 100 г пищевого желатина высшего сорта. После набухания желатина в течение 1-2 ч растворяют при медленном нагревании на водяной бане при температуре 40 - 50 °С до полного расплавления. Устанавливают pH 7,2 10 %-ным раствором бикарбоната натрия, фильтруют через бумажный фильтр в горячем виде. Если среда мутная, ее осветляют белком куриных яиц, после чего в горячем виде фильтруют через ватно-марлевый фильтр и разливают в пробирки по 7 -8 см3, стерилизуют дробно 3 дня по 30 мин текучим паром или однократно при температуре 110 °С и давлении 0,04 МПа в течение 30 мин. После стерилизации среду охлаждают столбиком.

Среда предназначена для определения протеолитической активности микробов по разжижению желатина. Являясь растворимым белком, полученным из нерастворимого коллагена, под влиянием фермента желатиназы подвергается гидролизу и теряет свои желирующие свойства, в результате при низких температурах остается жидким.

Бульон Хоттингера. К 1000 см3 основного раствора добавляют 500 см3 водопроводной или дистиллированной воды, 3 г хлорида натрия и 0,12 г двузамещенного фосфата калия. Полученный раствор кипятят в течение 15-20 мин, устанавливают pH 7,2-7,4 и фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, затем разливают в колбы или пробирки и стерилизуют в течение 20-30 мин при температуре 120°С и давлении 0,1 МПа.

В бульоне Хоттингера изучают характер роста микроорганизмов в жидкой питательной среде.

Среда Мартена. Свежие свиные желудки освобождают от жира и содержимого и пропускают через мясорубку. На 250 г фарша добавляют 1000 см3 теплой (50 °С) кипяченой водопроводной воды и 10 см3 концентрированной соляной кислоты. Смесь выдерживают при температуре 45-50 °С в течение 24 ч, периодически взбалтывая, затем прогревают текучим паром 30 мин и оставляют в холодном месте на 5 сут. Надосадочную жидкость сливают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы и стерилизуют при температуре 120 °С и давлении 0,1 МПа в течение 30 мин. Полученный пептон Мартена хранят до 3 мес.

Из мяса крупного рогатого скота, освобожденного от жира и сухожилий, готовят фарш. К 500 г фарша добавляют 1000 см3 дистиллированной воды. Полученную смесь выдерживают при 4-8 °С в течение 24 ч, после чего кипятят на слабом огне 2 ч, постоянно подливая воду до первоначального объема. Фарш отжимают и удаляют, мясную воду фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы и стерилизуют при температуре 120 °С и давлении 0,1 МПа в течение 30-40 мин. Готовую среду хранят при температуре 4-8 °С до 3 мес.

Для приготовления жидкой среды смешивают равные объемы пептона Мартена и мясной воды, устанавливают pH 8,0-8,2, разливают в колбы и стерилизуют при температуре 120 °С и давлении 0,1 МПа в течение 30 мин. Бульон хранят не более одного месяца.

Агар Мартена. В среду Мартена (бульон Мартена), подогретый до 50-60 °С, добавляют мелко нарезанный промытый агар-агар из расчета 25 г на 1000 см3, периодически помешивая, доводят жидкость до кипения для полного растворения агара. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр в горячем виде, разливают по колбам и стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С и давлении 0,1 МПа в течение 30 мин.

Бульон и агар Мартена предназначены для культивирования анаэробов и микоплазм.

8.1. Техника посева и выделения чистых культур микроорганизмов

Доставляемый в лабораторию материал подвергают бактериологическому исследованию в тот же день. Техника посева зависит от характера засеваемого материала, консистенции питательной среды и цели исследования.

Для проведения посевов необходимы: подлежащий исследованию материал, питательные среды, бактериологическая петля, шпатели (стеклянные, металлические), пастеровские и градуированные пипетки, металлические кюветы или поднос для переноса засеянных чашек и металлические коробки для переноса пробирок, ведро или бачок с крышками для сброса отработанного инфицированного материала, спиртовая или газовая горелка.

Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. При взятии петлей жидкость должна образовать в кольце петли тонкую прозрачную пленку – "зеркало". Пипетками пользуются в том случае, когда материал засевают в большом или точно отмеряемом объеме.

Способ взятия плотного материала определяется его консистенцией. При посевах чаще всего пользуются бактериологической петлей.

Все манипуляции, связанные с посевом и выделением микробных культур, производят над пламенем горелки. Бактериальную петлю перед взятием материала прокаливают в пламени горелки, затем ее остужают так, чтобы при соприкосновении с жидкой средой она не вызывала кипения жидкости, а прикосновение к агару не сопровождалось его плавлением. Для остуживания петли лучше всего погружать ее в конденсационную жидкость пробирки со стерильной питательной средой или прикасаться к крышке чашки Петри со стерильной средой. Нельзя остужать петлю прикосновением к поверхности питательной среды, даже свободной от микробного роста, так как на ней могут находиться колонии, не видимые простым глазом.

После окончания посева петлю прожигают повторно для уничтожения находящейся в ней микробной культуры или инфицированного микроорганизмами материала.

Пипетки и шпатели, использованные для посевов, опускают в дезинфицирующий раствор.

После посева на чашках Петри со стороны дна, на пробирках – в верхней трети надписывают название засеянного материала или ставят номер анализа и дату посевов.

8.1.1. Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды

При посеве в жидкую питательную среду петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду.
При посеве на скошенный мясопептонный агар пробирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают правой рукой IV и V пальцами, не прикасаясь к той ее части, которая входит внутрь пробирки. Остальные три пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериологической петли, посредством которой производится посев. Петлю держат, как писчее перо. После вынимания пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее посторонних микроорганизмов из воздуха.

При посеве на скошенный агар петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опускают плашмя на поверхность питательной среды и скользящими движениями наносят штрихи снизу вверх от одной стенки пробирки к другой (рис. 8.1).

• При посеве на поверхность плотной питательной среды из пробирки в чашки Петри пробирку фиксируют II, III и V пальцами левой руки, а крышку чашки Петри приоткрывают I и IV пальцами левой руки настолько, чтобы в образовавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель (рис. 8.2). Небольшое количество исследуемого материала, взятого из пробирки бактериологической петлей, втирают в поверхность питательной среды у края чашки. Затем петлю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала. Линию посева начинают с того места, в котором находится материал. Бактериологическую петлю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать ее поверхность, и проводят штрихи по всей среде или по секторам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на 4, 8 или 16 равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микробов в концевой ее части.
• Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользоваться вместо петли тампоном или шпателем.

При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной среды. Такой характер микробного роста получил название сплошного или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одного вида.

Для посева материала в толщу плотной питательной среды готовят взвесь в стерильной водопроводной воде или в изотоническом растворе. Набирают 0,1–1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного загрязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15–20 мл мясопептонного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40– 45 "С (при такой температуре пробирка со средой, приложенная к щеке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распределения исследуемого материала в питательной среде закрытую чашку с содержимым слегка вращают по поверхности стола.
Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней материалом.
Калиброванной бактериологической петлей (диаметр 2 мм, емкость 0,005 мл) производят посев мочи на сектор А чашки Петри с простым агаром, сделав около 40 штрихов. Затем петлю прожигают и производят 4 штриховых посева из сектора А в сектор I, из сектора I в сектор II и из сектора II в сектор III, каждый раз после прожигания петли (рис. 8.3).

Чашки инкубируют при температуре 37 °С в течение 18– 24 ч, после чего подсчитывают количество колоний, выросших в разных секторах, и определяют количество бактерий в 1,0 мл по приведенной табл. 8.1 (этот метод принят для определения степени бактериурии).

Таблица 8.1. Определение количества бактерий в 1 мл методом секторных посевов*

Количество колоний в секторах

Количество бактерий в 1 мл

*Приказ № 535 от 22 апреля 1985 г. "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений" (Москва, 1985).

8.1.2. Методы выделения чистых культур

Чистой культурой принято называть совокупность однородных микроорганизмов, относящихся к одному виду, полученных из массы одной колонии, клетки которой идентичны по морфологическим, тинкториальным, культуральным, метаболическим и генетическим признакам, так как по существующим представлениям микробная колония является популяцией бактериальных клеток, возникшей в результате размножения единственной материнской клетки. Микробная колония являются аналогом клона.

Чистые культуры микроорганизмов одного вида, выделенные из различных источников, могут отличаться друг от друга незначительным отклонением морфологических, культуральных или биохимических признаков, не выходя за пределы своего вида или подвида. Такие культуры называют штаммами. Вместо ранее именованных типов в зависимости от характера изменившегося признака их обозначают морфоварами (отличные по морфологическим признакам), сероварами (имеющие антигенные отличия), биоварами (отличающиеся биологическими свойствами).

Чистая культура необходима для изучения морфологических, культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение получил метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине питательной среды. Очень широко применяются селективные питательные среды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить. Некоторые виды микробов обладают высокой чувствительностью к воздействию определенных факторов внешней среды. Индивидуальная устойчивость микробов к тому или иному фактору была использована для разработки методов выделения чистых культур путем умерщвления сопутствующей микрофлоры. Этим способом производится выделение споровых форм микробов, устойчивых к действию высокой температуры, микобактерий туберкулеза, безразличных к действию концентрированных растворов минеральных кислот, в отличие от остальных микробов, содержащихся в мокроте.

При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней микрофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных животных, восприимчивых к тому виду микроба, который предполагается выделить из исследуемого материала. Биологический метод выделения чистой культуры применяется при исследовании мокроты на содержание в ней пневмококков, микобактерий туберкулеза.

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху). Три пробирки, содержащие по 15 мл мясопептонного агара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43–45 °С. В пробирку вносят одну бактериологическую петлю исследуемого материала. Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку вращают несколько раз, зажав между ладонями. После этого одну петлю (прокаленную и остуженную) содержимого 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в 3-ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам пробирок.

После застудневания среды с исследуемым материалом чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

Выделение чистой культуры по способу Дригальского. Расплавленную питательную среду разливают в три чашки Петри. Застывшую среду обязательно подсушивают, так как влажная поверхность ее способствует образованию сливного роста. В первую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и стерильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды. Далее, не прожигая шпателя и не набирая нового материала, шпатель переносят во 2-ю, а затем и 3-ю чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.

Метод рассева по поверхности, предложенный Дригальским, является наиболее употребительным для получения чистой культуры микробов. Вместо шпателя можно пользоваться петлей. Материал на питательной среде распределяют параллельными штрихами по всей чашке в одном направлении. Затем, повернув чашку на 90°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посева материал, находящийся в петле, расходуется постепенно, и по линиям штрихов, нанесенных в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

Выращивание и выделение чистых культур анаэробов. Для выращивания анаэробов необходимо создать определенные условия, сущность которых заключается в удалении молекулярного кислорода из питательной среды и пространства, окружающего эти культуры. Другим обязательным условием, обеспечивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду.

Единственным отличием питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, служит пониженное содержание в них свободного кислорода. Самым простым способом удаления растворенного кислорода является кипячение. Непосредственно перед посевом материала пробирки с питательными Средами кипятят на водяной бане в течение 10–20 мин. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, удаляется кислород. Свежепрокипяченную питательную среду быстро охлаждают, погружая в лед или подставляя под струю холодной воды, чтобы не дать ей насытиться кислородом воздуха, и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху стерильным вазелиновым или парафиновым маслом (толщина слоя 1–1,5 см). Засев среды производят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки.

В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, аскорбиновую кислоту, цистеин, гликокол, глутатион. Активно связываются с кислородом животные ткани паренхиматозных органов. На этом свойстве животных клеток основано приготовление питательной среды Китта – Тароцци (рецепт 161), широко применяемой для выращивания анаэробов. В жидкие питательные среды помещают иногда пористые вещества: вату, пемзу, которые адсорбируют на своей поверхности пузырьки воздуха.

Для создания бескислородных условий используют физические, химические и биологические факторы.

Физические способы культивирования анаэробов:

• способ Виньяля – Вейона. Берут 4–5 пробирок с 0,5 % расплавленным и охлажденным до температуры 40–45 °С сахарным агаром. В содержимое одной из них вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала и тщательно размешивают. Для уменьшения концентрации материала с целью получения изолированных колоний засеянную среду в количестве, соответствующем объему внесенного материала, переносят из 1-й пробирки во 2-ю, из 2-й в 3-ю. Затем содержимым каждой пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток.

Чтобы предупредить застывание питательной среды в момент насасывания ее в пипетки, пока их кончик не обломлен, пипетки погружают на 3–5 мин в стерильную воду с температурой 45–50 °С. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2–3 сут в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Выросшие колонии легко изолировать. Для этого капилляр надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию микроба, находящуюся в агаре, извлекают петлей и пересевают в свежую питательную среду;

• выращивание анаэробов в условиях вакуума. Вакуумные условия для выращивания анаэробов создают в анаэростате или эксикаторе. Исследуемый материал или культуру микробов засевают в пробирки с жидкой средой или в чашки Петри с плотной питательной средой. Посевы помещают в анаэростат, затем присоединяют его к насосу и выкачивают воздух. Степень разреженности воздуха определяют по показаниям вакуумметра. Колонии анаэробов в вакуумных условиях растут на поверхности плотной питательной среды.

Химические методы выращивания анаэробов (метод Аристовского). Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидросульфит натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор закрывают крышкой и помещают в термостат при температуре 37 *С на 24–48 ч.

Биологический метод выращивания анаэробов (по Фортнеру). В чашку Петри наливают толстым слоем 5 % кровяной агар с 1–2 % глюкозы. Посередине чашки в питательной среде вырезают стерильным скальпелем канавку шириной 1–1,5 см, которая делит питательную среду на две половины. Одну из них засевают культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом, другую половину – культурой аэробов: чудесной палочкой (Serratia marcescens) или кишечной палочкой (Escherichia coli). Перед посевом чашки подсушивают в термостате, чтобы аэробы вместе с капельками влаги не могли попасть на другую сторону чашки. Засеянные чашки закрывают, а свободное пространство между дном и крышкой заклеивают лейкопластырем, чтобы предупредить поступление в чашку кислорода извне. В термостате чашки устанавливают вверх дном. Быстро растущие аэробы, поглощая находящийся в чашке кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов.

Анаэростат для культивирования анаэробов. Анаэростат – прибор для выращивания микробов в анаэробных условиях – представляет собой толстостенную металлическую или пластиковую камеру с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакуумметр и два крана для присоединения к вакуум-насосу. Вместо кислорода в нем используются газовые смеси.

Мясопептонного агар (МПА) — самое распространенное универсальное питательную среду в микробиологических исследованиях.

Состав

ферментативный пептон
экстракт мяса (1: 2)
натрия хлорид
глюкоза
агар

Описание

Препарат представляет собой плотное питательную среду желтого цвета.

Выпускается в виде плотной питательной среды по 300 мл в стеклянных флаконах, откупоренных пробками завальцованы алюминиевыми колпаками.

Назначение

Используется для культивирования и изучения культуральных свойств различных микроорганизмов.

Возможно использование препарата как питательной основы для приготовления различных питательных сред целевого назначения.

Хранение

Срок годности — 2 года. Сохраняется среда герметично закрытым при температуре от 2 до 25 ° C в местах, защищенных от воздействия прямых солнечных лучей.

Приготовление

До 1 л мясо-пептонам бульона добавляют 15-20 г мелко нарезанного агар-агара. Среда нагревают до растворения агара (температура плавления его 100 ° С, застывания -40 ° С), устанавливают слабощелочную реакцию среды 20% -ным раствором Na2CO3, a и через воронки разливают в пробирки (но 10 мл для розливок в чашки — агар столбиком и по 5 мл для получения скошенного, наклонного агара). При разливке агара необходимо следить затем, чтобы края пробирки были сухими, иначе пробки прилипают к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120 ° С в течение 20 мин.

Существует и другой вариант среды — мясо-пептона желатина (МПЖ), где вместо агара для затвердевания среды используют желатин. В 1 л бульона мясопептонного добавляют 100-150 г желатина. Температура плавления зависит от процентного содержания в среде. 10% желатина плавится при 24 ° С, 15% — при 25 °. В летнее время среды готовят, добавляя 15% желатины. После растворения желатина при осторожном нагревании в среде устанавливают слабощелочную реакцию (как и для МПБ и МПА), кипятят в течение 5 мин, затем охлаждают-до 40-50 ° С Одновременно яичный белок взбивают с небольшим количеством воды, вливают его в охлажденную желатиновую среду, хорошо взбалтывают и снова нагревают. Среда после выпадения белков становится прозрачным. Его фильтруют через горячую воронку, разливают в пробирки и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром, прогревая среду по 30 мин через 24 ч три раза.

Читайте также: