Посев на среду клиглера
Обновлено: 07.07.2024
1. Среда Клиглера. Среда Клиглера предназначена для дифференциации энтеробактерий по их способности ферментировать глюкозу, лактозу и образовывать сероводород.
Состав:
Мясная вода — 1000,0 мл
Пептон — 20,0 г
Лактоза —10,0 г
Глюкоза — 1,0 г
Натрия хлорид (NaCl) — 5,0 г
Натрия сульфит (Na2SO3*7H2O) — 0,4 г
Натрия тиосульфат (Na2S2O3*5H2O) — 0,08 г
Железа II сульфат (Fe2SO4*7H2O) — 0,5 г
Агар — 20,0 г
Феноловый красный (1%-ный раствор в 50%-ном этиловом спирте) — 12,0 мл
pH 7,4±0,2
В мясную воду добавляют пептон, соли натрия, агар. Кипятят до полного растворения, устанавливают pH 7,8, снова кипятят. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем добавляют остальные ингредиенты. Сульфат железа предварительно растворяют в небольшом количестве воды. Готовую среду разливают в пробирки по 6,0-7,0 мл. Стерилизуют при 112°С 30 мин. Скашивают, оставляя столбик высотой 2,0-2,5 см.
Расщепление сахаров, сопровождающееся образованием кислот, устанавливают при помощи индикатора фенолового красного (в кислой среде желтеет). Рост микроорганизмов начинается с утилизации сахаров. В первые 5-6 ч инкубации штаммы, расщепляющие только глюкозу, но не лактозу, утилизируют содержащуюся в невысокой концентрации (0,1%) глюкозу в скошенной части агара, изменяя цвет косяка с красноватого на желтый.
Такие же изменения среды вызывают штаммы, расщепляющие и глюкозу, и сахарозу.
Однако на вторые сутки (через 40-48 ч) инкубации посевов будет наблюдаться щелочение среды с покраснением скошенной ее части за счет расщепления пептонов, а следовательно, учет ферментации сахаров надо производить не позднее 24 ч.
При ферментации углеводов конечными продуктами метаболизма могут быть H2 и CO2. В этих случаях в среде отмечаются трещины и разрывы, при скоплении газа на дне пробирки столбик агара приподнимается.
Некоторые бактерии продуцируют энзим тиосульфатредуктазу, способную из неорганических соединений серы образовывать не видимый глазу газообразный сероводород. Для его обнаружения в среду Клиглера вводят железа II сульфат. Реакция образования сероводорода протекает в два этапа:
— в начале в кислой среде, в анаэробных условиях под действием микробной тиосульфатредуктазы тиосульфат восстанавливается в тиосульфит с выделением бесцветного водорода;
— введенный в среду железа сульфат (FeSO4) вступает в реакцию с сероводородом (H2S), образуя сернистое железо (FeS) в виде нерастворимого преципитата черного цвета, в результате чего столбик среды приобретает черный цвет.
2. Трехсахарный агар с солями железа (TSI) в модификации НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова. Среда предназначена для дифференциации энтеробактерий по признаку ферментации углеводов..
Принцип действия среды тот же, что для агара Клиглера.
Состав:
Вода мясная — 1000,0 мл
Экстракт дрожжевой жидкий — 100,0 мл
Экстракт дрожжевой (по сухой массе) — 3,0 г
Пептон — 20,0 г
Натрия хлорид — 3,5 г
Агар - 15,0 г
Железа II сульфат (перекристаллизованный) FeSO4 — 0,2 г
Натрия тиосульфат (Na2S2O3) — 0,3 г
Глюкоза — 1,0 г
Лактоза — 10,0 г
Сахароза — 10,0 г
Феноловый красный (0,2% водный раствор) — 12,0 г
pH 7,0±0,1
Готовят основу среды. К мясной воде добавляют дрожжевой экстракт, пептон, натрия хлорид и агар. Смесь подогревают до расплавления агара, устанавливают pH. Среду фильтруют, разливают в матрицы или колбы по 0,5 л, стерилизуют при 121°С 30 мин.
К стерильной основе добавляют остальные ингредиенты, хорошо перемешивая, разливают асептически в стерильные пробирки по 6-7 мл, стерилизуют текучим паром или при 112°С 30 мин. Скашивают в горячем виде, оставляя столбик высотой 2,0-2,5 см.
Посев производят так же, как на среду Клиглера.
Принцип действия трехсахарного агара с железом (TSI) аналогичен механизму действия среды Клиглера. Роль сахарозы в среде заключается в том, что она позволяет распознавать и исключать некоторые ферментирующие сахарозу и не ферментирующие лактозу штаммы из групп Proteus и Escherichia.
Hafnia и Providencia не ферментируют лактозу или ферментируют ее крайне медленно, в то же время они быстро ферментируют сахарозу, что отличает их от групп Salmonella и Shigella.
В случаях с неявными результатами делают дополнительно посевы на среды Гисса с лактозой и сахарозой.
3. Трехсахарный агар с железом, HiMedia, TSI, Triple Sugar Iron Agar. Среда предназначена для дифференцирования энтеробактерий по способности расщеплять декстрозу, лактозу, сахарозу и продуцировать сероводород. Среда может быть использована для проведения ONPG-теста.
Состав, г/л:
Пептон — 10,0
Триптон — 10,0
Экстракт дрожжевой — 3,0
Экстракт говяжий — 3,0
Лактоза — 10,0
Сахароза — 10,0
Декстроза — 1,0
Железа сульфат — 0,2
Натрия хлорид — 5,0
Натрия тиосульфат — 0,3
Феноловый красный — 0,02
Агар — 12,0
pH 7,4±0,2
Навеску среды 65,0 г растворяют при нагревании в 1000,0 мл дистиллированной воды. Среду доводят до кипения. Устанавливают pH. Разливают в пробирки по 7,0 мл.
Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. После стерилизации среду скашивают с образованием столбика 2,0-2,5 см. Готовая к употреблению среда имеет розово-красный цвет.
4. Среда Ресселя (двухсахарный агар), сухая. Предназначена для дифференциации энтеробактерий по способности ферментировать 2 сахара.
Состав, г/л:
Гидролизат казеина панкреатический — 8,7
Натрия хлорид — 4,3
Лактоза — 10,0
Глюкоза — 1,0
Бромтимоловый синий — 0,03
Агар — 9,0
pH 7,2±0,2
Навеску среды 33,0 г растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды и нагревают. При необходимости устанавливают pH. Затем фильтруют и разливают в пробирки по 6-7 мл. Стерилизуют при 121°С в течение 20 мин. После стерилизации среду скашивают, оставляя внизу столбик высотой 2,0-2,5 см. Готовая к употреблению среда имеет зеленовато-голубой цвет.
Среду засевают непосредственно материалом из колонии уколом и по поверхности скоса. Энтеробактерии, расщепляющие оба сахара, вызывают равномерное изменение окраски всей среды (в желтый цвет) за счет обильного кислотообразования. Бактерии, расщепляющие только глюкозу, окрашивают среду в столбике, а участок скоса сохраняет исходный голубой цвет. Газообразование учитывается по наличию пузырей и разрывов в толще агара.
При самостоятельном изготовлении среды в лабораториях в качестве основы используется 1%-ной МПА. Возможна замена сахарозы на лактозу (1%).
5. Трехсахарный агар с мочевиной (среда И.С.Олькеницкого). Среда И.С.Олькеницкого предназначена для дифференциации энтеробактерий по их способности сбраживать углеводы: лактозу, глюкозу, сахарозу — и ферментировать мочевину с выделением аммиака.
Состав:
Агар питательный сухой — 25,0 г
Лактоза — 10,0 г
Сахароза — 10,0 г
Глюкоза - 1,0 г
Аммония железа (II) сульфат [(NH4)2FeSO4*12H2O] — 0,2 г
Натрий тиосульфат Na2S2O3*5H2O — 0,3 г
Мочевина — 10,0 г
Феноловый красный (0,4%-ный водный раствор) — 4,0 мл
Вода дистиллированная — 1000,0 мл
pH 7,3±0,1
Соли предварительно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Углеводы и мочевину растворяют таким же образом при подогреве на водяной бане. Сухой питательный агар расплавляют в остальном объеме воды при нагревании на огне и постоянном перемешивании. Затем все ингредиенты перемешивают с расплавленным агаром, фильтруют через марлевый фильтр, устанавливают pH.
Добавляют индикатор, хорошо перемешивают с расплавленным агаром, разливают в пробирки по 6,0-7,0 мл. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд 20 мин или при 110°С в течение 20 мин. Скашивают, оставляя столбик 2,0-2,5 см. Готовая среда бледно-розового цвета.
Реакции ферментации углеводов и образования сероводорода те же, что и на среде Клиглера. Присутствие в среде мочевины позволяет определить у культуры наличие уреазы.
Расщепление мочевины завершается образованием аммиака, что сопровождается резким смещением pH среды в щелочную зону (pH 8,0-8,2), в результате чего столбик и скошенная часть агара приобретают красный цвет, поэтому при исследовании уреазоположительных штаммов анализ ферментации углеводов невозможен. Для определения их сахаролитической активности требуются специальные среды (например, среды Гисса).
6. Среды для теста на органические кислоты, (D-, L-, I-тартрат, мукат, цитрат).
Среды предназначены для дифференциации сальмонелл и близкородственных микроорганизмов.
Состав, г/л:
Основа сред:
Пептон — 10,0
Бромтимоловый синий — 0,024
Варианты ингредиентов:
D-тартрат (правовращающая соль) — 10,0
или L-тартрат (левовращающая соль) — 5,0
или I (мезо)-тартрат (оптически инертная соль) — 5,0 или мукат (слизевая кислота) — 10,0
или натрия цитрат (нейтральный) — 10,0
pH 7,4+0,1
Пептон и индикатор растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды, добавляют 1% соответствующей соли винной кислоты (D-, L-, 1-тартрат, натриевая или калийная соль). Устанавливают pH при помощи 10%-ного раствора NaOH. Разливают по 3,0-5,0 мл в пробирки. Стерилизуют при 112°С в течение 20 мин. Готовая к употреблению среда — сине-зеленого цвета.
Основу среды для определения утилизации муката (слизевой кислоты) вначале стерилизуют при том же режиме. Затем в горячую среду асептически вносят стерильный раствор слизевой кислоты (до 1%). Устанавливают pH посредством 10%-ного раствора NaOH. Разливают по 3,0-4,0 мл в стерильные пробирки (допускается стерилизация среды со слизевой кислотой при 112°С в течение 10 мин). Необходим строгий контроль стерильности готовой среды.
При положительном результате среды приобретают желто-зеленый цвет.
7. Среда с малонатом натрия (модификация Ewing), HiMedia, Malonate Broth, Ewing modified.
Среды предназначены для дифференциации энтеробактерий по признаку утилизации соли малоновой кислоты.
Состав, г/л:
Экстракт дрожжевой — 1,0
Аммония сульфат — 2,0
Калия дигидрофосфат — 0,4
Калия гидрофосфат — 0,6
Натрия хлорид — 2,0
Натрия малонат — 3,0
Глюкоза — 0,25
Бромтимоловый синий — 0,025
pH 6,7±0,2
Навеску среды 9,28 г растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды, доводят до кипения, при необходимости фильтруют. Устанавливают pH. Среду разливают в пробирки по 2,0-3,0 мл. Стерилизуют при 112°С 30 мин или при 121°С 15 мин, скашивают. Готовая среда имеет светло-зеленый цвет. При положительном результате среда становится ярко-синей.
8. Среда Козера. Среда предназначена для дифференциации энтеробактерий по способности утилизировать цитрат.
Состав, г/л:
Натрий аммония фосфат (NH4NaHPO4) — 1,5
Калия фосфат однозамещенный KH2PO4 — 1,0
Магния сульфат (MgSO4*7H2O) — 0,2
Натрия цитрат — 3,0
pH 6,7±0,2
Навеску среды 5,7 г растворяют при нагревании в 1000,0 мл дистиллированной воды, разливают в пробирки по 3,0-5,0 мл. Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. Готовая к употреблению среда бесцветна, прозрачна.
Культуры, не утилизирующие цитрат, на среде Козера не растут, и она остается прозрачной.
Эту среду в качестве дифференциальной рекомендуют для изучения у грамотрицательных бактерий кишечного происхождения способности ферментировать глюкозу и лактозу, а также продуцировать сероводород.
Состав**:
** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам
Приготовление:
Размешать 57,5 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить для полного растворения частиц. Тщательно перемешать и разлить в пробирки. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Остудить пробирки в таком положении, чтобы получить скошенную часть и столбик высотой 2,5 см.
Наилучшие результаты получают на свежеприготовленной среде.
Не рекомендуется применять пробирки с завинчивающимися крышками и флаконы.
Принцип и оценка результата:
Клиглер разработал среду для дифференциации бактерий тифо-паратифозной группы (1). Затем он провел оценку этой среды в сочетании с двойной средой Ресселя (2, 3). Bailay и Lacey (4) предложили заменить индикатор Андреде на феноловый красный, что позволяет дифференцировать грамотрицательные бактерии по их способности ферментировать глюкозу и лактозу и продуцировать сероводород. На агаре Клиглера можно отличать бактерии, ферментирующие и не ферментирующие лактозу, Salmonella typhi от других сальмонелл, а также Salmonella paratyphi А от Salmonella schottmuelleri и Salmonella enteritidis.
Тиосульфат натрия и сульфат железа усиливают образование сероводорода. Феноловый красный – индикатор рН. О ферментации глюкозы свидетельствует желтый столбик, лактозы – желтый скос, об образовании сероводорода – почернение столбика. На агар Клиглера для предварительной идентификации засевают чистые культуры с чашечных сред, например, Агара МакКонки (М082), Висмут-сульфитного агара ( М027 ) или Дезоксихолат-цитратного агара ( М065 ), Агара Сальмонелла-Шигелла ( М108 ).
Контроль качества:
Внешний вид порошка:
Гомогенный сыпучий светло-розовый порошок.
Плотность готовой среды:
Образуется среда, соответствующая по плотности 1,5%-ному агаровому гелю.
Цвет и прозрачность готовой среды:
Готовая среда имеет красную окраску, прозрачна или слегка опалесцирует, если в пробирках формируется столбик и скос геля.
1. Среда Клиглера. Среда Клиглера предназначена для дифференциации энтеробактерий по их способности ферментировать глюкозу, лактозу и образовывать сероводород.
Состав:
Мясная вода — 1000,0 мл
Пептон — 20,0 г
Лактоза —10,0 г
Глюкоза — 1,0 г
Натрия хлорид (NaCl) — 5,0 г
Натрия сульфит (Na2SO3*7H2O) — 0,4 г
Натрия тиосульфат (Na2S2O3*5H2O) — 0,08 г
Железа II сульфат (Fe2SO4*7H2O) — 0,5 г
Агар — 20,0 г
Феноловый красный (1%-ный раствор в 50%-ном этиловом спирте) — 12,0 мл
pH 7,4±0,2
В мясную воду добавляют пептон, соли натрия, агар. Кипятят до полного растворения, устанавливают pH 7,8, снова кипятят. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем добавляют остальные ингредиенты. Сульфат железа предварительно растворяют в небольшом количестве воды. Готовую среду разливают в пробирки по 6,0-7,0 мл. Стерилизуют при 112°С 30 мин. Скашивают, оставляя столбик высотой 2,0-2,5 см.
Расщепление сахаров, сопровождающееся образованием кислот, устанавливают при помощи индикатора фенолового красного (в кислой среде желтеет). Рост микроорганизмов начинается с утилизации сахаров. В первые 5-6 ч инкубации штаммы, расщепляющие только глюкозу, но не лактозу, утилизируют содержащуюся в невысокой концентрации (0,1%) глюкозу в скошенной части агара, изменяя цвет косяка с красноватого на желтый.
Такие же изменения среды вызывают штаммы, расщепляющие и глюкозу, и сахарозу.
Однако на вторые сутки (через 40-48 ч) инкубации посевов будет наблюдаться щелочение среды с покраснением скошенной ее части за счет расщепления пептонов, а следовательно, учет ферментации сахаров надо производить не позднее 24 ч.
При ферментации углеводов конечными продуктами метаболизма могут быть H2 и CO2. В этих случаях в среде отмечаются трещины и разрывы, при скоплении газа на дне пробирки столбик агара приподнимается.
Некоторые бактерии продуцируют энзим тиосульфатредуктазу, способную из неорганических соединений серы образовывать не видимый глазу газообразный сероводород. Для его обнаружения в среду Клиглера вводят железа II сульфат. Реакция образования сероводорода протекает в два этапа:
— в начале в кислой среде, в анаэробных условиях под действием микробной тиосульфатредуктазы тиосульфат восстанавливается в тиосульфит с выделением бесцветного водорода;
— введенный в среду железа сульфат (FeSO4) вступает в реакцию с сероводородом (H2S), образуя сернистое железо (FeS) в виде нерастворимого преципитата черного цвета, в результате чего столбик среды приобретает черный цвет.
2. Трехсахарный агар с солями железа (TSI) в модификации НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова. Среда предназначена для дифференциации энтеробактерий по признаку ферментации углеводов..
Принцип действия среды тот же, что для агара Клиглера.
Состав:
Вода мясная — 1000,0 мл
Экстракт дрожжевой жидкий — 100,0 мл
Экстракт дрожжевой (по сухой массе) — 3,0 г
Пептон — 20,0 г
Натрия хлорид — 3,5 г
Агар - 15,0 г
Железа II сульфат (перекристаллизованный) FeSO4 — 0,2 г
Натрия тиосульфат (Na2S2O3) — 0,3 г
Глюкоза — 1,0 г
Лактоза — 10,0 г
Сахароза — 10,0 г
Феноловый красный (0,2% водный раствор) — 12,0 г
pH 7,0±0,1
Готовят основу среды. К мясной воде добавляют дрожжевой экстракт, пептон, натрия хлорид и агар. Смесь подогревают до расплавления агара, устанавливают pH. Среду фильтруют, разливают в матрицы или колбы по 0,5 л, стерилизуют при 121°С 30 мин.
К стерильной основе добавляют остальные ингредиенты, хорошо перемешивая, разливают асептически в стерильные пробирки по 6-7 мл, стерилизуют текучим паром или при 112°С 30 мин. Скашивают в горячем виде, оставляя столбик высотой 2,0-2,5 см.
Посев производят так же, как на среду Клиглера.
Принцип действия трехсахарного агара с железом (TSI) аналогичен механизму действия среды Клиглера. Роль сахарозы в среде заключается в том, что она позволяет распознавать и исключать некоторые ферментирующие сахарозу и не ферментирующие лактозу штаммы из групп Proteus и Escherichia.
Hafnia и Providencia не ферментируют лактозу или ферментируют ее крайне медленно, в то же время они быстро ферментируют сахарозу, что отличает их от групп Salmonella и Shigella.
В случаях с неявными результатами делают дополнительно посевы на среды Гисса с лактозой и сахарозой.
3. Трехсахарный агар с железом, HiMedia, TSI, Triple Sugar Iron Agar. Среда предназначена для дифференцирования энтеробактерий по способности расщеплять декстрозу, лактозу, сахарозу и продуцировать сероводород. Среда может быть использована для проведения ONPG-теста.
Состав, г/л:
Пептон — 10,0
Триптон — 10,0
Экстракт дрожжевой — 3,0
Экстракт говяжий — 3,0
Лактоза — 10,0
Сахароза — 10,0
Декстроза — 1,0
Железа сульфат — 0,2
Натрия хлорид — 5,0
Натрия тиосульфат — 0,3
Феноловый красный — 0,02
Агар — 12,0
pH 7,4±0,2
Навеску среды 65,0 г растворяют при нагревании в 1000,0 мл дистиллированной воды. Среду доводят до кипения. Устанавливают pH. Разливают в пробирки по 7,0 мл.
Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. После стерилизации среду скашивают с образованием столбика 2,0-2,5 см. Готовая к употреблению среда имеет розово-красный цвет.
4. Среда Ресселя (двухсахарный агар), сухая. Предназначена для дифференциации энтеробактерий по способности ферментировать 2 сахара.
Состав, г/л:
Гидролизат казеина панкреатический — 8,7
Натрия хлорид — 4,3
Лактоза — 10,0
Глюкоза — 1,0
Бромтимоловый синий — 0,03
Агар — 9,0
pH 7,2±0,2
Навеску среды 33,0 г растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды и нагревают. При необходимости устанавливают pH. Затем фильтруют и разливают в пробирки по 6-7 мл. Стерилизуют при 121°С в течение 20 мин. После стерилизации среду скашивают, оставляя внизу столбик высотой 2,0-2,5 см. Готовая к употреблению среда имеет зеленовато-голубой цвет.
Среду засевают непосредственно материалом из колонии уколом и по поверхности скоса. Энтеробактерии, расщепляющие оба сахара, вызывают равномерное изменение окраски всей среды (в желтый цвет) за счет обильного кислотообразования. Бактерии, расщепляющие только глюкозу, окрашивают среду в столбике, а участок скоса сохраняет исходный голубой цвет. Газообразование учитывается по наличию пузырей и разрывов в толще агара.
При самостоятельном изготовлении среды в лабораториях в качестве основы используется 1%-ной МПА. Возможна замена сахарозы на лактозу (1%).
5. Трехсахарный агар с мочевиной (среда И.С.Олькеницкого). Среда И.С.Олькеницкого предназначена для дифференциации энтеробактерий по их способности сбраживать углеводы: лактозу, глюкозу, сахарозу — и ферментировать мочевину с выделением аммиака.
Состав:
Агар питательный сухой — 25,0 г
Лактоза — 10,0 г
Сахароза — 10,0 г
Глюкоза - 1,0 г
Аммония железа (II) сульфат [(NH4)2FeSO4*12H2O] — 0,2 г
Натрий тиосульфат Na2S2O3*5H2O — 0,3 г
Мочевина — 10,0 г
Феноловый красный (0,4%-ный водный раствор) — 4,0 мл
Вода дистиллированная — 1000,0 мл
pH 7,3±0,1
Соли предварительно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Углеводы и мочевину растворяют таким же образом при подогреве на водяной бане. Сухой питательный агар расплавляют в остальном объеме воды при нагревании на огне и постоянном перемешивании. Затем все ингредиенты перемешивают с расплавленным агаром, фильтруют через марлевый фильтр, устанавливают pH.
Добавляют индикатор, хорошо перемешивают с расплавленным агаром, разливают в пробирки по 6,0-7,0 мл. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд 20 мин или при 110°С в течение 20 мин. Скашивают, оставляя столбик 2,0-2,5 см. Готовая среда бледно-розового цвета.
Реакции ферментации углеводов и образования сероводорода те же, что и на среде Клиглера. Присутствие в среде мочевины позволяет определить у культуры наличие уреазы.
Расщепление мочевины завершается образованием аммиака, что сопровождается резким смещением pH среды в щелочную зону (pH 8,0-8,2), в результате чего столбик и скошенная часть агара приобретают красный цвет, поэтому при исследовании уреазоположительных штаммов анализ ферментации углеводов невозможен. Для определения их сахаролитической активности требуются специальные среды (например, среды Гисса).
6. Среды для теста на органические кислоты, (D-, L-, I-тартрат, мукат, цитрат).
Среды предназначены для дифференциации сальмонелл и близкородственных микроорганизмов.
Состав, г/л:
Основа сред:
Пептон — 10,0
Бромтимоловый синий — 0,024
Варианты ингредиентов:
D-тартрат (правовращающая соль) — 10,0
или L-тартрат (левовращающая соль) — 5,0
или I (мезо)-тартрат (оптически инертная соль) — 5,0 или мукат (слизевая кислота) — 10,0
или натрия цитрат (нейтральный) — 10,0
pH 7,4+0,1
Пептон и индикатор растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды, добавляют 1% соответствующей соли винной кислоты (D-, L-, 1-тартрат, натриевая или калийная соль). Устанавливают pH при помощи 10%-ного раствора NaOH. Разливают по 3,0-5,0 мл в пробирки. Стерилизуют при 112°С в течение 20 мин. Готовая к употреблению среда — сине-зеленого цвета.
Основу среды для определения утилизации муката (слизевой кислоты) вначале стерилизуют при том же режиме. Затем в горячую среду асептически вносят стерильный раствор слизевой кислоты (до 1%). Устанавливают pH посредством 10%-ного раствора NaOH. Разливают по 3,0-4,0 мл в стерильные пробирки (допускается стерилизация среды со слизевой кислотой при 112°С в течение 10 мин). Необходим строгий контроль стерильности готовой среды.
При положительном результате среды приобретают желто-зеленый цвет.
7. Среда с малонатом натрия (модификация Ewing), HiMedia, Malonate Broth, Ewing modified.
Среды предназначены для дифференциации энтеробактерий по признаку утилизации соли малоновой кислоты.
Состав, г/л:
Экстракт дрожжевой — 1,0
Аммония сульфат — 2,0
Калия дигидрофосфат — 0,4
Калия гидрофосфат — 0,6
Натрия хлорид — 2,0
Натрия малонат — 3,0
Глюкоза — 0,25
Бромтимоловый синий — 0,025
pH 6,7±0,2
Навеску среды 9,28 г растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды, доводят до кипения, при необходимости фильтруют. Устанавливают pH. Среду разливают в пробирки по 2,0-3,0 мл. Стерилизуют при 112°С 30 мин или при 121°С 15 мин, скашивают. Готовая среда имеет светло-зеленый цвет. При положительном результате среда становится ярко-синей.
8. Среда Козера. Среда предназначена для дифференциации энтеробактерий по способности утилизировать цитрат.
Состав, г/л:
Натрий аммония фосфат (NH4NaHPO4) — 1,5
Калия фосфат однозамещенный KH2PO4 — 1,0
Магния сульфат (MgSO4*7H2O) — 0,2
Натрия цитрат — 3,0
pH 6,7±0,2
Навеску среды 5,7 г растворяют при нагревании в 1000,0 мл дистиллированной воды, разливают в пробирки по 3,0-5,0 мл. Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. Готовая к употреблению среда бесцветна, прозрачна.
Культуры, не утилизирующие цитрат, на среде Козера не растут, и она остается прозрачной.
В лабораторной практике идентификация видов и биоваров энтеробактерий проводится по их фенотипическим признакам. Основным и наиболее сложным разделом идентификации является изучение биохимических свойств бактерий. Повсеместно за рубежом и во многих лабораториях нашей страны биохимическая идентификация бактерий осуществляется микрообъемной технологией. При этом используются специальные микрообъемные тест-системы для автоматических бактериологических анализаторов или различные коммерческие тест-системы биохимической идентификации бактерий для визуального учета. Микрообъемная технология наиболее экономична, проста, пригодна для автоматизации и стандартизации исследований.
Автоматические бактериологические анализаторы для микрообъемной биохимической идентификации бактерий и определения их чувствительности кантибиотикам производятся фирмой "Bio Merieux" (Франция): "Vitek-2" - полностью автоматизированная система для идентификации 99 видов энтеробактерий и неферментирующих бактерий; полуавтоматические системы "АТВ Expression" и "Mini API" на основе тест-системы "ID 32E" для идентификации за 24 ч 99 видов энтеробактерий и тест-системы "Rapid ID 32Е" для идентификации за 4 ч 73 видов энтеробактерий. Компания "Dade AG" (США) выпускает автоматические бактериологические анализаторы "Walk-Away-40", "Walk-Away-96" и полуавтоматический бактериологический анализатор "Auto SCAN-4". Применяются автоматические анализаторы других фирм: Quantum II, Cobas Micro. Указанные приборы имеют высокую стоимость, что ограничивает их применение.
Коммерческие микрообъемные тест-системы по устройству представлены двумя группами: содержащими субстрат реакции в питательной среде или в шаблоне-носителе. Результаты биохимических тестов учитываются визуально, вид микроорганизма устанавливается с помощью таблицы идентификации, кодов (профилей) или компьютерных программ.
Среди тест-систем, основанных на принципе "субстрат в питательной среде" широко используются: API 20E "Bio Merieux" (Франция); Enterotest I и Enterotest 2, Enterotest 16, Entero-Screen (АО "Lachema", Чехия), мультимикротесты ММТЕ I и ММТЕ 2 (НПО "Аллерген" г. Ставрополь); ПБДЭ (НПО "Диагностические системы" г. Нижний Новгород); "РАПИД-ЭНТЕРО - 200" и "РАПИД-ЭНТЕРО - 50" (НИИЭМ имени Пастера, отдел новых технологий, г. Санкт-Петербург).
К системам типа "субстрат в шаблоне носителя" относятся коммерческие тест-системы Micro - ID, Minitek, в которых субстрат и индикатор находятся на бумажных дисках, которые вносят в лунки планшетов с суспензией бактерий.
Тест-система API 20E "Bio Merieux" (Франция) предназначена для биохимической идентификации энтеробактерий и других грамотрицательных палочек в течение 18 - 24 ч. Состоит из прозрачной полимерной пластинки с 20 микропробирками объемом 0,25 мл, содержащими дегидратированные субстраты для определения 20 тестов: β-галактозидазы, аргининдигидролазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы, триптофандезаминазы, желатиназы; образования индола, сероводорода, ацетоина; ферментации цитрата, глюкозы, маннитола, инозитола, сорбитола, амигдалина, рамнозы, сахарозы, мелецитозы, арабинозы. Дополнительно вне панели определяют цитохромоксидазу, окисление и ферментацию глюкозы, подвижность. В состав комплекта входят также реактивы для определения индола, триптофандезаминазы, ацетоина, нитритов, оксидазы. Для исследования берут изолированную колонию со среды первичного посева, ставят пробу на оксидазу, готовят из колонии суспензию бактерий определенной мутности по шкале Мак-Фарланда. Вносят во все микропробирки по 100 мкл суспензии бактерий, затем добавляют по 50 мкл вазелинового масла в микропробирки с тестами на уреазу, лизиндекарбоксилазу, орнитиндекарбоксилазу, аргининдигидролазу, сероводорода. Посевы инкубируют при 36 °С в течение 18 - 24 ч, после чего добавляют реактивы на ацетоин, индол, триптофандезаминазу, нитриты. Результаты учитывают визуально, заполняют бланки с кодами цифрового профиля. Идентификацию проводят по кодам или идентификационной таблице. Если на панели нет ферментации глюкозы и менее двух положительных прочих тестов, ставят ОФ тест, определяют подвижность и продлевают наблюдение еще 24 ч для выявления неферментирующих бактерий.
Тест-система Rapid 20E (Bio Merieux) предназначена для биохимической идентификации энтеробактерий и других грамотрицательных палочек в течение 4 ч. Состоит из прозрачной полимерной пластинки с 20 микропробирками, содержащими дегидратированные субстраты для определения 20 тестов: β-D-галактозидазы, лизиндекарбоксилазы, орнитидекарбоксилазы, уреазы; образования индола, ацетоина; ферментации цитрата, эскулина, маннитола, арабинозы, ксилозы, адонитола, рамнозы, целлобиозы, мелецитозы, сахарозы, трегалозы, рафинозы, глюкозы. Исследования проводят так же, как тест-системой API 20E. Результаты учитывают через 4 ч инкубации при 36 °С. Вид бактерий идентифицируют по кодам.
Тест-система Enterotest 1 и 2 (АО "Lachema") предназначена для определения биохимической активности и идентификации наиболее важных энтеробактерий в течение 18 - 24 ч. Состоит из двух полимерных планшетов 8,5 х 12,5 см содержащих по 96 ячеек с высушенными питательными средами с субстратами для определения 23 биохимических тестов. Enterotest 1 для родовой идентификации позволяет определять 12 тестов: уреазу, β-D-галактозидазу, липазу, фенилаланиндезаминазу, орнитиндекарбоксилазу, лизиндекарбоксилазу; образование индола, сероводорода, ацетоина; ферментацию маннитола, цитрата, инозитола. Enterotest 2 для видовой идентификации определяет 11 тестов: ферментацию адонитола, эскулина, малоната натрия, рамнозы, целлобиозы, сахарозы, сорбитола, глюкозы, дульцитола, трегалозы и аргининдигидролазу. Имеются также среда и реактивы для определения вне планшетов оксидазы и О/Ф теста с глюкозой, а также набор реактивов для тестов в планшетах. Исследуемую чистую культуру-колонию со среды первичного посева (Мак-Конки агара, Эндо или других) изучают на оксидазу с помощью полосок окси-тест и ставят О/Ф тест на ферментацию глюкозы (в пробирках). Из изолированной колонии готовят суспензию в физиологическом растворе, равную степени № 1 по шкале мутности Мак-Фарланда. Делают высев суспензии для проверки чистоты культуры на кровяной агар. По 100 мкл суспензии бактерий вносят во все 23 лунки двух планшетов, заливают вазелиновым маслом лунки тестов на лизин, индол, сероводород, орнитин, уреазу, аргинин. Инкубируют планшеты в пакете из полиэтилена при 35 - 37 °С в течение (18 - 24) ч. Затем вносят в лунки реактивы на индол, ацетоин, фенилаланин. Учитывают визуально все результаты тестов, в том числе О/Ф теста. Идентификацию проводят с помощью идентификационных таблиц.
Система Enterotest 16 (АО "Lachema") предназначена для идентификации наиболее значимых в медицине энтеробактерий в течение 18 - 24 ч. Состоит из двух рядов (по 8 лунок) стрипированного 96-луночного планшета. В лунках содержатся вышеуказанные среды для определения 16 тестов: уреазы, фенилаланиндезаминазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы; образования индола, сероводорода; ферментации цитрата, эскулина, малоната, инозитола, адонитола, целлобиозы, сахарозы, сорбитола, маннитола, трегалозы. Имеются дополнительно идентификационные полоски Микро-Ла-Тест: ОКСИ тест - для выявления цитохромоксидазы, ОНП тест - на бета-галактозидазу, КОЛИ тест - на β-D-глюкуронидазу, ВП тест - на ацетоин; набор реактивов. Исследуют изолированные колонии со сред первичного посева (Эндо, Мак-Конки). Предварительно ставят тест на цитохромоксидазу с полоской ОКСИ тест и О/Ф-тест с глюкозой. Из изолированной колонии со среды Эндо или Мак-Конки готовят суспензию на физиологическом растворе степени № 1 по шкале Мак-Фарланда. Проводят контрольный высев суспензии на чистоту на кровяной агар. Вносят по 100 мкл суспензии бактерий в лунки двух рядов стрипов (16 лунок), добавляют вазелиновое масло в необходимые лунки, вносят полоски ОНП тест, КОЛИ тест, ВП тест в пробирки с суспензией бактерий, инкубируют при 35 - 37 °С в течение 18 - 24 ч. Учитывают все тесты и заносят в бланки. Идентификацию проводят с помощью идентификационных таблиц или книг кодов.
Система мультимикротестов Entero-Screen (АО "Lachema") предназначена для ускоренной идентификации сальмонелл в пищевой промышленности и санитарно-эпидемиологической службе, для идентификации наиболее часто встречающихся энтеробактерий в моче или другом клиническом материале в течение 4 ч. Система представляет собой стрипированный полимерный планшет из 96 лунок, содержащий в каждом из 12 стрипов (по 8 лунок) вышеуказанные среды для 8 ключевых тестов: уреазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, фенилаланиндезаминазы; образование индола, ацетоина; ферментации глюкозы, сахарозы. Дополнительно имеются бумажные полоски: 0X1 test - на цитохромоксидазу, SALM test - на обнаружение сальмонелл, COLI test - на обнаружение Е.coli, PYR test - на выявление пирролидониламидазы.
Для исследования системой Entero-Screen используют чистую культуру, выросшую на среде Эндо, Мак-Конки агаре или агаре с кровью барана. Проводят микроскопию с окраской по Граму и тест на оксидазу (OXI test). Готовят суспензию 3-й степени мутности по Мак-Фарланду. Высевают часть суспензии для проверки чистоты культуры на неселективную среду (24 ч, 37 °С). Вносят по 100 мкл суспензии бактерий во все лунки стрипа, добавляют парафиновое масло в лунки с лизином, орнитином, мочевиной, глюкозой, средой на индол. Инкубируют в течение 4 ч при температуре 35 - 37 °С. Добавляют реактивы на индол, ацетоин, фенилаланиндезаминазу. Учитывают результаты и идентифицируют культуры по таблице идентификации. Идентификацию бактерий из мочи дополняют использованием COLI test. COLI test основан на выявлении β-D-глюкуронидазы по расщеплению 4-метилумбеллиферрил-Д-глюкуронида с высвобождением 4-метилумбеллиферрона, который дает голубую флюоресценцию в УФ лучах. Из исследуемых бактерий готовят суспензию на физиологическом растворе в объеме 1 мл мутностью № 3 по Мак-Фарланду; помещают полоску COLI test в пробирку с суспензией, инкубируют 4 ч при 37 °С, учитывают результат в темной комнате при УФ облучении по появлению голубой флюоресценции суспензии (положительный результат). Затем в пробирку с суспензией добавляют 4 капли реактива на индол (при положительной реакции появится красное кольцо). Положительный тест COLI test имеют около 95 % штаммов Е.coli, положительный тест на индол повышает возможность идентификации Е.coli.
Системы мультимикротестов ММТЕ 1 и ММТЕ 2 (НПО "Аллерген" г. Ставрополь) предназначены для идентификации наиболее распространенных энтеробактерий в течение 18 - 24 ч. Они представляют собой прозрачные полистироловые 96-луночные планшеты, в лунки которых помещены субстратно-индикаторные среды, стабилизированные поливиниловым спиртом и стерилизованные ультрафиолетовым облучением. Система ММТЕ 1 для родовой идентификации позволяет определять 12 тестов: образование индола, сероводорода; наличие лизиндекарбоксилазы, орнитин-декарбоксилазы, уреазы, фенилаланиндезаминазы; ферментацию маннитола, цитрата, малоната, сахарозы, лактозы, сорбитола. ММТЕ 2 дополняет ММТЕ 1 и служит для видовой идентификации по дополнительным 12 тестам: наличие аргининдигидролазы, β-D-галактозидазы, нитратредуктазы; ферментации инозитола, дульцитола, арабинозы, рамнозы, мальтозы, адонита, раффинозы, глюкозы, салицина. В состав набора входят также реактивы для соответствующих тестов. Выделяют чистую культуру на среде Эндо или кровяном агаре. Ставят тест на ферментацию глюкозы (О/Ф тест) на среде Хью-Лейфсона. Из чистой 24 ч культуры грамотрицательных бактерий готовят суспензию мутности № 2 по шкале Мак-Фарланда. Делают контрольный высев суспензии на кровяной агар для проверки чистоты культуры и дополнительных тестов. Вносят по 150 мкл суспензии в каждую лунку систем, добавляют вазелиновое масло в лунки на индол, сероводород, уреазу, лизин, орнитин, аргинин. Инкубируют посевы при 35 - 37 °С в течение 18 - 24 ч. Затем вносят в соответствующие лунки реактивы на индол, фенилаланиндезаминазу, нитриты. Учитывают все тесты, включая О/Ф тест. Идентификацию проводят по таблице идентификации. Разработана компьютерная программа идентификации.
Общим, недостатком всех рассмотренных тест-систем (API 20E, Rapid 20E, Enterotest I и Enterotest 2, Enterotest 16, Entero-Screen, MMTE 1 и ММТЕ 2), является необоснованный перерасход тест-систем, ввиду отсутствия предварительного отбора культур по тесту ферментации глюкозы или позднего учета О/Ф теста с глюкозой (уже после использования тест-систем).
Система ПБДЭ - пластина биохимическая, дифференцирующая энтеробактерии (НПО "Диагностические системы", г. Нижний Новгород) предназначена для биохимической идентификации энтеробактерий в течение 18 - 24 ч, представляет собой полимерную пластину с 20 лунками, содержащими высушенные среды с субстратами для 20 тестов: выявление уреазы, β-D-галактозидазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, аргининдигидролазы; образования сероводорода, индола, ацетоина; ферментацию глюкозы, сахарозы, маннита, малоната, цитрата, цитрата натрия с глюкозой, инозитола, сорбитола, арабинозы, мальтозы. Пластина помещена в полимерный пенал. Исследуемую колонию со среды первичного посева отсевают на скошенный МПА, микроскопируют при окраске по Граму отсевают в пробирки со средой Олькеницкого и полужидким МПА (на подвижность).
Чистую культуру бактерий со скошенного МПА суспензируют в физиологическом растворе и вносят по 100 мкл суспензии во все лунки пластины, добавляют в соответствующие лунки вазелиновое масло. Пластину в пенале инкубируют при 35 - 37 °С в течение 18 - 24 ч. Затем добавляют реактивы в соответствующие лунки и учитывают результаты. Результаты вносят в кодовую карточку. Идентификацию проводят по каталогу кодов.
Тест-система "РАПИД-ЭНТЕРО - 200" (НИИЭМ имени Пастера, отдел новых технологий, г. Санкт-Петербург) предназначена для быстрой 4 ч биохимической идентификации наиболее часто встречающихся в медицинской практике видов энтеробактерий - возбудителей гнойно-септических и острых кишечных инфекций. Тест-система рассчитана на исследование 200 культур бактерий.
Комплект состоит из флаконов с полимерными капельницами, содержащих по 22 мл жидких дифференциальных сред; флаконов с капельницами, содержащих по 22 мл реактивов, и стерильных полистироловых 96-луночных планшетов длямикротитрования однократного применения с крышками. Тест-система обеспечивает постановку 13 тестов: выявление уреазы, триптофандезаминазы, индола, эскулина, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, нитратредуктазы; ферментации лактозы, сахарозы, маннитола, маннозы, арабинозы, адонитола. Исследованию подлежат чистые культуры, выросшие из отсевов колоний со сред выделения на секторах питательного агара (или питательного агара с желчью). Предварительно определяют их возможную принадлежность к семейству энтеробактерий экспресс- тестом на цитохромоксидазу, тестом "тяжа" на грамотрицательные бактерии, ферментацию глюкозы на среде Клиглера. На среде Клиглера учитывают также газообразование при ферментации углеводов и образование сероводорода. Дальнейшему исследованию подлежат грамотрицательные, оксидазонегативные, ферментирующие глюкозу бактерии. Дифференциальные среды во флаконах готовы к немедленному использованию. Для их применения срезают ножницами с соблюдением стерильности верхний закрытый край полимерной капельницы и закрывают отверстие съемным колпачком капельницы. При исследованиях среда из флакона выдавливается по каплям путем надавливания пальцами на эластичные стенки капельницы. Дифференциальные среды вносят в планшеты по 4 капли (100 мкл) в лунку. Среды для одной культуры размещают в одном горизонтальном ряду из 12 лунок в постоянной последовательности (в одной лунке с маннитом содержится и субстрат на нитратредуктазу).
Количество рядов соответствует количеству культур, плюс один ряд контрольный (без посева). Агаровую культуру изучаемых бактерий вносят по полной стандартной петле в каждую лунку со средой и размешивают. Петлю прожигают только в начале и конце посева на весь ряд. На поверхность сред с мочевиной, лизином и орнитином после посева вносят по 2 капли стерильного вазелинового масла. Закрытые крышками планшеты инкубируют при 37 °С. Предварительный учет результатов на среде с мочевиной проводят через 2 мин. и через 1 ч, на среде с лизином - через 2 ч. Через 4 ч после посева добавляют в лунки реактивы на триптофандезаминазу, индол, нитратредуктазу и окончательно учитывают результаты визуально по изменения окраски сред. Результаты вносят в бланки регистрации. Идентификацию культур проводят по таблице идентификации.
Специфичность (достоверность) идентификации энтеробактерий тест-системой составляет 97,6 ± 0,6 %. Диагностическая чувствительность: идентификация 96 ± 0,5 % изолятов энтеробактерий. Это единственная отечественная тест-система ускоренной идентификации энтеробактерий. Она наиболее экономична, обеспечивает большой объем исследований, проста и надежна в использовании. Стоимость одного исследования существенно дешевле, чем всеми другими тест-системами.
Выпускается также вариант тест-системы "РАПИД-ЭНТЕРО-50" на 50 исследований.
Для идентификации редких видов энтеробактерий, не предусмотренных тест-системами, применяют дополнительные тесты в соответствии с видовой характеристикой энтеробактерий, указанной в определителе бактерий Берджи (см. Приложение).
Читайте также: