Технология культивирования клеток женьшеня

Обновлено: 19.09.2024

Основным сырьем для промышленного получения сердечных гликозидов являются виды Digitalis. Биосинтез дигитоксина наблюдался при органогенезе в культуре ткани. Большой интерес представляют исследования, посвященные биотрансформации сердечных гликозидов различными клеточными культурами. Свойство культур тканей превращать (трансформировать) соединения, добавленные в питательную среду, в ценные фармакологически активные вещества, обусловлено значительным биохимическим потенциалом клеток, высокой активностью ферментных систем.

Изучение биотрансформации малоиспользуемого в терапии гликозида дигитоксина в ценные гликозиды проводилось на клеточных линиях Digitalis. Высокий выход продуктов был достигнут при селекции специализированных линий и оптимизации условий роста в специальных аппаратах.

В литературе имеются сведения о биотрансформации дигитоксигенина культурами тканей Strophantus gratus, S. Amboensis, S. Intermedius, дигитоксина – клетками D. Purpurea, прегненолона и прогестерона – N. tabacum и Sophora angustifolia и др. Подробно была изучена способность к биотрансформации дигитоксигенина суспензионной культурой S. Intermedius, выделены и идентифицированы продукты превращений – 3-эпидигитоксигенин, 3-эпи-17-ан-дигитоксигенин, периплогенин, гитоксигенин, 3-эпигитоксигенин, 3-эпипериплогенин, дигитоксигенина -b-D-глюкозид.

Эти результаты свидетельствуют о том, что реакции окисления и эпимеризации 3b-гидроксила, 5b-гидроксилирования и глюкозилирования являются характерными, общими для многих культур. В то же время реакции1b-, 4b-, 12b- и 16b-гидроксилирования и изомеризации 17b-лактонного кольца, вероятно, зависят от происхождения ткани и условий трансформации.

В настоящее время разработаны промышленные способы получения ценных карденолидов, основанные на иммобилизации растительных клеток Digitalis в специальных биокатализаторах.

Лекарственные препараты, получаемые из клеток женьшеня, родиолы розовой, наперстянки, табака.

Из вторичных метаболитов в России, Японии и других странах получены противоопухолевые алкалоиды, шиконин из воробейника аптечного, убихинон Q-10 из табака, гипотензивные средства из барвинка розового, стимуляторы из женьшеня и т.п.

Производство лекарственных субстанций из растений может быть осуществлено тремя конкурентоспособными методиками:

выращиванием растений, которые культивируются на опытном поле;

выращиванием каллусных культур тканей высших растений и тканевых культур низших растений;

Конкурентоспособность традиционных и биотехнологических методик получения биологически активных примесей:

Методика выращивания растительной биомасссы	Время роста	Методика выращивания животных тканей	Время роста
Выращивание растения на опытном поле	1 – 6 мес. и более	Традиционный способ разведения животных	1 – 9 мес. и более
Выращивание каллусных и меристематических клеточных культур	7 – 14 дней	Выращивание культуры клеток ткани на твердой питательной среде	7 – 10 дней
Культивирование микроорганизмов	1 – 3 дня	Культивирование микроорганизмов	1 – 3 дня

Наиболее экономически выгодны вторая и третья методики, т.к. реализуются в аппаратах, характеризующихся высокой производительностью и отличающиеся друг от друга только скоростью роста.

Самой низкой конкурентоспособностью обладает методика выращивания растений на опытном поле, и соответственно, самой высокой конкурентоспособностью (из-за большей скорости роста), обладает методика культивирования микроорганизмов. В данном случае существенное значение имеет также то, что микроорганизмы растут быстрее клеток растений и животных и требуют относительно простые и дешевые питательные среды.

В ММИ им. И.М. Сеченова развивается такая отрасль биотехнологии, как использование тканевых культур низших растений с целью получения вторичных метаболитов, таких как фосфолипиды, этерефицированные эссенциальными жирными кислотами и простогландинами групп Е и F; арахидоновую кислоту; простогландины групп Е₂ и Е₂₂; антиоксиданты различных классов, таких как витамины, обменные полиолы, сахара, аминокислоты, убихинон Q-10 и др.

Следует отметить, что скорость культивирования низших растений, достигнутая в проводившихся исследованиях, сравнима со скоростью третьей методики, что позволило получать новые дешевые препараты для лечения язвенной болезни ЖКТ и стимуляции регенеративных процессов при кровотечении, кроветворении, ранозаживлении и т.д.

© 2014-2022 — Студопедия.Нет — Информационный студенческий ресурс. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав (0.003)

ЖЕНЬШЕНЬ ВЬЕТНАМСКИЙ / PANAX VIETNAMENSIS / КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ / КАЛЛУСНАЯ КУЛЬТУРА КЛЕТОК / СРЕДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАЛЛУСОВ / ФИТОГОРМОНЫ / ВТОРИЧНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ / ТРИТЕРПЕНОВЫЕ ГЛИКОЗИДЫ (ГИНЗЕНОЗИДЫ) / АДАПТОГЕНЫ / ЛЕКАРСТВЕННОЕ РАСТИТЕЛЬНОЕ СЫРЬЕ

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Соболькова Галина Ивановна, Кочкин Дмитрий Владимирович, Титова Мария Владимировна, Григорьев Роман Олегович, Клюшин Андрей Геннадьевич

Женьшень вьетнамский ( Panax vietnamensis Ha et Grushv) уникальный вид рода Panax (семейство Araliaceae), который занимает особое положение среди других представителей этого рода. Для него характерна уникальная композиция тритерпеновых гликозидов, среди которых преобладающими являются гликозилированные производные редкого тритерпенового агликона окотиллола. Женьшень вьетнамский является эндемиком Вьетнама и активно используется в народной вьетнамской медицине. К настоящему времени природные запасы P. vietnamensis существенно истощены, что делает актуальным как проблему сохранения этого редкого вида, так и поиск альтернативных источников получения его биологически активных веществ. Известно, что культура клеток высших растений является уникальной, экспериментально созданной популяцией соматических дедифференцированных клеток. Эта система может быть универсальным инструментом, с помощью которого можно решать как фундаментальные, так и многие практические задачи, в частности, связанные с исследованием специфики получения штаммов-продуцентов и особенностей их вторичного метаболизма. Прикладные аспекты изучения растительных клеток in vitro обусловлены возможностью их использования в качестве источника ценных биологически активных веществ растительного происхождения. Таким образом, оптимизация методов получения культур клеток женьшеня вьетнамского , изучение роста полученных культур и образования в них вторичных метаболитов (гинзенозидов) представляет как теоретическую, так и практическую значимость. В данной работе приведены результаты работ по оптимизации методов получения каллусных культур клеток из корневища Panax vietnamensis (в том числе по оптимизации состава питательных сред), а также данные скрининга основных целевых вторичных метаболитов . Получены несколько линий каллусных культур клеток женьшеня вьетнамского , для двух наиболее активно растущих линий подробно исследованы ростовые характеристики. Для полученных каллусных культур P. vietnamensis проведен предварительный анализ состава тритерпеновых гликозидов (гинзенозидов). Установлено, что предлагаемая методика получения каллусных культур клеток женьшеня вьетнамского достаточно эффективна, полученные линии имеют удовлетворительные ростовые характеристики и содержат не менее 5 основных гинзенозидов, производных окотиллола, протопанаксадиола и олеаноловой кислоты, характерных для этого вида женьшеня.

Obtaining and Study of Callus Cell Cultures of Ginseng Vietnamese Panax Vietnamensis Ha Et Grushv

Ginseng vietnamese ( Panax vietnamensis Ha et Grushv) is a unique species of the genus Panax (the Araliaceae family), which occupies a special position among other members of this genus. It is characterized by a unique composition of triterpene glycosides, among which glycosylated derivatives of the rare triterpene aglycone-ocotylol are predominant. Ginseng vietnamese is endemic to Vietnam and is actively used in folk medicine in Vietnam. To date, the natural reserves of P. vietnamensis are substantially depleted, which makes both the conservation of this rare species and the search for alternative sources of sources of its biologically active substances relevant. It is known that the culture of cells of higher plants is a unique, experimentally created population of somatic dedifferentiated cells. This system can be a universal tool with which you can solve both fundamental and many practical problems, in particular related to the study of the specifics of obtaining producer strains and the characteristics of their secondary metabolism. Applied aspects of the study of plant cells in vitro are due to the possibility of their use as a source of valuable biologically active substances of plant origin. Thus, the optimization of methods for obtaining Vietnamese ginseng cell cultures, the study of the growth of the cultures obtained and the formation of secondary metabolites (ginsenosides) is of both theoretical and practical importance. In this paper, we present the results of work on optimization of methods for obtaining callus cell cultures from the rhizomes of Panax vietnamensis (including optimizing the composition of nutrient media), as well as screening data for the main target secondary metabolites. Several lines of the callus cell cultures of Vietnamese ginseng cells were obtained, the growth characteristics were studied in detail for the two most actively growing lines. For the obtained callus cultures P. vietnamensis, a preliminary analysis of the composition of triterpene glycosides (ginsenosides) was carried out. It has been established that the proposed method of obtaining callus cultures of Vietnamese ginseng cells is quite effective, the lines obtained have satisfactory growth characteristics and contain at least 5 basic ginsenosides, derivatives of ocotyllol protopanaxadiol and oleanolic acid, characteristic for this type of ginseng.

УДК 57.085.23; 57.085.25 Г. И. Соболькова, Д. В. Кочкин, М. В. Титова, Р. О. Григорьев, А. Г. Клюшин, А. М. Носов

получение и изучение каллусных культур клеток женьшеня вьетнамского Panax vietnamensis Ha et Grushv.

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва, Россия

Аннотация. Женьшень вьетнамский (Panax vietnamensis Ha et Grushv) - уникальный вид рода Panax (семейство Araliaceae), который занимает особое положение среди других представителей этого рода. Для него характерна уникальная композиция тритерпеновых гликозидов, среди которых преобладающими являются гликозилированные производные редкого тритерпенового агликона - окотиллола. Женьшень вьетнамский является эндемиком Вьетнама и активно используется в народной вьетнамской медицине. К настоящему времени природные запасы P. vietnamensis существенно истощены, что делает актуальным как проблему сохранения этого редкого вида, так и поиск альтернативных источников получения его биологически активных веществ. Известно, что культура клеток высших растений является уникальной, экспериментально созданной популяцией соматических дедифференцированных клеток. Эта система может быть универсальным инструментом, с помощью которого можно решать как фундаментальные, так и многие практические задачи, в частности, связанные с исследованием специфики получения штаммов-продуцентов и особенностей их вторичного метаболизма. Прикладные аспекты изучения растительных клеток in vitro обусловлены возможностью их использования в качестве источника ценных биологически активных веществ растительного происхождения. Таким образом, оптимизация методов получения культур клеток женьшеня вьетнамского, изучение роста полученных культур и образования в них вторичных метаболитов (гинзенозидов) представляет как теоретическую, так и практическую значимость. В данной работе приведены результаты работ по оптимизации методов получения каллусных культур клеток из корневища Panax vietnamensis (в том числе по оптимизации состава питательных сред), а также данные скрининга основных целевых вторичных метаболитов. Получены несколько линий каллусных культур клеток женьшеня вьетнамского, для двух наиболее активно растущих линий подробно исследованы ростовые характеристики. Для полученных каллусных культур P. vietnamensis проведен предварительный анализ состава

СОБОЛЬКОВА Галина Ивановна - н. с. лаборатории биологии культивируемых клеток Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

SOBOLKOVA Galina Ivanovna - research associate, Cultured cells biology laboratory, K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Sciences.

КОЧКИН Дмитрий Владимирович - к. б. н., н. с. лаборатории биологии культивируемых клеток Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

E-mail: dmitry-kochkin@mail. ru

KOCHKIN Dmitry Vladimirovich - Candidate of Biological Sciences, research associate of Cultured cells biology laboratory, K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Sciences.

ТИТОВА Мария Владимировна - к. б. н., ст. н. с. лаборатории биологии культивируемых клеток Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

TITOVA Maria Vladimirovna - Candidate of Biological Sciences, research associate of Cultured cells biology laboratory, K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Sciences.

тритерпеновых гликозидов (гинзенозидов). Установлено, что предлагаемая методика получения каллусных культур клеток женьшеня вьетнамского достаточно эффективна, полученные линии имеют удовлетворительные ростовые характеристики и содержат не менее 5 основных гинзенозидов, производных окотиллола, протопанаксадиола и олеаноловой кислоты, характерных для этого вида женьшеня.

Ключевые слова: женьшень вьетнамский, Panax vietnamensis, культуры клеток высших растений, каллусная культура клеток, среды культивирования каллусов, фитогормоны, вторичные метаболиты, тритерпеновые гликозиды (гинзенозиды), адаптогены, лекарственное растительное сырье.

G. I. Sobolkova, D. V. Kochkin, M. V. Titova, R. O. Grigoryev, A. G. Klyushin, A. M. Nosov

Obtaining and Study of Callus Cell Cultures of Ginseng Vietnamese Panax Vietnamensis Ha Et Grushv.

K. A. Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Sciences,

Abstract. Ginseng Vietnamese (Panax vietnamensis Ha et Grushv) is a unique species of the genus Panax (the Araliaceae family), which occupies a special position among other members of this genus. It is characterized by a unique composition of triterpene glycosides, among which glycosylated derivatives of the rare triterpene aglycone-ocotylol are predominant. Ginseng Vietnamese is endemic to Vietnam and is actively used in folk medicine in Vietnam. To date, the natural reserves of P. vietnamensis are substantially depleted, which makes both the conservation of this rare species and the search for alternative sources of sources of its biologically active substances relevant. It is known that the culture of cells of higher plants is a unique, experimentally created population of somatic dedifferentiated cells. This system can be a universal tool with which you can solve both fundamental and many practical problems, in particular related to the study of the specifics of obtaining producer strains and the characteristics of their secondary metabolism. Applied aspects of the study of plant cells in vitro are due to the

ГРИГОРЬЕВ Роман Олегович - аспирант лаборатории биологии культивируемых клеток Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

GRIGORYEV Roman Olegovich - PG student of Cultured cells biology laboratory, K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Sciences.

КЛЮШИН Андрей Геннадьевич - к. б. н., н. с. лаборатории биологии культивируемых клеток Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

KLYUSHIN Andrey Gennadievich - Candidate of Biological Sciences, research associate of Cultured cells biology laboratory, K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Sciences.

НОСОВ Александр Михайлович - д. б. н., профессор, зав. лаборатории биологии культивируемых клеток Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

NOSOV Alexander Mihaylovich - Doctor Biological Sciences, Professor, Head of Cultured cells biology laboratory, K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Sciences.

possibility of their use as a source of valuable biologically active substances of plant origin. Thus, the optimization of methods for obtaining Vietnamese ginseng cell cultures, the study of the growth of the cultures obtained and the formation of secondary metabolites (ginsenosides) is of both theoretical and practical importance. In this paper, we present the results of work on optimization of methods for obtaining callus cell cultures from the rhizomes of Panax vietnamensis (including optimizing the composition of nutrient media), as well as screening data for the main target secondary metabolites. Several lines of the callus cell cultures of Vietnamese ginseng cells were obtained, the growth characteristics were studied in detail for the two most actively growing lines. For the obtained callus cultures P. vietnamensis, a preliminary analysis of the composition of triterpene glycosides (ginsenosides) was carried out. It has been established that the proposed method of obtaining callus cultures of Vietnamese ginseng cells is quite effective, the lines obtained have satisfactory growth characteristics and contain at least 5 basic ginsenosides, derivatives of ocotyllol protopanaxadiol and oleanolic acid, characteristic for this type of ginseng.

Keywords: ginseng vietnamese, Panax vietnamensis, cell cultures of higher plants, callus cell culture, callus culture media, phytohormones, secondary metabolites, triterpene glycosides (ginsenosides), adaptogens, medicinal plant material.

В настоящее время в мире наблюдается тенденция к широкому использованию лекарственных средств, полученных на основе растительного сырья. Особый интерес уделяется препаратам, направленным на усиление защитных свойств организма и повышение иммунитета, обладающим адаптогенными свойствами. Из всего растительного разнообразия растения рода Panax (женьшень) являются, пожалуй, самыми знаменитыми лекарственными растениями, обладающими подобными свойствами. Увеличение интереса к лекарствам, созданным на основе различных видов женьшеня, привело к печальным последствиям экологического плана - к практически полному исчезновению дикорастущих экземпляров этих реликтовых растений. Например, в Дальневосточном федеральном округе нашей страны практически полностью уничтожены дикорастущие формы женьшеня настоящего.

Известно, что культура клеток высших растений является уникальной, экспериментально созданной популяцией соматических дедифференцированных клеток. Эта система может быть универсальным инструментом, с помощью которого можно решать как фундаментальные, так и многие практические задачи, в частности, связанные с исследованием специфики получения штаммов-продуцентов и особенностей их вторичного метаболизма. Прикладные аспекты изучения растительных клеток in vitro обусловлены возможностью их использования в качестве источника ценных биологически активных веществ растительного происхождения.

Исследование вторичного метаболизма в клетках высших растений in vitro может быть использовано в качестве нетрадиционного подхода к решению одной из фундаментальных проблем физиологии растений - функциональной значимости вторичных метаболитов в жизнедеятельности клетки и целого растительного организма.

Вьетнамский женьшень (P. vietnamensis) впервые обнаружен нашим соотечественником И. В. Грушвицким и др. [1]. Он занимает особое положение среди других представителей рода Panax L (семейство Araliaceae). Этот вид женьшеня имеет самый южный ареал

Состав питательных сред для инициации каллусообразования (без регуляторов роста)

Растительный мир подарил человечеству огромное богатство – лекарственные растения, содержащие в своем составе уникальные комплексы биологически активных веществ. В современной фармакопее определен список официальных растений (их более 300), среди них – корень жизни "Женьшень". Женьшень обыкновенный (Panax ginseng С. A. May) – одно из древнейших лекарственных растений. В течение многих веков в странах Восточной Азии он пользовался славой все исцеляющего средства и был окружен таинственным ореолом бесчисленных суеверий и легенд. И в настоящее время достаточно велика потребность в лекарственных препаратах и биологически активных добавках к пище (БАД) на основе корня первого из открытых растительных адаптогенов. Препараты на его основе широко применяются в мировой практике в качестве тонизирующих и общеукрепляющих средств для лечения и профилактики различных заболеваний центральной нервной системы, повышения работоспособности и сопротивляемости организма к стрессовым ситуациям, неблагоприятным воздействием внешней среды. Биологическую активность женьшеня связывают с наличием в его химическом составе 18 групп веществ, среди которых главную роль играют панаксозиды. Ценность химического состава дополняют также аминокислоты, макро- и микроэлементы, витамины, эфирные масла, липиды, пектиновые вещества [1,2].

Женьшень обыкновенный – одно из древнейших лекарственных растений, известное человеку не одно тысячелетие. В китайской медицине женьшень считается все исцеляющим средством. В отечественной фармакологии женьшень включен в Государственный реестр лекарственных средств как мощное тонизирующее, общеукрепляющее, адаптогенное средство, повышающее иммунитет, сопротивляемость организма при стрессовых ситуациях [4].

Помимо медицины биомасса женьшеня находит применение и в других отраслях народного хозяйства. Так, например его применяют в пищевой промышленности при производстве напитков, конфет, различных каш, в парфюмерно-косметической промышленности при производстве лосьонов, кремов, шампуней и мыла. Находит применение женьшень и в сельском хозяйстве при производстве кормов для животных, а также стимуляторов роста растений. В качестве примера хотелось бы назвать препарат Рибав. Он стимулирует рост и развитие растений, повышает иммунитет к биотическим и абиотическим факторам среды, а тем самым влияет на увеличение урожайности с единицы площади [5].

Общий запас дикорастущего женьшеня на территории российского Дальнего Востока оценивается специалистами как 5000-6000 кг в пересчете на вес сырого корня. При этом заготовки женьшеня в природе ограничены до минимума, так как он внесен в Красную книгу СССР и Российской Федерации. Ежегодная квота на добычу дикорастущего корня женьшеня в Российской Федерации составляет порядка 60-70 кг. При этом потенциал российского рынка потребления "корня жизни" составляет 600-700 тонн в год [1].

Большая часть потребности женьшеня в настоящее время восполняется за счет использования корня выращенного на организованных растительных плантациях, а также с использованием культуры ткани и клеток в биореакторах различного технического исполнения и конструкции. При этом, в промышленных масштабах женьшень культивируют на ограниченной территории, а разработанная технология производства биомассы женьшеня достаточно дорогостоящая и не гарантирует стабильного производства качественного сырья. Все это приводит к тому, что фармацевтический рынок РФ насыщен зарубежными дорогостоящими лекарственными средствами и биологически активными добавками произведенными с использование зарубежной сырьевой базы.

Используя многолетний практический опыт специалистами хозяйства разработана уникальная агротехнология возделывания женьшеня от посадки семян до получения стандартного сырья. При этом, корни женьшеня обыкновенного выращенные в условиях Самарской области обладают уникальным химическим составом. Результаты проведенных химических исследований специалистами Самарского государственного медицинского университета с использованием тонкослойной хроматографии (ТСХ) и УФ-спектроскопии (спектрофотометр “Specord 40”, Analytik Jena) свидетельствуют о том, что корни женьшеня содержат набор панаксозидов, превосходящий характеристики дикорастущего сырья.

В настоящее время налажен выпуск настойки корня женьшеня с содержанием панаксозидов – не менее 0,017 %.

Производство сырьевой базы осуществляется в оптимальных почвенно-климатических условия для роста и развития культуры, что проявилось в уникальности химического состава нового сорта женьшеня, в разы превышающего качественные показатели корня выращенного в условиях Дальнего Востока. Однако ограниченная площадь питомника не позволяет в полной мере обеспечить промышленных потребителей Самарской области таким необходимым сырьем, а их насчитывается в настоящее время уже более десятка.

В основе технологии лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

Разработанная технология соответствует классической схеме оздоровления и микроклонального размножения растений с использованием существующих апикальных и латеральных меристем, а её принципиальное отличие от существующих связано с использованием в составе питательной среды уникального органо-минерального состава и разработанного комплекса адаптационных мероприятий при переводе произведенных растений из условий invitro в invivo.

Основные термины (генерируются автоматически): Самарская область, корень женьшеня, время, Российская Федерация, сопротивляемость организма, дикорастущий женьшень, народное хозяйство, пищевая промышленность, плантационный женьшень, российский Дальний Восток.

Cавушкин А. И., Сидорова Н. А., Прокопюк С. М. Особенности биотехнологии растительных тканей, органов и клеток in vitro при получении фармакологически ценных метаболитов // Journal of Biomedical Technologies. 2015. № 1. С. 23–28.

Методические рекомендации

Введение

Биоинженерные подходы к созданию продуцентов биологически активных веществ (БАВ) из растительных организмов разрабатываются уже приблизительно с середины прошлого века, и на сегодняшний день они претерпели значительные изменения, благодаря развитию различных направлений биологии: геномики, эпигеномики, интерферомики, протеомики, метаболомики, транскриптомики и др. Огромный объём данных, получаемых методами этих разделов науки, очень важен для системной биологии, изучающей сложные биологические системы. К таким системам можно отнести и суспензионные культуры растительных клеток, и культуры каллусных тканей, а также структуру взаимодействий между отдельными клетками в этих культурах. Для оптимизации процессов накопления вторичных метаболитов в таких сложных многокомпонентных системах разрабатываются технологические подходы, основанные на сумме экспериментальных данных, получаемых с помощью вышеупомянутых научных дисциплин. При этом, часто приходится сталкиваться с множеством трудностей как технологического, так и методологического характера. Так, например, секвенирование de novo геномов высших растений является сложной задачей, так как многие растения являются полиплоидами и их геномы содержат значительную долю повторяющихся последовательностей. Также, у высших растений имеются так называемые аллополиплоидные формы, содержащие близкие, но не идентичные геномы, что также усложняет задачу и увеличивает стоимость анализа структуры генома. С другой стороны, данный метод геномики, позволяющий определить весь набор нуклеотидных последовательностей неизвестного генома, предоставляет возможность произвести скрининг генов, вовлечённых в пути биосинтеза продуктов обмена веществ лекарственных растений и, далее, с помощью генноинженерных методов активировать их работу для получения биологически активного вещества необходимого качества и количества.

Одним из перспективных продуцентов БАВ растительного происхождения считают маклюру оранжевую (Maclura pomifera (Raf.) Schneid.). Из соплодий маклюры в официальной медицине многих стран изготавливают лекарства для улучшения сердечной деятельности, антибиотики, составы для лечения поверхностных ран. К основным соединениям маклюры, обладающим биологической активностью, в настоящее время относят два наиболее изученных изофлавона (изомерные соединения флавоноидов) – осайин и помиферин, способные укреплять стенки капилляров. Также большое значение имеют стероидоподобные вещества, найденные в плодах маклюры – лупеол и ситостерол, обладающие противовоспалительными и простатопротекторными свойствами. Исследование этих и других БАВ маклюры на различных объектах в условиях in vitro и in vivo показало, что они обладают антимикробным, антиоксидантным, кардиопротекторным, противоопухолевым действием. Выделяемые из плодов этого растения соединения обладают также иммуномодулирующим действием.

В лаборатории доклинических исследований, клеточной патологии и биорегуляции Института высоких биомедицинских технологий ПетрГУ разрабатываются новые подходы к культивированию клеток и тканей растений продуцентов БАВ. В период с 2014-2015 г.г. в рамках Программы стратегического развития ПетрГУ проведена серия экспериментов по апробации методов получения каллусной культуры Maclura pomifera (Raf.) Schneid. – продуцента широкого спектра физиологически активных веществ, таких как флавоноиды, тритерпеноиды, стероиды, аминокислоты и витамины.

Материалы и методы

Для введения опытного растения в каллусную культуру готовили питательную среду Мурасиге-Скуга согласно прописи (Murashige, 1969) c добавлением витаминов десятикратной концентрации и стимуляторов роста (ауксины и цитокинины). Для получения первичного каллуса готовили несколько сред с различным соотношением регуляторов роста. В качестве ауксинов использовали 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) и 3-индолилуксусную кислоту (ИУК) в диапазоне концентраций 0.5-1 мг/л и 1-5 мг/л, соответственно. Концентрация цитокининов (бензиламинопурин) составляла от 10 -5 до 10 -7 моль/л. Источником эксплантов служили зрелые плоды маклюры. Сначала их отмывали водой с детергентом от загрязнений, обрабатывали спиртом, после чего стерилизовали поверхность плодов раствором гипохлорита кальция в 2–5%-ной концентрации с последующим промыванием стерильной дистиллированной водой. После этого плоды разрезали в условиях ламинар-бокса на несколько частей, из которых в дальнейшем извлекали ткани мезокарпия размером, в среднем, 5 мм. После этого экспланты помещали на подготовленные питательные среды в чашки Петри, которые располагали под лампами дневного света. Развитие каллуса наблюдалось через 1-2.5 недели после введения в культуру. Первичный каллус начинал формироваться с краёв эксплантов в средах с повышенным содержанием ИУК и без определённой локализации – в вариантах с высокой концентрацией 2,4-Д. Экспланты на всех типах питательных сред образовывали каллус серовато-белого цвета рыхлой консистенции.

Результаты

Таблица. Развитие каллуса у эксплантов Maclura pomifera в зависимости от концентрации фитогормонов в питательной среде

Концентрация фитогормонов	7 суток (мм)	13 суток (мм)	18 суток (мм)
ИУК (0.5 мг/л)	5.6	6.2	7.2
ИУК (1.0 мг/л)	5.5	6.7	7.8
2,4-Д (1.0 мг/л)	5.8	6.8	8.1
2,4-Д (5.0 мг/л)	6.1	7.2	10.3

Заключение

Можно предположить, что вариабельность эксплантов Maclura pomifera (Raf.) Schneid по способности к калусообразованию связана с изменениями направленности метаболических процессов в ходе каллусогенеза. Растения обладают метаболическими путями биосинтеза десятков тысяч вторичных продуктов. Набор вторичных метаболитов растений очень разнообразен. Если количество первичных метаболитов, синтезируемых в ключевых процессах первичного метаболизма (фотосинтез, дыхание, углеводородный, липидный и азотный обмен), достигает нескольких сотен, то, по приблизительным оценкам, количество метаболитов, образующихся в процессах вторичного метаболизма, достигает 200 000 (терпены, поликетиды, фенолы, алкалоиды, цианогенные гликозиды, небелковые аминокислоты) (Fett-Neto, 2010; Gupta, 2015). В отличие от первичных метаболитов, присутствующих во всех растительных клетках, вторичные метаболиты могут быть специфичны для одного или нескольких видов растений (Борисова, 2014). Кроме этого, вещества вторичного метаболизма не имеют собственных путей синтеза и для своего образования используют основные метаболические пути растений. Их биосинтез происходит на ответвлениях метаболических путей белков, углеводов, липидов, где функционирует широкий спектр ферментов, обусловливающих способность растений синтезировать разнообразные соединения (Борисова, 2014; Воинов, 2015). Одним из биотехнологических подходов к изменению метаболизма растений и, в конечном счёте, к увеличению выхода вторичных метаболитов, являющихся во многих случаях конечным целевым продуктом в цикле производства лекарственных препаратов, является контроль экспрессии генов, вовлечённых в данный процесс, на уровне основных регуляторных факторов транскрипции, которые являются привлекательными объектами для инжиниринга вторичных метаболических путей (Kayser, 2007; Воинов, 2015). Эти подходы, основанные на знаниях, накапливающихся в области метаболомики и транскриптомики, служат основой для разработки инструментов метаболической инженерии, дают возможность проектировать и создавать новые метаболические пути в растительных организмах, получать продукты лекарственного назначения с заданными свойствами, которые невозможно получить традиционными способами. Инжиниринг метаболических путей растений направлен на получение в трансгенной клетке новых биохимических реакций путем введения чужеродных генов или модификацией генов клетки-хозяина (Wu, 2008). Иногда такими продуцентами важных лекарственных соединений являются уникальные тропические и эндемические растения, недоступные для их агротехнического производства в умеренных климатических зонах большинства развитых стран мира. Выделение из таких растений генов, определяющих направленный синтез специфических органических соединений, и их перенос в подобранные соответствующим образом растения превращает их в новые продуценты важных биологически активных веществ.

Библиография

1. Arora R. Medicinal Plant Biotechnology. Wallingford: CAB International; 2010.

2. Fett-Neto AG (Ed.) Plant Secondary Metabolism Engineering: Methods and Applications. Methods in Molecular Biology 2010, 643.

3. Gupta VK, Tuohy MG, Lohani M, O'Donovan A (eds.). Biotechnology of Bioactive Compounds: Sources and applications. Chichester: John Wiley & Sons, Ltd; 2015.

4. Kayser O, Quax WJ (eds.). Medicinal Plant Biotechnology. From Basic Research to Industrial Applications. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA; 2007.

5. Murashige T, Tucker DPH. Growth factor requirements of Citrus tissue culture. Proc First Int Citrus Symp 1969, 3:1155-1161.

6. Wu S, Chappell J. Metabolic engineering of natural products in plants: tools of the trade and challenges for the future. Curr Opin Biotechnol 2008,19:145-152.

7. Борисова Г.Г., Ермошин А.А., Малева М.Г., Чукина Н.В. Основы биохимии вторичного обмена растений: учебно-методическое пособие. Екатеринбург: Изд-во Уральского университета, 2014. 128 с.

10. Булгаков В.П., Федореев С.А., Журавлев Ю.Н. Биотехнология – здоровью человека: научные достижения и первые шаги инноваций на Дальнем Востоке // Вестник ДВО РАН. – 2004. – №3. – С.93-99.

11. Дейнеко Е.В. Генетически модифицированные растения – продуценты рекомбинантных белков медицинского назначения // Вестник Томского государственного университета. Биология. – 2012. – №2(18). – С. 41-51.

Читайте также: