Микроклональное размножение картофеля in vitro

Обновлено: 18.09.2024

Ключевые слова: картофель, сорт, микроклональное черенкование, коэффициент размножения, модифицированные питательные среды, салициловая кислота.

Ryabtseva Т.V. 1 , Kulikova V.I. 2 , Khodaeva V.P. 3

1 ORCID: 0000-0003-0062-852Х, PhD in Agriculture, 2 ORCID: 0000-0002-6204-7555, PhD in Agriculture, 3 ORCID: 0000-0003-1447-6141,

Kemerovo Scientific and Research Institute of Agriculture – branch of Siberian Federal Scientific Centre of Agro-BioTechnologies of RAS, Kemerovo

EVALUATION OF NUTRIENT MEDIA UNDER REPRODUCTION OF POTATO VARIETY IN CULTURE IN VITRO

Abstract

Keywords: potato, variety, microclonal propagation, multiplication factor, modified nutrient media, salicylic acid.

На первоначальном этапе ускоренного размножения оздоровленных меристемных растений в учреждении применяется метод микроклонирования в культуре in vitro [1, C. 66],[2, С. 81].

Главным критерием оценки эффективности микроклонального размножения считается хорошее развитие растений из черенков, без аномалий в органогенезе, с хорошими биометрическими показателями (высокой биомассой, сформированными черенками, листочками, развитыми корнями). Основные факторы, обусловливающие параметры роста и развития микрорастений – сортовые особенности и состав питательной среды [3, С.187], [4, С. 14].

При работе с картофелем необходим специальный подбор ингредиентов сред для достижения поставленной цели. Так, в опытах Федоровой Ю.Н. и Федоровой Л.Н. у сортов Наяда и Загадка Питера более активный рост растений в высоту происходил на среде Мурасиге-Скуга с концентрацией минеральной части ½ и содержанием гиббереллина 1 мг/л [5, С. 360]. В исследованиях Мишурова В.П. и соавторов увеличение дозы вводимого кинетина с 1 до 4 мг/л способствовало повышению числа листьев и междоузлий у сорта Адретта, по сравнению с контролем (стандартная питательная среда), на 13% [6, С. 221].

Фитогормоны – это важнейшие вещества, которые обеспечивают регуляцию физиологических процессов в растениях. К таким соединениям относятся салициловая кислота, которая играет важную роль в защите растений от микромицетов, регулируя защитный ответ при действии патогенов. [8, С. 220].

Общий недостаток микроклонального размножения заключается в том, что при массовом размножении сразу нескольких сортов в культуре in vitro наблюдается различная сортовая реакция растений на стандартную питательную среду. Это часто приводит к значительному ухудшению роста и развития растений in vitro (ветвление, отмирание верхушек, образование каллуса), снижению коэффициента размножения [9, С. 195], [10, С. 22].

Цель работы – дать оценку эффективности размножения сортов картофеля в культуре in vitro на питательных средах с различным фитогормональным составом.

Исследования проведены в лаборатории селекции, биотехнологии и агротехники картофеля Кемеровского НИИСХ – филиала СФНЦА РАН, путем постановки опытов в лабораторных условиях (2016-2017 гг.). Объекты исследований – сорта картофеля спелости в культуре in vitro: Танай, Кемеровчанин, Мариинский; питательные среды с различным фитогормональным составом, по минеральному составу за основу взята среда Мурасиге-Скугу.

Пробирки с посаженными растениями помещали в специальный бокс с постоянным светопериодом и влаго- температурным режимом. Температуру поддерживали на уровне 20 – 24 0 С, освещенность 8±2 тыс. люкс, фотопериод 16 часов, влажность – 70%.

Основной метод ускоренного размножения оздоровленных растений регенерантов картофеля – микроклональное черенкование in vitro. Главное требование к питательной среде – обеспечение высокого коэффициента размножения в короткие сроки, то есть максимального выхода растений из микрочеренков с минимальным количеством растений с аномалиями.

При ускоренном размножении в пробирочной культуре основные морфометрические показатели хорошего развития микрорастений: высота растений, число сформированных междоузлий с хорошо развитым листовым аппаратом, длина междоузлий, количество и масса корешков.

Таблица – Влияние модификации питательной среды на развитие микрорастений в культуре in vitro, (среднее)

Применение питательных сред с различным фитогормональным составом не оказало влияния на морфогенную активность микрочеренков сорта Танай, даже при достоверном снижении количества корешков у растений картофеля, выращенных на питательной среде №3, на 5,1 шт./ раст. (НСР₀₅ = 3,2) остальные изучаемые показатели находились на уровне контроля (табл.).

Однако на сортах Кемеровчанин и Мариинский хорошее развитие растений отмечали при культивировании растений на питательной среде №1 (контроль) и питательной среде № 2 с добавлением хитозана и циклоферона. Растения картофеля, выращенные на питательной среде № 3, где пониженная концентрация регулятора роста гиббереллина на 0,5 мг/л и добавлен кинетин 0,1 мг/л, а также салициловая кислота 14,3 мг/л увеличивалось число растений с аномалиями на 3,0-17,2 %. У микрорастений изучаемых сортов снижено количество корешков на 15,9-58,6 % и их масса на 72,7-91,7 %, высота растений на 35,1-71,3 %, количество междоузлий на 16,4-36,7 %, коэффициент размножения на 4,0-30,0 %, что подтверждается результатами дисперсионного анализа.

В результате проведенного корреляционного анализа установлена средняя зависимость между массой корешков и высотой растения r = 0,58, высокая зависимость между следующими показателями: высотой растений и длиной междоузлий r = 0,98, количеством междоузлий и коэффициентом размножения r = 0,92, между длиной междоузлий и коэффициентом размножения r = 0,76.

Определена доля влияния изучаемых факторов на морфометрические показатели растений картофеля в культуре in vitro, на формирование растений картофеля наибольшее влияние оказал состав питательной среды (фактор В): количество корешков – 34 %, массу корешков – 69 %, высоту растений – 74 %, количество междоузлий – 82 %, длина междоузлий – 64 % и коэффициент размножения 65%.

На питательной среде № 3 (с иммуномодуляторами), где снижена концентрация регулятора роста гиббереллина на 0,5 мг/л с добавлением кинетина 0,1 мг/л и салициловой кислоты 14,3 мг/л у микрорастений сортов Танай, Кемеровчанин, Мариинский резко снижены морфометрические показатели.

Список литературы / References

Список литературына английском языке / References in English

Г.М. Сафроновская, кандидат с.-х. наук.

Отличный вкус картофеля — это не только признак сорта, но и грамотно применённая агротехника. Вкус любого сорта картофеля портится при нарушении агротехники выращивания. Клубни одного и того же сорта в разные годы, выращенного на разных почвах, отличаются по вкусу. Это объясняется различием в составе биохимических элементов. Наилучшие кулинарные качества имеет картофель при соотношении крахмала и белков 12:16. При преобладании крахмала над белками в 8 раз — клубни не разварятся, а при свыше в 16 раз — они растрескаются при варке в кожуре. Особенный вкус картофелю придают глютаминовая и аспарагиновая кислоты. На вкусовые качества также влияют содержащиеся в нем жиры, эфирные масла и спирты.

С течением времени картофель вырождается. Особенно быстро это происходит при несбалансированном питании. Поэтому сортовой состав культуры периодически требует обновления. При приобретении семенного картофеля в первую очередь интересуются его возрастом (репродукцией). Чем моложе семенной материал, тем он здоровее и дороже стоит.

Сегодня, кроме традиционных методов размножения картофеля (выращивания из семян и клубней), его оздоровленный семенной материал получают путем микроклонального (меристемного) размножения. Микроклональное размножение незаменимо для постоянного получения в короткие сроки значительного количества качественного семенного безвирусного картофеля (использование зараженного посадочного материала ведет к значительному недобору урожайности и качества клубней, увеличивает затраты на химические методы борьбы с болезнями).

Как оздоравливают посадочный материал? Используют культивирование картофеля из апикальной меристемы (in vitro). Меристема — это особая ткань растений, которая сохраняет способность к образованию новых клеток, угнетая синтез вирусных нуклеопротеидов (вирус не поражает меристемы на верхушках побегов). За счет деления меристемы растения растут, образуя листья, стебли, корни и цветки. Меристемная ткань сохраняется в узлах побега, почках, кончиках корней, у основания черешков листьев и цветоносах.

На первом этапе меристемные ткани отделяют от нужного экземпляра растения и помещают на питательные среды в стерильные пробирки, выдерживая их в специальном шкафу в течение 20-40 дней при освещении до 14 часов в сутки.

Через 1,0-1,5 месяца на микрочеренках образуются зачатки всех вегетативных органов растения. Подрощенные микрочеренки делят на 5-7 частей, которые снова проращивают в пробирках в течение 20-30 дней.

Когда меристемные микрочеренки образуют достаточную корневую систему, проводят их укоренение и адаптацию. Их пересаживают из пробирок в заполненные легким торфом горшочки, которые для привыкания растений к естественным условиям выращивания помещают в защищенную среду на 4-6 недель. В этот период растения уязвимы и плохо приживаются.

После укоренения и адаптации новые растения картофеля доращивают по свойственной картофелю агротехнике, высаживая в теплицу, а затем и в открытый грунт.

Полученный микроклональным способом оздоровленный картофель наследует все признаки конкретного сорта и в дальнейшем может размножаться любым способом. При микроклональном размножении сорт картофеля не приобретает никаких новых свойств.

Важное преимущество полученного микроклональным размножением оздоровленного семенного картофеля — повышение урожайности клубней на 30-70% и предотвращение их потерь во время хранения на 30-50%.

Перед существующими традиционными способами размножения этот метод имеет следующие преимущества:

получение генетически однородного посадочного материала;
освобождение растений от вирусов;
высокий коэффициент размножения;
сокращение продолжительности селекционного процесса;
ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
возможность проведения работ в течение года и экономия площадей для выращивания посадочного материала.

Выращивание картофеля по современным технологиям

Меристемный метод размножения (in vitro) давно и широко применяется в современных технологиях выращивания семенного картофеля. В странах ЕС для производства столового картофеля введено требование использования только девирусированных семян, что позволяет получать высокую урожайность и снижать применение химических СЗР.

Известно, что такой технологический прием на посадках картофеля, как декапитация (механическое удаление верхушек стеблей на 5 см), позволяет увеличить общую листовую поверхность. При этом влияет на формирование высокой фотосинтетической площади листьев и урожайность, снижает поражаемость клубней некоторыми болезнями (Гаспарян И.Н., Евстратова Л.П.).

Современные научные исследования. Приведём результаты исследований доктора наук Людмилы Трипольской из Вокеского ф-ла Центра аграрных и лесных наук Литвы (Вильнюс), по изучению влияния биологически активных продуктов на основе аминокислот, а также декапитации стеблей на продуктивность меристемных микроклонов раннего картофеля сорта Goda и позднего сорта Aista.

Однако при пересадке микроклонов в теплицы частично нарушается корневая система. Растения попадают в среду с большей концентрацией солей, изменяющимся температурным режимом и часть микроклонов плохо приживается. Испытывая стресс, растения могут снижать продуктивность. Поэтому после посадки микроклонов в субстрат для снижения стресса применяли биоактивный продукт Prolis (пролиновую аминокислоту), а также увеличивающий осмос клетки Pompa (глютаминовая аминокислота + K2SO4), что защищало растения от повышенной концентрации солей. Спустя 30 дней биоактивные продукты вносили повторно по листьям согласно схеме опыта. Удаление верхушек стеблей проводили в начале и в фазу полной бутонизации картофеля.

Фон (N60P40K80 кг/га).
Prolis после посадки микроклонов в субстрат.
Prolis + Pompa после посадки микроклонов в субстрат.
Prolis после посадки микроклонов в субстрат и через 30 дней по листьям.
Prolis + Pompa после посадки микроклонов в субстрат и через 30 дней по листьям.
Декапитация верхушек стеблей картофеля в начале бутонизации (ВВСН 50).
Декапитация верхушек стеблей картофеля в фазу полной бутонизации (ВВСН 57).

Полученные из микроклонов семенные клубни дифференцировали по величине: большими считали клубни с диаметром более 2 см, средними — 1-2 см, а менее 1 см относили к мелким и их повторно высаживали в теплице. Количество клубней, выращенное из одного микроклона растения, достигало 7-18 штук.

В период вегетации раннего и позднего сортов картофеля исследовали влияние изучаемых биопродуктов и удаления верхушек стеблей на биохимический состав растений — содержание азота в растениях и накопление сахаров в листьях в период цветения ( рис. 1).

Рис. 1. Содержание азота (%) в листьях раннего и позднего картофеля в фазу цветения при обработке микроклонов биопрепаратами и декапитации

Реакция раннего и позднего сортов картофеля разная. Установлено, что растения позднего сорта картофеля Aista накапливали азота в период цветения больше, чем раннего Goda. Декапитация также увеличивала ассимиляцию азота растениями в фазу цветения, но срок проведения декапитации не влиял на поглощение азота.

Биоактивные препараты и особенно декапитация значительно снижали накопление сахаров в листьях в период цветения, скорее всего, в силу их интенсивного оттока в столоны и формирующиеся клубни картофеля.

Изучение продуктивности картофеля раннего сорта Goda показало, что на фоне с минеральными удобрениями формировалось в среднем 8,6 клубней при средней массе 1 клубня 14,8 г (рис. 2, 3). Их количество увеличивалось при обработках микроклонов биопродуктом Prolis до 9,1-9,5 штук/раст. Декапитация на количество клубней не влияла, но в период полной бутонизации она увеличивала массу клубня до 18,1 г. Наибольшая масса 1 клубня (19,9 г) была при двукратной обработке сорта Goda биопрепаратами Prolis + Pompa. Только при двукратном применении этих биопрепаратов получили увеличение массы клубней с 1 растения до 144 и 155 г и масса клубней коррелировала с содержанием азота в листьях в период цветения. Для семенного картофеля важен размер клубней. При двукратной обработке Prolis и Pompa и декапитации в период полной бутонизации на клубни более 2 см приходилось 60% и меньше всего (10-11%) была доля клубней менее 1 см.

ТОП-13 вредителей картофеля

На продуктивность картофеля позднего сорта Aista исследуемые продукты оказывали несколько иное влияние. Отмечалась более сильная зависимость массы клубней от содержания азота в фазу цветения в листьях. Количество клубней на 1 растении увеличивалось от 7,4 шт. на фоне до 9,6 штук от однократного применения смеси биопрепаратов Prolis и Pompa, да и декапитация оказывала большее влияние. Чем меньше было количество клубней на растении, тем меньше была масса одного клубня. Наибольшее количество клубней формировали растения при применении продукта Prolis один раз за вегетацию.

Рис. 2. Масса клубней (г) с 1 растения микроклона раннего и позднего картофеля при обработке биопрепаратами и декапитации

Рис. 3. Влияние обработки биопрепаратами и декапитации на массу 1 клубня (г) у микроклонов раннего и позднего картофеля

В итоге установлено, что влияние биоактивных препаратов на продуктивность микроклонов зависело от генотипа картофеля. От обработки микроклонов растений биопрепаратами отмечалась лишь тенденция повышения массы клубней раннего картофеля. Декапитация в фазу полной бутонизации значительно увеличивала массу клубней.

Продуктивность микроклонов позднего картофеля существенно возрастала от уменьшающего стресс биоактивного препарата Prolis и его смеси с увеличивающим осмос клетки биопрепаратом Pompa дважды за вегетацию. Более эффективным на позднем сорте картофеля было удаление стеблей растений в фазу полной бутонизации (ВВСН 57).

Безушибочный картофель, итоги семеноводства

По мнению ученого из Литвы, экономическая оправданность обработок растений картофеля биопрепаратами и удаление верхушек в период бутонизации понятны. Такие приёмы увеличения продуктивности семенного картофеля широко используются в экологических хозяйствах Нидерландов.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Способ включает культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, аскорбиновую кислоту и сахарозу, получение растений-регенерантов и получение микроклубней картофеля. При этом этиолированные проростки (1-1,5 см) стерилизуют в 0,1%-ном растворе диацида в течение 3-5 мин с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной Н₂О. Для культивирования микрорастений и образования микроклубней используют стеклянные банки (900 мл) с металлической крышкой и отверстием в крышке для внесения питательной среды и микрорастений. Закрывают отверстие ватно-марлевой пробкой и покрывают фольгой. В питательную среду для клубнеобразования вносят сахарозу 81000-85000 мг/л, феруловую кислоту 1-2 мг/л, кинетин 1-2 мг/л, тиамин 1-1,2 мг/л при температуре 20°С. Условия светового дня – 8 ч (5000 лк), условия полной темноты – 16 ч, культивируют в течение 30 дней до образования микроклубней. Способ позволяет получать оздоровленный отечественный картофель, свободный от скрытой вирусной инфекции и обладающий отличными качественными характеристиками, прост в использовании, экологически безопасен и может быть использован на картофелевыращивающих предприятиях. 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к биотехнологии растений, в частности к получению безвирусного и продуктивного исходного материала для дальнейшего семеноводства картофеля.

Картофель - вегетативно-размножаемая культура, относительно слабая по устойчивости к вирусам, важнейший продукт питания населения. Россия занимает одно из последних мест по урожайности культуры картофеля. Низкая урожайность связана с резкими температурными колебаниями и инфицированностью почвы возбудителями болезней и низким качеством семенного материала. Зараженность патогенами семенного материала является одной из основных причин снижения урожайности картофеля.

Для защиты картофеля от вирусной инфекции и вырождения требуются регулярное оздоровление исходного посадочного материала.

Известен способ микроклонального размножения картофеля, включающий культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем черенкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, сахарозу, Fe-хелат, глицерин, ИУК, агар-агар, витамины по Уайту, получение меристемных растений-регенерантов и высадку растений в грунт, при этом перед высадкой в грунт меристемные растения-регенеранты подвергаются ежесуточному воздействию температурой +4-+5°C в течение 2 ч продолжительностью 6-7 дней [Патент RU №2487532 (13) C1, МПК A01H 4/00, А01G 7/00, 20.07.2013 (аналог).

Недостатками данных способов размножения картофеля являются низкая скорость роста растений in vitro, небольшой выход растений-регенерантов и микроклубней из одного исходного растения, маленькие размеры микроклубней и трудоемкость работы с пробирками.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе микроклонального размножения картофеля, включающем культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, аскорбиновую кислоту, сахарозу, для получения микроклубней в питательную среду дополнительно вводят кинетин, феруловую кислоту, тиамин, повышенную концентрацию сахарозы и изменяют условия культивирования.

Питательная среда в контрольном варианте (табл. 1) готовилась по прототипу, в опытном варианте в питательную среду для клубнеобразования in vitro добавляли 1-2 мг/л феруловой кислоты, 1-2 мг/л кинетина, 1,0-1,2 мг/л тиамина и сахарозы 81000-85000 мг/л.

Способ осуществляют следующим образом.

Оздоровление картофеля от фитопатогенов осуществлялось вычленением этиолированных проростков, разделением их на кусочки (1-1,5 см с одной почкой), стерилизацией в 0,1%-ном растворе диацида в течение 3-5 мин с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной H₂O, вычленением и внесением апикальных меристем на питательную среду для культивирования апикальных меристем, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, аскорбиновую кислоту, сахарозу 20000 мг/л, кинетина 1-2 мг/л, ИУК 1-2 мг/л для морфогенеза и образования меристемных оздоровленных растений-регенерантов. Размножение оздоровленных растений-регенерантов проводилось микрочеренкованием in vitro на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, аскорбиновую кислоту, сахарозу 20000 мг/л, кинетин 1-2 мг/л, феруловую кислоту 1-2 мг/л, тиамин 1 мг/л. Выращивание и размножение растений-регенерантов производили при 16-ти часовом освещении (5000 Лк), 8 ч полной темноты, при температуре 22-25°C, влажности воздуха 70%.

Для получения микроклубней картофеля использовалась питательная среда, содержащая макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, аскорбиновую кислоту, сахарозу 81000 -85000 мг/л, кинетин 1-2 мг/л, феруловую кислоту 1-2 мг/л, тиамина 1,0-1,2 мг/л и следующие условия культивирования: 8 ч освещения (5000-7000 Лк), 16 ч полной темноты, при пониженной температуре 19-20°C и относительной влажности воздуха 70-80%, культивируют в течение 30 дней до образования микроклубней.

Для культивирования растений-регенерантов используют стеклянные банки с резьбой и металлической герметичной завинчивающейся крышкой объемом 900 мл (82×160 мм) с вырезанным отверстием в крышке для внесения питательной среды и эксплантов. Отверстие закрывают ватно-марлевыми пробками и обворачивают фольгой, составляют в медицинские бюксы, автоклавируют 20 мин при давлении 1 атм и температуре 120°C. Используют различные варианты питательных сред, которые различаются по содержанию сахарозы, фитогормона - кинетина, ароматической непредельной карбоновой кислоты - феруловой кислоты и витамина B₁ - тиамина.

Введенная в состав феруловая кислота обладает активным действием на ростовые процессы, выступая в качестве активатора ИУК-оксидазы или участвуя в ее биосинтезе. Феруловая кислота более дешевле, чем гетерауксины, что снижает себестоимость получения оздоровленных растений. Совместное использование в питательной среде феруловой кислоты и кинетина способствует более интенсивному стимулированию ростовых процессов, морфогенезу и приживаемости растений.

Экспериментально было установлено, что введение в питательную среду сахарозы в количестве 81000-85000 мг/л, феруловой кислоты в количестве 1-2 мг/л, кинетина в количестве 1-2 мг/л стимулирует процесс индукции микроклубнеобразования. Повышение содержания тиамина до 1,2 мг/л способствует более быстрому росту и здоровому развитию растению, более мощному развитию корневой системы, стимулирует ростовые процессы, влияет на обмен веществ в растении.

При использовании стеклянных банок с металлической крышкой с отверстием для внесения эксплантов, снижается себестоимость оздоровленных растений и микроклубней, увеличивается выход и размер микроклубней, упрощается способ размножения. Использование пробирок - дорогой, громоздкий, трудоемкий процесс, в результате микроклубни имеют меньшие размеры. Применение стеклянных банок с резьбой и металлической крышкой для культивирования растений-регенерантов и микроклубнеобразования экономически выгоднее контейнерной технологии, т.к. позволяет использовать банки многократно, подвергать их автоклавированию, в отличие от пластиковых контейнеров и громоздких пробирок. Себестоимость банок гораздо дешевле пробирок и пластиковых контейнеров.

Использование 0,1% раствора диацида с целью стерилизации выделенных этиолированных проростков в течение 3-5 мин с последующей трехкратной промывкой стерильной H₂O позволяет ингибировать развитие бактериальной и вирусной инфекции.

Пример 2. Осуществляется аналогично примеру 1, однако для питательной среды для клубнеобразования вносят 81000 мг/л сахарозы, 1 мг/л кинетина, 2 мг/л феруловой кислоты, 1,1 мг/л тиамина.

Пример 3. Осуществляется аналогично примеру 1, однако для питательной среды для клубнеобразования вносят 83000 мг/л сахарозы, 2 мг/л кинетина, 1,5 мг/л феруловой кислоты, 1,2 мг/л тиамина.

Совместное использование в питательной среде феруловой кислоты, кинетина и тиамина способствует более интенсивному стимулированию ростовых процессов, морфогенезу и приживаемости растений картофеля. Феруловая кислота более дешевле, чем гетерауксины, что снижает себестоимость получения оздоровленных растений. Использование стеклянных банок с резьбой и закручивающейся крышкой с отверстием для внесения питательной среды и черенков значительно снижает себестоимость оздоровленных растений и микроклубней, позволяет повысить производительность размножения оздоровленных высокопродуктивных растений картофеля, упрощает способ размножения, уменьшает затраты.

Предлагаемый способ прост в использовании, экологически безопасен и может быть использован на картофелевыращивающих предприятиях.

Картофель - вегетативно-размножаемая культура, относительно слабая по устойчивости к вирусам, важнейший продукт питания населения. Россия занимает одно из последних мест по урожайности культуры картофеля. Низкая урожайность связана с резкими температурными колебаниями, инфицированностью почвы возбудителями болезней и низким качеством семенного материала. Зараженность патогенами семенного материала является одной из основных причин снижения урожайности картофеля.

Известен способ микроклонального размножения картофеля, включающий культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем черенкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, сахарозу, Fe-хелат, глицерин, ИУК, агар-агар, витамины по Уайту, получение меристемных растений-регенерантов и высадку растений в грунт, при этом перед высадкой в грунт меристемные растения-регенеранты подвергаются ежесуточному воздействию температурой +4-+5°C в течение 2 ч продолжительностью 6-7 дней [патент RU №2487532 (13) С1, МПК А01Н 4/00, А01G 7/00, 20.07.2013 (аналог)].

Указанный технический результат достигается тем, что в способе микроклонального размножения картофеля, включающем стерилизацию питательной среды, культивирование растений картофеля in vitro путем микрочеренкования исходных растений на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, аскорбиновую кислоту, получение растений-регенерантов, получение микроклубней картофеля in vitro с использованием питательной среды, согласно заявляемому изобретению осуществляют предварительное оздоровление исходных растений картофеля от вирусной инфекции стерилизацией в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной H₂O, причем для культивирования оздоровленных растений и получения микроклубней картофеля используют питательную среду, содержащую дополнительно аденин 1-1,5 мг/л, кинетин 1-2 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) 0,5-1,5 мг/л, а тиамин, аскорбиновая кислота, Fe-хелат и сахароза берутся в следующей концентрации: 1-1,2 мг/л; 2,1-4 мг/л; 374-390 мг/л и 81000-85000 мг/л, получение микроклубней картофеля осуществляют при температуре 19-20°C, при условии светового дня 8 часов (5000 лк) и полной темноты 16 часов и относительной влажности воздуха 70-80%.

Стерилизацию питательной среды для культивирования оздоровленных растений и получения микроклубней картофеля осуществляют с использованием автоклавов в стеклянных банках с металлической герметичной крышкой и вырезанным отверстием в крышке для внесения эксплантов.

Способ осуществляют следующим образом.

Оздоровление картофеля от вирусной инфекции осуществлялось вычленением апикальных этиолированных проростков, разделением их на кусочки (1-1,5 см с одной почкой), стерилизацией в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной H₂O.

Использование 0,3%-ного раствора диацида с целью стерилизации выделенных этиолированных проростков в течение 3-5 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной H₂O позволяет полностью ингибировать развитие бактериальной и вирусной инфекции.

Экспериментально было доказано, что использование диацида менее 0,3%-ного раствора не позволяет полностью стерилизовать растительные экспланты от бактериальной и вирусной инфекции. Использование диацида более 0,3%-ного раствора приводит к частичному замедлению процессов регенерации или гибели растений.

После стерилизации растительных эксплантов из них вычленяют апикальные меристемы и вносят их на стерильную питательную среду (табл. 1), содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, сахарозу 20000 мг/л, кинетин 1-2 м г/л, ИУК 1-2 мг/л для морфогенеза и образования меристемных оздоровленных растений-регенерантов.

Питательная среда в контрольном варианте готовилась по прототипу, в опытном - с добавлением 374-390 мг/л Fe-хелата, 0,5-1,5 мг/л ИУК, 1-2 мг/л кинетина, 1-1,5 мг/л аденина, 1,0-1,2 мг/л тиамина, 2,1-4 аскорбиновой кислоты, 81000-85000 мг/л сахарозы.

Для культивирования растений-регенерантов используют стеклянные банки с металлической герметичной крышкой, с вырезанным отверстием в крышке для внесения эксплантов, которые выдерживают условия автоклавирования. После внесения в банку питательной среды отверстие закрывают ватно-марлевой пробкой и обворачивают фольгой, помещают в медицинские бюксы и автоклавируют 20 мин при давлении 1 атм и температуре 120°C.

При использовании стеклянных банок с металлической крышкой и отверстием для внесения эксплантов снижается себестоимость оздоровленных растений и микроклубней, увеличивается выход и размер микроклубней, упрощается способ размножения. Следует отметить, что использование пробирок - дорогой, громоздкий, трудоемкий процесс, а микроклубни, полученные в пробирках, имеют меньшие размеры и менее жизнеспособны.

Также следует отметить, что применение стеклянных банок с металлической крышкой для культивирования растений-регенерантов и микроклубнеобразования экономически выгоднее контейнерной технологии, т.к. позволяет использовать банки многократно, подвергать их автоклавированию, в отличие от пластиковых контейнеров и громоздких пробирок. Себестоимость стеклянных банок гораздо дешевле пробирок и пластиковых контейнеров.

Размножение оздоровленных растений-регенерантов проводили микрочеренкованием in vitro в условиях ламинар-бокса. Микрочеренки помещали в стерильные стеклянные банки со стерильной питательной средой, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, агар-агар, витамины: тиамин 1-1,2 мг/л и аскорбиновую кислоту 2,1-4 мг/л; Fe-хелат 374-390 мг/л, сахарозу 81000-85000 мг/л, аденин 1-1,5 мг/л, кинетин 1-2 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) 0,5-1,5 мг/л.

Повышение содержания витаминов тиамина до 1-1,2 мг/л и аскорбиновой кислоты 2,1-4 мг/л способствует более интенсивному росту и здоровому развитию растения, более мощному развитию корневой системы, стимулированию ростовых процессов, влиянию на обмен веществ в растении.

В результате проведенных исследований установлено, что повышение содержания эссенциального элемента Fe-хелат с 374 до 390 мг/л оказывает положительное влияние на процессы фотосинтеза и дыхание растений картофеля, т.к. элементы Fe-хелат являются переносчиками электронов, а как кофактор Fe-хелат у растений картофеля входит в состав многих антиоксидантных ферментов (Fe-супероксиддисмутаза, пероксидазы, каталаза).

Введенный в состав питательной среды аденин - аминопроизводное пурина - содержится в ферментах и коферментах растений картофеля, очень важен для клеток растений как составляющая нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), и в культуре тканей имеет цитокининовый эффект, т.е. стимулирует образование побегов растений (дифференциацию), резко усиливает процессы клеточного деления (цитокинез), повышает интенсивность фотосинтеза у растений картофеля, а также участвует во многих физиологических процессах.

Комплексное использование в питательной среде ИУК, аденина и кинетина и взаимовлияние их друг на друга способствует более интенсивному стимулированию ростовых процессов, ризогенезу, геморизогенезу, морфогенезу и приживаемости растений. Учитывая, что соотношение ауксинов к цитокининам является ключевым фактором деления клеток и дифференцировки тканей растения картофеля, поэтому экспериментальным путем было установлено оптимальное соотношение и концентрации внесения в питательную среду ауксинов и цитокининов (ИУК 0,5-1,5 мг/л, аденина 1-1,5 мг/л и кинетина1-2 мг/л).

На следующем этапе банки с черенками подписывали и выставляли на стеллажи с освещением 5000-лк люминесцентными лампами при фотопериоде: 16-часовом освещении (день) и 8 часов полной темноты (ночь), при температуре 22-25°C, влажности воздуха 70% для дальнейшего получения растений-регенерантов, которые могут быть реализованы для высадке в грунт.

Для получения микроклубней картофеля использовали ту же питательную среду, которая использовалась выше для микрочеренкования, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, агар-агар, витамины: тиамин 1-1,2 мг/л и аскорбиновую кислоту 2,1-4 мг/л; Fe-хелат 374-390 мг/л, сахарозу 81000-85000 мг/л, аденин 1-1,5 мг/л, кинетин 1-2 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) 0,5-1,5 мг/л, однако режимы культивирования были следующие: 8 часов освещения (5000-7000 лк), 16 часов полной темноты, при пониженной температуре 19-20°C и относительной влажности воздуха 70-80%.

Полученные микроклубни отделяли от растений и переносили в условия пониженных температур (4±2)°C на 2-3 месяца для дальнейшей реализации или высадки в грунт.

Полученные предлагаемым способом оздоровленные микроклубни картофеля были физиологически зрелыми, хорошо хранились и при последующем выращивании in vivo формировали здоровые растения. Предлагаемый способ прост в использовании, экологически безопасен и может быть использован на картофелевыращивающих предприятиях.

Пример 1. Оздоровление картофеля от вирусной инфекции осуществлялось вычленением апикальных этиолированных проростков исходных растений, разделением их на кусочки (1-1,5 см с одной почкой), стерилизацией в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут, с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной H₂O.

После стерилизации растительных эксплантов из них вычленяют апикальные меристемы и вносят их на стерильную питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, сахарозу 20000 мг/л, кинетин 1,5 мг/л, ИУК 1,5 мг/л для морфогенеза и образования меристемных оздоровленных растений-регенерантов.

Для культивирования растений-регенерантов используют стерильные стеклянные банки с металлической герметичной крышкой и вырезанным отверстием в крышке для внесения эксплантов. После внесения оздоровленных эксплантов в стерильную банку со стерильной питательной средой отверстие закрывают ватно-марлевой пробкой, банки с эксплантами подписывают и выставляют на стеллажи с освещением 5000-лк люминесцентными лампами при фотопериоде: 16-часовом освещении (день) и 8 часов полной темноты (ночь), при температуре 22-25°C, влажности воздуха 70% для дальнейшего получения растений-регенерантов. Полученные растения-регенеранты, имеющие 12-15 листьев, извлекают из банок и черенкуют в условиях ламинар-бокса, и черенки помещают в стерильные банки со стерильной питательной средой, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, агар-агар, тиамин 1,2 мг/л, аскорбиновую кислоту 3 мг/л; Fe-хелат 380 мг/л, сахарозу 85000 мг/л, аденин 1,5 мг/л, кинетин 2 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) 1,5 мг/л.

На следующем этапе банки с черенками подписывают и выставляют на стеллажи с освещением 5000-лк люминесцентными лампами при фотопериоде: 16-часовом освещении (день) и 8 часов полной темноты (ночь), при температуре 22-25°C, влажности воздуха 70% для дальнейшего получения растений-регенерантов, которые могут быть реализованы для высадки в грунт.

Для получения микроклубней картофеля использовали ту же питательную среду, что и для микрочеренкования при условиях культивирования: 8 часов освещения (5000-7000 лк), 16 часов полной темноты, при пониженной температуре 19-20°C и относительной влажности воздуха 70-80%.

Полученные микроклубни отделяют от растений и переносят в условия пониженных температур (4±2)°C на 2-3 месяца для дальнейшей реализации или высадке в грунт.

По окончании культивирования микроклубни отделяются и направляются на реализацию потребителям для высадки семенного картофеля в грунт или переносятся на хранение в холодильные камеры при температуре (4±2)°C сроком на 2-3 месяца до момента реализации.

Пример 2. Осуществляется аналогично примеру 1 за исключением того, что для культивирования оздоровленных растений и получения микроклубней картофеля используется питательная среда, содержащая компоненты в следующем количестве: тиамин 1,0 мг/л, аскорбиновую кислоту 4 мг/л; Fe-хелат 390 мг/л, сахарозу 84000 мг/л, аденин 1,0 мг/л, кинетин 1,5 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) 1,0 мг/л.

Пример 3. Осуществляется аналогично примеру 1 за исключением того, что для культивирования оздоровленных растений и получения микроклубней картофеля используется питательная среда, содержащая компоненты в следующем количестве: тиамин 1,1 мг/л, аскорбиновую кислоту 2,5 мг/л; Fe-хелат 375 мг/л, сахарозу 82000 мг/л, аденин 1,3 мг/л, кинетин 1,0 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) 0,5 мг/л.

Реферат патента 2017 года СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO СОРТА КАРТОФЕЛЯ АЛЕНА

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ микроклонального размножения картофеля, при котором выделяют апикальные этиолированные проростки (1-1,5 см), стерилизуют в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной H₂O, культивируют меристемы, получают оздоровленные растения, проводят микрочеренкование, черенки вносят в стеклянные банки с металлической крышкой. Для микрочеренкования и образования микроклубней в питательную среду дополнительно вносят тиамин 1-1,2 мг/л, аскорбиновую кислоту 2,1-4 мг/л, Fe-хелат 374-390 мг/л, сахарозу 81000-85000 мг/л, аденин 1-1,5 мг/л, кинетин 1-2 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) 0,5-1,5 мг/л, получение микроклубней картофеля осуществляют при температуре 19-20°C, при условии светового дня 8 часов (5000 лк) и полной темноты 16 часов при относительной влажности воздуха 70-80%. Полученные микроклубни отделяют от растений и переносят в условия пониженных температур (4±2)°C на 2-3 месяца для дальнейшей реализации или высадки в грунт. Изобретение позволяет возродить и получить в короткие сроки оздоровленный сибирский сорт картофеля “Алена”, повысить коэффициент размножения растений-регенерантов, размер и количество микроклубней, ускорить рост эксплантов, обеспечить техническую простоту культивирования и снизить трудоемкость работы. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.

Формула изобретения RU 2 637 361 C1

1. Способ микроклонального размножения картофеля, включающий стерилизацию питательной среды, культивирование растений картофеля in vitro путем микрочеренкования исходных растений на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, аскорбиновую кислоту, получение растений-регенерантов, получение микроклубней картофеля in vitro с использованием питательной среды, отличающийся тем, что осуществляют предварительное оздоровление исходных растений картофеля от вирусной инфекции стерилизацией в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут, с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной H₂O, причем для культивирования оздоровленных растений и получения микроклубней картофеля используют питательную среду, содержащую дополнительно аденин 1-1,5 мг/л, кинетин 1-2 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) 0,5-1,5 мг/л, а тиамин, аскорбиновая кислота, Fe-хелат и сахароза берутся в следующей концентрации: 1-1,2 мг/л; 2,1-4 мг/л; 374-390 мг/л и 81000-85000 мг/л, получение микроклубней картофеля осуществляют при температуре 19-20°C при условии светового дня 8 часов (5000 лк) и полной темноты 16 часов и относительной влажности воздуха 70-80%.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стерилизацию питательной среды для культивирования оздоровленных растений и получения микроклубней картофеля осуществляют с использованием автоклавов в стеклянных банках с металлической герметичной крышкой и вырезанным отверстием в крышке для внесения эксплантов.

Простая и недорогая методика позволяет развивающимся странам производить здоровые семенные клубни, необходимые фермерам для устойчивого выращивания картофеля.

Ключевые положения

Заболевания картофеля могут существенно снизить его урожайность и качество клубней.

Выращивание культуры ткани in vitro, используемое для производства безвирусного семенного картофеля, требует дорогостоящих методик и наличия высококвалифицированного персонала.

Недорогой альтернативой является размножение ростков в нестерильных условиях с использованием проростков – небольших частей побега с узлом, пазушной почкой или других небольших участков побега.

Эти черенки легко приживаются и порождают ростки также эффективно, как и при размножении in vitro. Каждый проросток может произвести до 100 000 клонов в течение шести месяцев.

Картофель восприимчив ко множеству заболеваний, снижающих его урожайность и качество клубней. Более того, в клонах картофеля и в почве, в которой они выращиваются, накапливаются патогены. Поэтому производство болезнеустойчивого картофеля зависит от наличия постоянно обновляемого запаса безвирусного семенного материала.

После сбора урожая микроклубни должны храниться при низких температурах. Спустя 45 дней и в течение последующих семи месяцев они могут быть помещены в более теплую среду для стимулирования прорастания. Из микроклубней выращивают безвирусный семенной картофель обычного размера, который может использоваться фермерами. (По мере роста растениям требуется защита от насекомых-вредителей с целью избежания новых инфекционных заболеваний.)

Недорогая альтернатива: микрочеренкование

Хотя указанный выше процесс позволяет производить здоровый семенной картофель, микроклональное размножение ростков является дорогостоящей и сложной технологией, требующей наличия квалифицированного персонала. Многие развивающиеся страны нуждаются в более простых и дешевых методах размножения растений. ФАО предлагает многообещающую недорогую альтернативу: микрочеренкование, или использование небольших частей побега с узлом, пазушной почкой и других небольших участков побега длиной около 1,5 см, которые могут выращиваться для производства ростков в коммерческих масштабах.

Культура ткани и микроклональное размножение

Первоначальные методы культуры ткани были разработаны в 1950-х годах, а микроклональное размножение используется в коммерческих масштабах для увеличения запасов семенного материала с конца 1960-х годов. Ежегодный объем растений, полученных путем микроклонального размножения из тканевых культур, оценивается в сотни миллионов и содержит десятки тысяч видов. Как правило, растениями, полученными путем микроклонального размножения, являются цветы, клубника, декоративный кустарник и деревья лесных массивов.

Исходным растительным материалом является небольшое количество безвирусных ростков, произведенных путем микроклонального размножения, которые в таких регионах, как страны Африки южнее Сахары, часто импортируются из развитых стран. Однако их размножение происходит не в условиях in vitro, а in vivo (то есть в нестерильных природных условиях). Проростки размножаются в оранжерее или затененной теплице в смеси торфа и песка (или другой корневой среде) в пластиковых лотках на металлических стеллажах.

Данная технология пользуется преимуществом этиоляции, то есть выращивания ростков в условиях низкого уровня освещения. Этиолированные растения сохраняют свои ювенильные свойства и производят новые ростки для последующего размножения, которые легко приживаются. Кроме того, растения остаются небольшого размера, что позволяет выращивать большое количество растений в ограниченном пространстве; каждый лоток может содержать до 500 проростков на квадратный метр. В течение трех недель проростки дают новые ростки, которые являются источником новых проростков. В течение шести месяцев отдельный проросток может произвести до 100 000 клонов.

После размножения растительного материала до необходимого количества ростки могут быть перемещены в среду, свободную от насекомых-вредителей (в теплицу или на открытое затененное поле). Высаженные в глубокий грунт ростки легко приживаются за неделю, вырастают в абсолютно нормальные растения картофеля и производят микроклубни.

Данная методика позволяет производить ростки аналогично размножению в условиях in vitro с меньшими затратами. Однако очень важно хранить исходный безвирусный растительный материал в условиях in vitro и соблюдать все стандартные фитосанитарные меры в процессе размножения.

Необходимость согласования сроков

Методика микрочеренкования подходит развивающимся странам, которым требуется простой и недорогостоящий способ размножения семенного картофеля. Однако производство исходного растительного материала хорошего качества является лишь одним элементом процесса производства семенного картофеля. Схемы получения семенного картофеля могут потерпеть неудачу, так как процессы размножения проростков и хранения микроклубней могут быть несогласованы с календарем фермерских сельскохозяйственных работ. Если полевая стадия и стадия хранения не будут надлежащим образом спланированы и реализованы, преимущества микроклонального размножения могут быть утрачены.

Информация предоставлена Отделом растениеводства и защиты растений ФАО. Международный центр картофеля (СIP) также внес вклад.

Читайте также: