Для первичного посева коринебактерий дифтерии используют

Обновлено: 05.10.2024

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Дифтерия: причины, симптомы, диагностика и способы лечения.

Дифтерия – одна из самых грозных инфекций, представляющая высокий риск для жизни пациента. Не случайно первая Нобелевская премия по физиологии и медицине была присуждена в 1901 г. Э.А. Берингу за разработку лечебной сыворотки против этого заболевания.

Несмотря на то, что многие считают дифтерию исключительно детской болезнью, она встречается и у взрослых.

Источником инфекции является больной или бактерионоситель, возбудитель передается воздушно-капельным, контактно-бытовым и пищевым путями.

Дифтерия – бактериальная инфекция, возбудителем которой является Corynebacterium diphtheriae (дифтерийная палочка, или бацилла Леффлера).

Этот микроорганизм обладает высокой устойчивостью к воздействию факторов окружающей среды. Это необходимо знать и учитывать при проведении дезинфекции в очаге распространения.

Отрицательное воздействие на С. diphtheriae оказывают прямые солнечные лучи, высокая температура и некоторые химические вещества (дезинфектанты).

Распространение токсина по организму приводит к поражению органов и систем, среди которых наиболее часто страдают сердце, надпочечники, почки и нервные волокна.

Характерным признаком болезни является образование плотных серовато-белых фибриновых пленок на слизистых ротоглотки. Дифтерийный налет покрывает миндалины, а также глотку и гортань, что вызывает сужение их просвета и нарушает прохождение воздуха в нижележащие дыхательные пути. Закупорка дыхательных путей пленкой и отек могут привести к развитию крупа, особенно у детей раннего возраста.

Классификация форм заболевания

Проявления заболевания могут быть связаны с местом проникновения бактерий в организм: дифтерия ротоглотки, гортани, носа, глаз, половых органов, ран и т. д. В зависимости от распространенности поражения выделяют локализованную, распространенную, комбинированную, а также токсическую формы болезни. Токсическая форма протекает тяжелее остальных и характеризуется поражением внутренних органов.

Дифтерия различается по степени тяжести: легкая, среднетяжелая и тяжелая, которая, в свою очередь, также подразделяется на три степени. Для этого заболевания, особенно при тяжелом течеении, характерно развитие осложнений, присоединение вторичной инфекции, а также обострение хронических заболеваний.

Симптомы дифтерии

Наиболее часто встречается дифтерия ротоглотки и гортани. Большинство форм дифтерии сопровождаются лихорадкой (повышением температуры тела с ознобом), отеком и некрозом слизистой оболочки миндалин, увеличением лимфоузлов.

Дифтерия ротоглотки отличается появлением на небных миндалинах пленок беловато-серого цвета, которые могут распространяться на нёбные дужки, язычок, нёбо.

Ощущается болезненность во время глотания. При попытке снять пленки обнажается кровоточащая слизистая. Для дифтерии ротоглотки, особенно у непривитых пациентов, характерно развитие осложнений.

В отличие от дифтерии ротоглотки, при дифтерии гортани (истинном крупе) токсическое поражение внутренних органов нетипично. Опасность в данном случае представляют легко отслаивающиеся от слизистой фибриновые пленки, которые приводят к сужению дыхательных путей вплоть до полной их закупорки и развития асфиксии (удушья).

Необходимо различать истинный круп при дифтерии и ложный круп при острой респираторной вирусной инфекции.

Для истинного крупа характерно постепенное ухудшение состояния больного, появление лающего кашля с изменением голоса иногда до полной афонии. Приступы ложного крупа можно облегчить ингаляциями с глюкокортикостероидными препаратами, что, к сожалению, не действенно при дифтерийном крупе.

Диагностика

Диагностика дифтерии начинается со сбора жалоб, истории заболевания, клинического осмотра пациента.

Врачу важно знать, есть ли у ребенка прививки от дифтерии, а также есть ли в его окружении больные с подозрением на дифтерию.

Основным методом лабораторной диагностики дифтерии является бактериологическое исследование (посев) мазка из зева.

Микробиологическое исследование, позволяющее выявить возбудителя дифтерии (C. diphtheriae) в исследуемом биоматериале и подтвердить диагноз дифтерии.

Микробиологическое исследование, позволяющее выявить возбудителя дифтерии (C. diphtheriae) в исследуемом биоматериале.

Синонимы русские

Посев на бациллы Леффлера, посев на BL, посев на дифтерийную палочку.

Синонимы английские

Corynebacterium diphtheriae сulture, Diphtheria сulture.

Метод исследования

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Мазок из зева и носа.

Как правильно к исследованию?

Подготовки не требуется.

Общая информация об исследовании

Corynebacterium diphtheriae (бациллы Леффлера) – это грамположительные бактерии рода Corynebacterium, являющиеся возбудителями дифтерии и способные к выработке дифтерийного токсина. Заболевание передается воздушно-капельным путем, источником инфекции являются больные люди или бактерионосители.

Инкубационный период составляет в среднем 2-5 дней. Происходит фибринозное воспаление слизистых оболочек ротоглотки и дыхательных путей с формированием псевдомембран и с симптомами общей интоксикации.

При токсической форме дифтерии также может поражаться сердце и нервная система. В некоторых случаях возможно бессимптомное носительство.

Для чего используется исследование?

Когда назначается исследование?

При подозрении на дифтерию.
Когда известно, что пациент контактировал с больными дифтерией.
После проведения антибактериальной терапии – не менее чем через 2 недели после окончания курса антибиотиков.
В некоторых случаях перед госпитализацией в стационар (с профилактической целью).

Что означают результаты?

Референсные значения: нет роста.

Причины положительного результата

Дифтерия или бессимптомное носительство C. diphtheriae.

Причины отрицательного результата

Отсутствие дифтерии. Исключение составляют случаи, когда на момент исследования проводилось лечение антибиотиками.

Что может влиять на результат?

Предшествующая антибактериальная терапия.

Важные замечания

Также рекомендуется

Кто назначает исследование?

Инфекционист, терапевт, врач общей практики, педиатр, ЛОР.

Литература

Macgregor R.R. Corynebacterium diphtheriae. In: Principles and practice of infectious disease / G.L. Mandell, Bennett J.E., Dolin R (Eds) ; 6th ed. – Churchill Livingstone, Philadelphia, PA 2005. – 2701 p.
Efstratiou A. Laboratory guidelines for the diagnosis of infections caused by Corynebacterium diphtheriae and C. ulceran / A. Efstratiou, R.C. Georg // Communicable disease and public health. – 1999. – Vol. 2, № 4. – P. 250–257.
Current approaches to the laboratory diagnosis of diphtheria / A. Efstratiou [et al.] // J. Infect. Dis. – 2000. – Vol. 181 (Suppl 1). – P. S138–S145.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции

1. РАЗРАБОТАНЫ Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е.Б.Ежлова, А.А.Мельникова, Н.А.Кошкина); ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (М.В.Зароченцев, И.В.Новокшонова); ФБУН "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского" Роспотребнадзора (И.К.Мазурова, О.Ю.Борисова, С.Ю.Комбарова, В.Г.Мельников, Н.М.Максимова, Т.Н.Якимова); ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г.Москве" Роспотребнадзора (Н.Я.Салова, И.П.Требунских).

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 года N 1).

3. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 14 июля 2013 г.

1. Область применения

Методические указания (далее - МУ) предназначены для специалистов бактериологических лабораторий санитарно-эпидемиологической службы, лечебно-профилактических организаций независимо от их организационно-правовой формы и формы собственности и научно-исследовательских институтов, осуществляющих лабораторную диагностику дифтерийной инфекции.

2. Общие положения. Сущность метода

Бактериологическое исследование проводят с целью лабораторной диагностики дифтерийной инфекции, выявления источников инфекции, подтверждения эпидемиологических связей и наблюдения за распространением токсигенных коринебактерий дифтерии. Цель бактериологического исследования - выявление возбудителя дифтерии с помощью минимального количества диагностических тестов, необходимых, достаточных и специфичных для получения достоверного ответа в максимально сжатые сроки: не менее трёх суток - отрицательный ответ, трёх-четырёх суток - ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии (возбудителя дифтерии), четырёх-пяти суток - ответ о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии или других представителей этого рода.

Возбудитель дифтерии - коринебактерии дифтерии (Corynebacterium diphtheriae), продуцирующие дифтерийный токсин (экзотоксин). Источником инфекции является больной или бактерионоситель токсигенных С.diphtheriae.

Нетоксигенные С.diphtheriae не вызывают дифтерийную инфекцию. "Этиологическая" значимость этих микроорганизмов при фарингите, артрите, эндокардите и др. гнойно-септических заболеваниях требует специальных доказательств. При выделении нетоксигенных штаммов C.diphtheriae от больных с подозрением на дифтерийную инфекцию следует обратить внимание на правильность проведения бактериологического исследования и оценку токсигенных свойств.

Способность С.diphtheriae вырабатывать экзотоксин опосредован феноменом фаговой (или лизогенной) конверсии. Конверсию нетоксигенных штаммов С.diphtheriae в токсигенные и наоборот можно воспроизвести в особых экспериментальных (лабораторных) условиях. В тех случаях, когда при первичном посеве исследуемого материала от больных дифтерией или бактерионосителей выделяют токсигенные, а при повторных обследованиях после лечения антибиотиками - нетоксигенные коринебактерии дифтерии, можно предположить, что токсигенные и нетоксигенные С.diphtheriae колонизировали слизистые ротоглотки и носа одновременно. При лечении антибиотиками в первую очередь исчезают токсигенные штаммы, как более чувствительные к их действию, а нетоксигенные штаммы продолжают выделяться. Обнаружение только нетоксигенных штаммов у бактерионосителей при повторных обследованиях после лечения нельзя трактовать как утрату способности токсигенных штаммов продуцировать экзотоксин.

Таксономически близкими к виду C.diphtheriae являются Corynebacterium ulcerans и Corynebacterium pseudotuberculosis - природные патогены крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, домашних животных, способные вырабатывать дифтериеподобный экзотоксин, в редких случаях могут вызывать заболевания у человека.

Известны случаи выделения токсигенных C.ulcerans при клинической картине заболевания, сходной с дифтерией, а также токсигенных C.pseudotuberculosis, вызывающих лимфадениты. Инфекции, вызванные этими микроорганизмами, у человека встречаются крайне редко, не имеют эпидемического распространения, а, следовательно, значение этих случаев в медицине невелико.

На слизистых оболочках ротоглотки и носа в норме часто встречается Corynebacterium pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийная палочка Гофмана). Умение выделять и идентифицировать данные микроорганизмы, а также нетоксигенные C.diphtheriae служит критерием оценки качества работы бактериологов, особенно в период снижения и спорадической заболеваемости дифтерией.

C.diphthereiae растут на питательных средах, сбалансированных по своему составу, и не растут на простых питательных средах. Требуется кровь любого животного или человека (донора), как источник аминокислот, ростовых факторов, железа и пр. Не всегда коммерческие среды удовлетворяют этим требованиям, поэтому контроль качества питательных сред и всех ингредиентов в лабораториях обязателен.

Кровяные теллуритовые среды (КТА, Клауберг II) остаются лучшими селективными дифференциально-диагностическими средами, обеспечивающими рост колоний через 24 ч, что на одни сутки сокращает сроки выдачи окончательного бактериологического ответа. КТА прост в приготовлении: основой этой среды является коммерческий сухой питательный агар (СПА), в качестве кровяных добавок используют кровь, однако не исключены любые гемолизированные кровяные добавки.

Трудоемкость бактериологического метода и стоимость анализа сокращается при использовании двух половин одной чашки с селективной дифференциально-диагностической питательной средой (далее плотная питательная среда) для посева материала из зева и носа от одного обследуемого. Использование чашки для посева таких образцов на плотной питательной среде недопустимо, так как не позволяет, в большинстве случаев, получить рост изолированных колоний и провести исследование в установленные сроки.

Посев материала из зева и носа на кровяной агар производить нецелесообразно, так как очень сложно получить рост изолированных колоний C.diphtheriae на данной среде из-за обильного роста другой сопутствующей микрофлоры.

Колонии, морфология которых характерна для микроорганизмов рода Corynebacterium, в подавляющем большинстве не подлежат микроскопии и должны быть изучены по всем необходимым идентификационным тестам. "Сомнительные" колонии с нехарактерными морфологическими свойствами подвергают микроскопии. Если в мазках обнаруживают коринеформные микроорганизмы, исследование следует продолжить по всем необходимым идентификационным тестам.

Окрашивание мазков осуществляют по Лёффлеру (щелочной метиленовый синий) или с использованием других синих красителей. Окраску по Граму не применяют, т.к. в процессе окраски клетки грамположительных C.diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и могут выглядеть грамотрицательными (розовый оттенок). Чаще всего это явление наблюдают при окрашивании токсигенных C.diphtheriae (клеточная стенка токсигенных C.diphtheriae ближе по организации и структуре к грамотрицательным микроорганизмам).

В бактериологической практике опираться только на морфологические свойства микробной клетки или колоний при идентификации C.diphtheriae недостаточно. Описаны случаи бактериологической гипо- и гипердиагностики (в 55,0 и 14,5% случаев соответственно), когда использовали учет только морфологических признаков.

При идентификации C.diphtheriae необходим комплекс идентификационных тестов. Основной специфический тест для выявления возбудителя дифтерии, правильная постановка которого является залогом успешной диагностики дифтерийной инфекции, - определение у выделенной культуры способности к продукции дифтерийного токсина. Определять продукцию токсина следует начинать уже в первый день появления роста изолированных колоний на чашках с плотной питательной средой, исключая этап накопления чистой культуры. Несоблюдение этого правила увеличивает сроки исследования на одни сутки.

Во избежание ошибок при определении токсигенных свойств коринебактерий необходимо изучать данный признак у максимального числа выросших колоний (двадцать и более) с чашек первичного посева. При множественном росте подозрительных колоний нельзя ограничиться формированием только одной-двух бляшек. Кроме того, необходимо изучать токсигенные свойства отдельных изолированных колоний, чтобы не потерять нетоксигенные штаммы C.diphtheriae, присутствие которых также возможно при наличии токсигенных C.diphtheriae в патологическом материале.

Используют два способа постановки пробы на токсигенность:

1) модифицированная проба Элека с бумажными полосками, утверждённая для бактериологической практики в нашей стране в 1961 г.;

2) проба Фельдмана Ю.Г. и соавторов с бумажными дисками, разработанная в нашей стране и утвержденная в 1988 г., получившая одобрение Международной рабочей группы ВОЗ по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции к применению в зарубежных лабораториях.

В пробе на токсигенность следует использовать только антитоксин - противодифтерийные антитоксические антитела, очищенные методом специфической сорбции, что позволяет избежать появления неспецифических линий преципитации микробного происхождения. В исключительных случаях при отсутствии антитоксина допускается использование лечебной противодифтерийной антитоксической лошадиной сыворотки. В таком случае возможно появление неспецифических линий преципитации микробного происхождения, которые необходимо отличить от специфических линий токсического происхождения.

Обязательными являются биохимические тесты - на цистиназу, уреазу, расщепление глюкозы, сахарозы и крахмала. Тест на нитраты проводят только при положительной уреазной реакции. Использование других тестов, применяемых в некоторых зарубежных странах, необоснованно увеличивает продолжительность, трудоемкость, стоимость исследования и не всегда приводит к точной идентификации "недифтерийных" микроорганизмов (других представителей рода Corynebacterium). При лабораторной диагностике дифтерии не является обязательным определение видовой принадлежности "недифтерийных" коринебактерий рода Corynebacterium, тем более что их идентификация требует отдельных хемотаксономических и молекулярно-генетических методов исследования.

C.diphtheriae подразделяют на культурально-биохимические варианты (биовары) gravis, mitis, intermedius, belfanti. В бактериологической практике определению подлежат биовар gravis и объединенная группа "митисных форм" - mitis, intermedius, belfanti, т.е. группа микроорганизмов C.diphtheriae, которая не обладает амилазной активностью (не разлагает крахмал). Биовар belfanti не подлежит отдельному определению, так как этот микроорганизм не способен продуцировать экзотоксин. В бактериологической диагностике отдельного выделения биовара intermedius так же не требуется, так как относительно условными дифференцирующими признаками от биовара mitis являются только размер колоний и наличие липофильности. Таким образом, в бактериологической диагностике определяются токсигенные и биохимические свойства C.diphtheriae биовара gravis и группы микроорганизмов, у которых отсутствует амилазная активность, объединённые в группу C.diphtheriae биовар mitis.

Молекулярно-генетические методы для лабораторного выявления C.diphtheriae находятся в стадии разработки. Имеющиеся тест-системы для метода ПЦР не могут различить ген дифтерийного токсина токсигенных штаммов от "молчащего" гена дифтерийного токсина нетоксигенных токснесущих штаммов C.diphtheriae, не способных продуцировать токсин из-за мутаций в этом гене. Это может привести к гипердиагностике. Поэтому их использование в лабораторной диагностике дифтерии может иметь только вспомогательное значение - поиск нетоксигенных токснесущих штаммов C.diphtheriae среди нетоксигенных штаммов.

3. Характеристика возбудителя дифтерийной инфекции

Род Corynebacterium гетерогенный, как и группа, условно объединившая его и другие роды грамположительных палочек, не образующих споры размером 0,3-0,81,5-8,0 мкм, неподвижных, обладающих различной степенью полиморфизма и плеоморфизма. C.diphtheriae имеют размер 0,2-0,61,0-7,0 мкм. Арабиногалактановый полимер клеточной стенки C.diphtheriae отличает этот вид от всех других видов рода Corynebacterium. Клеточная стенка С. diphtheriae имеет от 3-5 до 7-9 слоёв. Известно, что клеточная стенка токсигенных C.diphtheriae лучше дифференцирована и более тонкая по сравнению с клеточной стенкой нетоксигенных C.diphtheriae и других коринеформных микроорганизмов этого рода, что определяет их отношение к антибиотикам - токсигенные более чувствительны, чем нетоксигенные к пенициллину, эритромицину, тетрациклину и макролидам. Однако появляются штаммы C.diphtheriae устойчивые к некоторым антибиотикам, преимущественно выделенные от бактерионосителей.

Патогенные для животных Corynebacterium ulcerans и Corynebacterium pseudotuberculosis, некоторые комменсалы кожи со слизистых оболочек человека, например, Corynebacterium pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийная палочка Гофмана), Corynebacterium xerosis, Corynebacterium striatum таксономически близки к виду C.diphtheriae.

Большинство видов лучше растет в аэробных условиях, в том числе и микроорганизмы вида C.diphtheriae. Вместе с тем, C.diphtheriae являются факультативными анаэробами (генерируют энергию, используя как молекулярный О, так и органические соединения), что крайне важно учитывать при изучении их ферментативной активности.

Все коринебактерии, в т.ч. и C.diphtheriae, являются мезофилами и растут при 36-37 °С.

Устойчивость к факторам внешней среды

Культурально-морфологические свойства

Обычно колонии микроорганизмов из рода Corynebacterium на плотных питательных средах (например, на кровяном агаре) имеют серовато-белую или желтую окраску, непрозрачные или полупрозрачные, приподнятые, округлой формы, диаметром 1-3 мм. Чаще всего они бывают мягкой, маслянистой консистенции, хотя некоторые виды рода Corynebacterium могут образовывать шероховатые R-колонии и крошиться при прикосновении. На питательных средах, сбалансированных по своему составу и удовлетворяющих требованиям культивирования C.diphtheriae, через 24-48 ч роста вариант mitis образует колонии S-типа - приподнятые, гладкие, диаметром 1-2 мм; S-R-колонии варианта gravis обычно выпуклые, с приподнятым центром, диаметром 2-3 мм; колонии варианта intermedius - S-типа, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, диаметром 0,5-1 мм.

На селективных дифференциально-диагностических средах - кровяной теллуритовый агар (КТА) и Клауберг II через 24-48 ч роста колонии C.diphtheriae варианта gravis имеют серо-черную или черную окраску с металлическим оттенком ("цвет мокрого асфальта"), непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, округлой формы, диаметром 1-3 мм, имеют радиальную исчерченность (форма "маргаритки") или выраженную краевую изрезанность, часто крошатся при прикосновении; колонии C.diphtheriae варианта mitis имеют серо-черную или черную окраску ("цвет мокрого асфальта"), непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, иногда плоские, округлой формы, диаметром 1-2 мм, чаще всего бывают мягкой, маслянистой консистенции или могут крошиться при прикосновении; колонии C.diphtheriae варианта intermedius имеют серо-черную окраску, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, диаметром 0,5-1,0 мм, мягкой, маслянистой консистенции.

Морфология колоний C.ulcerans и C.pseudotuberculosis на КТА через 24-48 ч роста идентична морфологии колоний С.diphtheriae варианта gravis, серо-черной или черной окраски ("цвет мокрого асфальта"), иногда с коричневым оттенком, колонии непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, округлой формы с радиальной исчерченностью (или без неё), диаметром 1-2 мм. Колонии C.pseudodiphtheriticum - серого цвета с характерным светлым ободком, непрозрачные, приподнятые, матовые, округлой формы, диаметром 1-2 мм.

На теллуритовой среде без крови (коринебакагар) колонии C.diphtheriae через 24 ч роста мелкие (иногда 0,2-0,6 мм), через 48 ч роста размер колоний увеличивается до 1,0-1,2 мм, иногда наблюдаются "гигантские" колонии. Однако морфология колоний изменяется - исчезает исчерченность края, к 48 ч колонии меняют характерную для C.diphtheriae архитектонику - плоские, "расползающиеся" по поверхности агара, иногда меняется цвет колоний.

Помимо относительно условной оценки морфологии колоний на питательной среде первичного посева существует несколько других признаков, позволяющих различать биовары gravis, mitis, intermedius. Например, характерный рост на бульоне в пробирке: для биовара gravis - поверхностная пленка, бульон прозрачен, на дне пробирки через 24 ч организуется осадок; для биовара mitis - диффузное помутнение среды с образованием осадка, для биовара intermedius - тонкое гранулярное помутнение с последующим оседанием гранул на дно пробирки.

На кровяном агаре можно наблюдать гемолиз эритроцитов (кроличьих и крупного рогатого скота) при росте биовара mitis, гемолиз только кроличьих эритроцитов при росте биовара gravis и отсутствие гемолиза при росте биовара intermedius. Однако только биовар intermedius обладает липофильностыо - способностью усиливать рост на среде с 0,3% твина - 80.

Дифтерию вызывают токсигенные штаммы Corynebacterium diphtheriae или палочки Леффлера, не токсигенные штаммы заболевания не вызывают. Дифтерийный токсин по своим свойствам относится к сильнодействующим ядам, уступая лишь ботулитическому и столбнячному. Под воздействием токсина нарушается синтез белков во внутренних органах больного, что приводит к структурным и функциональным нарушениям, демиелинизация нервных волокон – к параличам и парезам. Способность к токсинообразованию проявляют лишь лизогенные штаммы C.diphtheriae, инфицированные бактериофагом (р-фаг), несущим ген tox, кодирующий структуру токсина дифтерии. Передача бактериофагом гена tox нетоксигенным штаммам C.diphtheriae, обитающим в носоглотке и накопление их в популяции, может сопровождаться развитием вспышки дифтерии.

Наиболее таксономически близкими к виду C.diphtheriae являются C.ulcerans и C.рseudotuberculosis, природные патогены крупного и мелкого рогатого скота, лошадей. Кроме того, на слизистой ротоглотки и носа часто встречается палочка Гофмана (C.pseudodiphtheriticum), не обладающая патогенностью и токсигенностью для человека. Поэтому основной задачей лабораторной диагностики дифтерии является выявление токсигенных штаммов дифтерии и дифференцировка возбудителя дифтерии от других коринебактерий, нормальных обитателей носо- и ротоглотки. Все микроорганизмы рода Corynebacterium – грамположительные полиморфные палочки, не образующие спор, хорошо растущие в аэробных условиях при 37°С. При окраске метиленовым синим в клетках C.diphtheriae отмечается внутриклеточная исчерченность, что объясняется наличием зерен волютина. Окраска по Граму не используется из-за вариабельности окрашивания клеток. По форме колоний и некоторым биохимическим свойствам C.diphtheriae подразделяются на культурально-биохимические варианты – gravis, mitis, intermedius, однако все они обладают способностью вырабатывать дифтерийный токсин. Тяжесть течения заболевания не связана с биохимическим вариантом C.diphtheriae. Токсигенные штаммы дифтерии более чувствительны к антибиотикам, чем не токсигенные.

Показания к обследованию

Профилактическое обследование – выявление источников инфекции, группы населения с повышенным риском заболевания; наблюдение за циркуляцией токсигенных штаммов в популяции; лица, поступающие в детские дома, школы интернаты, специализированные учреждения для детей и взрослых;
обследования по эпидемическим показаниям – лица с подтвержденным контактом с больным дифтерией или при эпидемии дифтерии в данной местности;
диагностические исследования – при подозрении на заболевание дифтерией (тонзиллит, назофарингит или ларингит который протекает с налетами псевдомембранозного характера).

Дифференциальная диагностика. Заболевания, сопровождающиеся тонзиллитом (инфекционный мононуклеоз, ангины стрептококковой, стафилококковой этиологии и др.).

При культуральных исследованиях возбудитель C.diphtheriae дифференцируется от других коринебактерий, в первую очередь C.pseudodiphtheriticum, C.ulcerans, C.pseudotuberculosis.

Материал для исследований

Мазок из ротоглотки и носа, при подозрении на дифтерию редких локализаций (глаз, рана, ухо и т.д.) – материал с пораженных участков, а также с миндалин и носа – культуральные исследования, обнаружение специфического фрагмента гена tox;
сыворотка крови – выявление АТ.

Этиологическая лабораторная диагностика включает посев клинического материала с изучением токсигенных свойств на среде для определения токсигенности и биохимической идентификацией возбудителя, обнаружение АГ (дифтерийного токсина), выявление специфических АТ к дифтерийному токсину, обнаружение специфического фрагмента гена tox.

Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики и особенности интерпретации их результатов. Микроскопические исследования выполняют только для идентификации выделенной культуры. Микроскопия биологического материала не проводится.

Для посева используют материал соответствующих локализаций. Изучение токсигенных свойств на среде для определения токсигенности выполняют при использовании метода встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических АТ в плотной питательной среде. При отсутствии линий преципитации на среде для определения токсигенности через 48 ч инкубации культура признается не токсигенной. Для биохимической идентификации используется тест с цистиназой (среда Пизу), определение уреазной и сахаролитической (сахароза, глюкоза, крахмал) активности.

Выдача ответа:

при обнаружении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности через 24–48 ч, положительной пробе на цистиназу, отрицательной пробе на уреазу, характерных культуральных и биохимических свойств дается заключение о выделении токсигенного штамма C.diphtheriae принадлежащего к культурально-биохимическому варианту gravis, mitis;
при отсутствии специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности через 48 ч, положительной пробе на цистиназу, отрицательной пробе на уреазу, характерных культуральных и биохимических свойств дается заключение о выделении не токсигенного штамма C.diphtheriae принадлежащего к соответствующему культурально-биохимическому варианту;
при наличии линий преципитации на среде для определения токсигенности, идентичных линиям контрольного штамма дифтерии, положительных проб на цистиназу, уреазу, ферментации глюкозы и крахмала, отсутствие ферментации сахарозы, отсутствие редукции нитратов в нитриты, культуру относят к виду C.ulcerans, токсигенный вариант;
при выделении дифтероидов ответ выдается отрицательный.

При посеве возбудитель C.diphtheriae дифференцируется от других коринебактерий, в первую очередь C.pseudodiphtheriticum, C.ulcerans, C.pseudotuberculosis. Для выявления дифтерийного токсина используют методы РНГА или ИФА. Это исследование не является обязательным в практических бактериологических лабораториях, однако может использоваться как дополнительное для выдачи предварительного ответа. Метод также позволяет определить относительное (условное) количественное содержание токсина в исследуемой пробе.

Для выявления специфических АТ используют методы РПГА и РНГА. Метод РПГА используется для изучения напряженности противодифтерийного иммунитета. Условно-защитным титром АТ принят титр 1:20.

У больных определение титра АТ к АГ дифтерийной палочки в сыворотке крови методом РНГА проводится в двух пробах крови, собранных в начале заболевания и через 7–10 дней. Нарастание титра АТ в 3–4 раза во второй сыворотке относительно первой свидетельствует о перенесенной инфекции. Исследование используется преимущественно для ретроспективной диагностики дифтерии.

Обнаружение гена токсигенности (tox) методом ПЦР – наиболее быстрый и надежный метод лабораторной диагностики, однако он не дает информацию о способности микроорганизма к экспрессии дифтерийного токсина. Описаны случаи нетоксигенных штаммов дифтерии, несущих в себе

Читайте также: