Посевы проб пищевых продуктов в среде кесслер инкубируют при температуре

Обновлено: 05.10.2024

Микробиологическое исследование пищевых продуктов проводят с целью выявления КМАФАнМ путем высева на чашки Петри с питательной средой (мясопептонным агаром) или отдельных групп микроорганизмов путем высева на элективные питательные среды. Количество микроорганизмов определяют в 1 см 3 продукта жидкой консистенции или в 1 г продукта плотной консистенции.

Отбор средней пробы. При анализе партии продукта готовят среднюю пробу. Для разных пищевых продуктов установлены нормы отбираемых средних проб и правила их отбора. Однако во всех случаях необходимо соблюдать условия, исключающие контаминацию исследуемого продукта посторонними микроорганизмами.

При исследовании жидкие и полужидкие продукты (молоко, сметана, соусы и др.) тщательно перемешивают и затем отбирают в стерильную посуду простерилизованным черпаком емкостью 50-100 см3. Пробы плотных продуктов (мясо, колбаса, рыба, кулинарные изделия и др.) отбирают из толщи продукта в разных местах. Предварительно поверхность исследуемых участков прижигают раскаленным ножом и по ней делают глубокий разрез стерильным скальпелем. Края разреза раздвигают стерильным пинцетом и вырезают стерильными ножницами небольшие кусочки продукта. Отобранные таким образом из разных мест образцы измельчают, собирают в стерильную тару и составляют из них среднюю пробу.

При оборе средней пробы таких продуктов, как сливочное масло, творог, сыр используют стерильный щуп, который вводят в продукт с одного края и доводят до противоположного вглубь и наискосок. Затем стерильным скальпелем из нескольких мест отобранной пробы берут кусочки, измельчают их и помещают в стерильную посуду.

Подготовка пробы к анализу. При исследовании плотных продуктов из средней пробы берут навеску массой от 1 до 10 г, переносят ее в стерильную ступку и тщательно растирают. Если продукт очень плотный, то его растирают в ступке с предварительно прогретым кварцевым песком. Растертый продукт вносят в колбу, содержащую от 90 до 99 см 3 стерильного физиологического раствора (0,5 %-й раствор хлорида натрия). Содержимое колбы осторожно взбалтывают в течение 5 мин. В колбе получается первое разведение продукта (1:10), из которого готовят последующие разведения.

Навеску сливочного масла расплавляют на водяной бане при температуре не выше 45 °С, после чего в 9 см 3 физиологического раствора вносят стерильной пипеткой 1 см 3 продукта, получая разведение 1:10.

Для исследования жидких и полужидких продуктов из полученной средней пробы после тщательного перемешивания отбирают стерильной пипеткой 1 см 3 продукта и вносят его в пробирку, содержащую 9 см 3 стерильного физиологического раствора.

Приготовление разведений. Пищевые продукты могут содержать значительное количество микроорганизмов, поэтому, чтобы получить изолированные колонии, необходимо приготовить десятикратные разведения продукта.

Полученное 1-е разведение продукта тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в нее и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3-5 раз, затем той же пипеткой отбирают 1 см 3 суспензии и переносят её во 2-ю пробирку с 9 см 3 стерильного физиологического раствора. Получают 2-е разведение (1:100). Пипетку нельзя погружать в жидкость во избежание смывания микроорганизмов с ее наружной поверхности. Новой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое 2-го разведения, набирают из него 1 см 3 и переносят в следующую пробирку с 9 см 3 стерильной воды, получая третье разведение (1:1000). Таким же образом готовят последующие разведения до получения необходимого результата.

Внимание! Для приготовления каждого разведения следует использовать отдельную стерильную пипетку. Пренебрежение этим правилом может привести к получению ошибочного результата.

Посев в чашки Петри. Для определения КМАФАнМ используют метод глубинного посева на плотные питательные среды. Схема посева приведена на рис. 15.1. На крышках чашек стеклографом отмечают исследуемый вариант и разведение. Каждое разведение высевают не менее чем в 2-3 параллельные чашки. Разведения выбирают с таким расчетом, чтобы на чашке выросло от 30 до 300 колоний. Стерильной пипеткой отбирают из пробирки по 1 см 3 соответствующего разведения суспензии и переносят его в 2-3 пустые стерильные чашки Петри. После внесения разведения суспензии чашки заливают питательной средой не позднее чем через 15 мин. Для этого над пламенем спиртовки вынимают пробку из пробирки или колбы с расплавленной и остуженной до 45-50 °С питательной средой и обжигают края. Затем приоткрывают крышку чашки так, чтобы только вошло горлышко колбы, и осторожно вливают 10-15 см 3 питательного агара, толщина слоя которого должна быть около 5 мм. Чашку закрывают крышкой и сразу же легкими вращательными движениями перемешивают питательную среду с посевным материалом, после чего оставляют на 10-15 мин в горизонтальном положении для застывания среды. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и помещают на 24-48 ч в термостат с температурой 37±1 °С.

Рис. 15.1. Схема посева продукта для определения КМАФАнМ

Подсчет выросших колоний. После инкубации отбирают чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний, подсчитывают их визуально или с помощью специального прибора для подсчета колоний. При подсчете колоний чашки просматривают в проходящем свете и отмечают подсчитанные колонии чернилами или тушью. В случае, если на чашке с максимальным разведением выросло более 300 колоний, можно вести их подсчет при помощи лупы и сетки из оргстекла со стороной квадрата 1 см при боковом освещении. Подсчет колоний проводят не менее чем в 20 квадратах, определяют среднее их число на 1 см 2 и умножают на площадь поверхности среды в чашке.

Количество микроорганизмов в 1 см (или в 1 г) продукта (КМАФАнМ) определяют, как произведение количества выросших колоний (N) на показатель разведения (n):

КМАФАнМ = N •10 n КОЕ/см 3 .

Примечание. Анаэробные микроорганизмы не определяются чашечным методом, так как для их выращивания необходимо создать анаэробные условия. Культивирование анаэробов осуществляют в анаэростатах (см. рис. 4.1) или используют питательные среды с редуцирующими веществами.

15.2. Определение бактерий группы кишечных палочек (БГКП) в пищевых продуктах

Определение БГКП в пищевых продуктах проводят в соответствии с ГОСТ Р 50474-93. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечной палочки (колиформных бактерий).

Метод определения БГКП основан на обнаружении образования газа и кислоты при высеве определенного количества продукта (или смыва с его поверхности) в жидкие питательные среды, содержащие лактозу (среда Кесслера) с последующим подтверждением принадлежности выросших микроорганизмов к группе кишечных палочек по морфологическим и культуральным признакам.

Исследование на наличие БГКП проводят в несколько этапов:

I этап - приготовление разведений продукта. Если продукт плотный (колбаса, сыр, масло, творог и др.), то результат выражают в отсутствии БГКП в определенной его массе (г). Если продукт жидкий (молоко, кисломолочные напитки, сок и т. д.), то БГКП должны отсутствовать в определенном его объеме (см 3 или дм 3 ).

II этап - посев определенного количества продукта или его разведений в среду Кесслера. Среду Кесслера разливают в пробирки или колбы, в которые помещают поплавок (стеклянная трубочка

с одним запаянным концом). После стерилизации поплавок должен быть заполнен средой.

В пробирки со средой Кесслера вносят по 1 см 3 соответствующего разведения продукта (10 -1 ;10 -2 ;10 -3 )и ставят в термостат при температуре (37±1) °С. Через 24 ч инкубации посевы просматривают и отмечают образование газа в поплавке и изменение цвета среды из фиолетового в желто-зеленый. Записывают, в каких разведениях произошло газообразование.

После инкубации чашки просматривают. Бактерии группы кишечной палочки образуют на среде Эндо красные или розовые блестящие колонии с металлическим блеском или без него. Такой характер роста на среде Эндо эти бактерии дают за счет сбраживания лактозы и образования кислоты, вызывающей восстановление индикатора фуксина, окрашивающего колонии в красный цвет.

Из типичных колоний на среде Эндо готовят препараты, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Если в препарате обнаруживаются мелкие грамотрицательные неспорообразующие палочки, то одновременно ставят оксидазный тест. Заключение о том, что обнаруженные в продукте микроорганизмы относятся к БГКП, делают на основании выявления в посевах грамотрицательных, не образующих спор палочек, сбраживающих лактозу с образованием кислоты и газа при температуре 37±1 °С с отрицательным тестом на оксидазу. При этом указывают массу навески продукта (в г) или его объем (в см 3 ). В случае отсутствия на среде Эндо типичных для БГКП колоний продукт считают не загрязненным кишечными палочками.

15.3. Определение количества дрожжей и плесеней

Для определения количества дрожжей и плесеней в пищевых продуктах делают посев соответствующих разведений в чашки Петри, которые заливают расплавленным и остуженным до температуры 45-50 °С сусло-агаром (СА) или средой Сабуро. Содержимое чашек перемешивают вращательными движениями и оставляют для застывания на 10-15 мин, после чего ставят в термостат с температурой 30±2 °С на 2-3 сут. После инкубации в чашках подсчитывают отдельно количество выросших колоний плесеней и дрожжей. Результат выражают числом КОЕ/ см3 (или г).

Контрольные вопросы

1. Что такое КМАФАнМ?

2. Для чего делают разведения пищевого продукта при определении количества микроорганизмов?

3. Какие питательные среды используют для определения КМАФАнМ, дрожжей и плесеней?

4. Из каких этапов состоит определение БГКП в пищевых продуктах?

5. Какие среды используют для определения БГКП в пищевых продуктах?

6. По каким признакам устанавливают рост БГКП в среде Кесслера?

7. Как выглядят колонии БГКП на среде Эндо?

8. В каком случае дают положительный ответ на присутствие в пищевом продукте БГКП?

Тема: Санитарно-микробиологическое исследование пищевых продуктов. Санитарно-микробиологический контроль молока и молочных продуктов. Исследование рыбы и рыбных продуктов.

Цель: Исследование пищевых продуктов - один из самых сложных разделов санитарной микробиологии. Это обусловлено как разнообразием и обилием микрофлоры в них, использованием микроорганизмов в приготовлении ряда пищевых продуктов, так и отсутствием полноценных методов выявления микроорганизмов. Многие инфекционные заболевания бактериальной и вирусной природы передаются через пищевые продукты (брюшной тиф, сальмонеллёзы, дизентерия, эшерихиозы, ботулизм, холера, бруцеллёз, полиомиелит и др.). Пища содержит большое количество факторов роста и витаминов, способствующих размножению микроорганизмов. Необходимо учитывать, что полностью освободить пищевые продукты от микроорганизмов без изменения их пищевых качеств, как правило, невозможно. Несоблюдение санитарных правил получения, транспортировки, хранения или приготовления готовых блюд может приводить к загрязнению продуктов микробами и токсинами, что служит предпосылкой возникновения пищевых отравлений.

Студент должен знать:

Инфекционные заболевания бактериальной и вирусной природы, передающиеся через молоко (брюшной тиф, сальмонеллёзы, дизентерия, эшерихиозы, бруцеллёз, полиомиелит и др.)

Патогенез заболеваний, течение, клинические проявления для адекватного выбора биоматериала.

Схемы выделения чистой культуры микроорганизмов (этапы).

Студент должен уметь:

Осуществить забор исследуемого молока, маркировку, доставку.

Произвести первичный посев биоматериала на среды накопления и элективные.

Осуществить забор рыбы, доставку.

Исследование рыбы и рыбных продуктов.

Произвести первичный посев рыбы на среды накопления и элективные.

Основные вопросы темы

Микрофлора молочных продуктов

Бактерии молочнокислого брожения

Фаза смешанной микрофлоры

Фаза молочнокислых стрептококков

Фаза грибковой микрофлоры

Технологические особенности рыбных продуктов.

Санитарно-гигиеническое исследование свежей, замороженной, соленной, высушенной, вяленной, копчёной.

Выбор схемы бактериологического исследования.

Методы индикации СПМО.

Методы обучения и преподавания (малые группы, дискуссия, ситуационные задачи, работа в парах, презентации, кейс-стади и т.д.): Выбор исследуемого материала, первичный посев на элективные питательные среды. Решение ситуационных задач.

Лапшина, Л.Н. Микробиологический контроль за качеством пищевых продуктов и санитарным режимом на пищевых предприятиях.Санитарно-микологический контроль пищевых продуктов растительного происхождения : Учеб.-метод.пособие / Лапшина, Л.Н. - Караганда, 2008. - 47 с

Медицинская микробиология, вирусология и иммунология : в 2 т.: учебник / ред.: В. В. Зверев, М. Н. Бойченко. - М. : ГЭОТАР-Медиа Т. 1,2 - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010, 2011. - 448 с

Мудрецова-Висс, К.А. Микробиология,санитария и гигиена : учебник / Мудрецова-Висс, К.А., Дедюхина В.П. - 4-е изд. - М. : Форум, 2008. - 400 с. : ил. - (Высшее образование)

Сбойчаков В.Б. Санитарная микробиология : Учебное пособие / Сбойчаков, Виктор Борисович. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 191 с

К неспецифической микрофлоре пищевых продуктов относят все микроорганизмы, кроме:

В) возбудителей порчи

С) патогенной флоры

Микробиологические критерии безопасности пищевых продуктов включают определение всех показателей, кроме:

А) количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

С) микроорганизмов порчи

D) остаточного количества консервантов

Е) наличия плесени

Микробиологический контроль качества пищевых продуктов включает определение количества (наличия):

В) колиформных бактерий

С) золотистых стафилококков

D) сульфитредуцирующих клостридий

Е) молочнокислых стрептококков

Условно-патогенные микроорганизмы, нормируемые в ряде пищевых продуктов, — все, кроме:

В) S. aureus, Enterococcus

С) бактерий рода Proteus

Е) сульфитредуцирующих клостридий

Альтернативный принцип нормирования для пищевых продуктов предполагает:

А) нормирование количества КОЕ в 1 г (мл) продукта

В) нормирование массы продукта, в которой не допускают присутствия колиформных бактерий, большинства условно-патогенных микроорганизмов, а также патогенных микроорганизмов

С) нормирование по наименьшей массе (объёму) продукта, в которой допускается наличие одной особи СПМО (по титру).

D) нормирование количества КОЕ в 1 г (мл) продукта

Е) нормирование по наименьшей массе (объёму) продукта, в которой допускается наличие одной особи СПМО

Определение дрожжей и плесеней регламентировано в следующих пищевых продуктах:

А) мясо и мясные продукты

В) рыба и рыбные продукты

С) молоко и молочные продукты

D) мучные кондитерские изделия

Е) конфеты, шоколад, какао

Назовите микроорганизмы, способные размножаться в пищевых продуктах при хранении их в условиях холодильника:

Посев пищевых продуктов по методу Шушкевича используют для обнаружения микроорганизмов рода:

Молоко и молочные продукты - один из основных факторов передачи человеку всех инфекций, кроме:

D) клещевого энцефалита, ящура, лихорадки Ку

При исследовании консервов с целью установления промышленной стерильности допускают содержание следующих аэробных и факультативно-анаэробных мезофильных микроорганизмов:

А) неспорообразующих бактерий

D) группы В. subtilis

Определение ботулинического токсина в пищевых продуктах проводят с помощью:

А) посева в жидкие питательные среды

В) реакции нейтрализации на котятах

С) реакции нейтрализации на мышах

D) реакции иммунофлюоресценции

Е) посев на кровяной агар

При определении колиформных бактерий в молочных продуктах посев проб проводят в среду:

Е) кровяной агар

Посевы проб пищевых продуктов в среде Кесслер инкубируют при температуре:

При определении в пищевых продуктах ОМЧ инкубацию посевов проводят при температуре:

При проверке баночных консервов на герметичность их:

А) помещают в термостат на 5 сут при температуре 30 °С;

В) помещают в термостат на 1-2 сут при температуре 37 °С

С) погружают в ёмкость с горячей (80 °С) водой

D) помещают в термостат на 5 сут при температуре 30 °С;

Е) помещают в термостат на 1-2 сут при температуре 37 °С

Назовите патогенные микроорганизмы, наиболее часто загрязняющие свежевыловленную рыбу:

А) род Achromobacter

С) V. parahaemolyticus

D) патогенные энтеробактерии

Рыба и рыбные продукты могут служить причиной пищевых отравлений и сходных по клинике заболеваний, вызванных:

С) галофильными вибрионами

D) С . perfringens

При бомбаже или нарушении герметичности баночные консервы:

А) исследуют для контроля их стерильности

В) исследуют для контроля их промышленной стерильности

С) дальнейшему исследованию не подлежат (исследуются только при расследовании случаев пищевых отравлений).

D) исследуют для контроля их промышленной стерильности

Е) исследуют для контроля их стерильности

Бактериологический контроль качества готовых консервов осуществляют, определяя:

А) промышленную стерильность

С) возбудителей порчи

D) патогенные микроорганизмы

Е) ботулинический и стафилококковый токсины

Этапами исследования баночных консервов для контроля промышленной стерильности считают все, кроме:

А) исследования на герметичность

В) исследования на бомбаж

С) посева в среды Китт-Тароцци, сахарный бульон

D) концентрирования проб

Е) исследования на бомбаж

При исследовании баночных консервов на присутствие мезофильных микроорганизмов первичные посевы помещают в термостат на срок:

А) 2 дня при температуре 37 °С

В) до 5 сут при температуре 30 °С

С) до 1 нед при температуре 37 °С

D) 3 дня при температуре 37 °С

Е) 4 дня при температуре 37 °С

При исследовании баночных консервов первичный посев для выделения мезофильных анаэробов проводят в среду:

При исследовании консервов на наличие мезофильных анаэробных микроорганизмов с подтверждения промышленной стерильности:

А) недопустимо присутствие мезофильных клостридий

В) допустимо наличие мезофильных клостридий, за исключением С. perfringens , С. botulinum

С) допустимо содержание неспорообразующих анаэробных микроорганизмов

D) недопустимо содержание любых групп анаэробов

Е) недопустимо содержание любых спорообразующих анаэробов

Назовите патогенные микроорганизмы, наиболее часто загрязняющие свежевыловленную рыбу:

А) род Achromobacter

С) V . parahaemolyticus '

D) патогенные энтеробактерии

С) галофильными вибрионами

D) С . perfringens

При плановом санитарно-микробиологическом исследовании рыбы и рыбной продукции определяют количество:

В) колиформных бактерий

С) золотистых стафилококков

D) холерных вибрионов

Е) дизентерийных бактерий

А) неспорообразующих бактерий

D) группы В. subtilis

Определение ботулинического токсина в пищевых продуктах проводят с помощью:

А) посева в жидкие питательные среды

В) реакции нейтрализации на котятах

С) реакции нейтрализации на мышах

D) реакции иммунофлюоресценции

Е) посев на кровяной агар

При определении колиформных бактерий в молочных продуктах посев проб проводят в среду:

Е) кровяной агар

Посевы проб пищевых продуктов в среде Кесслер инкубируют при температуре:

Методические рекомендации к практическим занятиям Казань, 2005

Учебно-методическое пособие для практических занятий по дерматовенерологии для студентов педиатрического факультета казань 2008

. дерматовенерологии УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ ПО ДЕРМАТОВЕНЕРОЛОГИИ ДЛЯ СТУДЕНТОВ ПЕДИАТРИЧЕСКОГО . РЕАКЦИИ НА ПИЩЕВЫЕ И НЕПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ/ВЕЩЕСТВА (БАКТЕРИАЛЬНЫЕ, ГРИБКОВЫЕ, ЛЕКАРСТВЕННЫЕ) Пищевой продукт Продукты и .

Методические рекомендации применение игровых технологий на уроках специальных дисциплин как средство активизации познавательной деятельности учащихся (на примере дисциплины микробиологии, санитария и гигиена в пищевом производстве)

. ПИЩЕВОМ ПРОИЗВОДСТВЕ) Предназначено как учебно-методическое пособие для проведения занятий . санитарную обработку оборудования и инвентаря; готовить растворы дезинфицирующих и моющих средств; выполнять простейшие микробиологические исследования .

Рабочая программа Дисциплина: Гигиена питания Код дисциплины

. питания. Санитарная охрана пищевых продуктов 2.8 Тематический план: темы, форма проведения и продолжительность каждого занятия (лекций, практических, семинарских .

Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

Food products. Methods for detection and quantity determination of coliformes

____________________________________________________________________
Текст Сравнения ГОСТ 31747-2012 с ГОСТ Р 52816-2007 см. по ссылке.
- Примечание изготовителя базы данных.
____________________________________________________________________

Дата введения 2013-07-01

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности" (ГНУ "ВНИИКОП") на основе аутентичных переводов на русский язык международных стандартов, указанных в пункте 4

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственном советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 октября 2012 г. N 51)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

4 Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международным стандартам:

- ISO 4831:2006* "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of coliforms - Most probable number technique", (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод для выявления и подсчета количества колиформ. Метод наиболее вероятного числа);

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

- ISO 4832:2006 "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coliforms - Colony-count technique", (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета колиформ. Метод подсчета колоний) в части пищевых продуктов.

При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики указанных выше государств и особенностей межгосударственной стандартизации, выделены в тексте стандарта курсивом*.

* В бумажном оригинале обозначения и номера стандартов и нормативных документов в разделе "Предисловие" приводятся обычным шрифтом, остальные по тексту документа выделены курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (пункт 3.6).

Сравнение структуры настоящего стандарта со структурой указанных международных стандартов приведено в дополнительном приложении ДА.

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52816-2007

5 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1771-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31747-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, кроме молока и молочных продуктов, и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта колиформных бактерий и три метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и методы посева в или на агаризованные селективно-диагностические среды.

Метод определения НВЧ колиформных бактерий предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 150 или в 1 см жидкого продукта менее 15 клеток колиформных бактерий.

Метод определения количества колиформных бактерий посевом в агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 150 или в 1 см жидкого продукта более 15 колониеобразующих единиц (КОЕ) колиформных бактерий.

Метод определения количества колиформных бактерий посевом на агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 1500 или в 1 см жидкого продукта более 150 КОЕ колиформных бактерий.

Допускается использование хромогенных сред для предварительного выявления количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий) в масложировой продукции.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 24104-2001* Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 29184-91 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному справочному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 колиформные бактерии: Бактерии, которые при температуре 37 °С ферментируют лактозу с образованием газа по методам, приведенным в настоящем стандарте.

3.2 выявление колиформных бактерий: Определение присутствия или отсутствия колиформных бактерий в определенной массе или объеме продукта в соответствии с настоящим стандартом

3.3 определение количества колиформных бактерий:

3.3.1 Количество бактерий, содержащееся в 1 см или 1 грамме продукта, определенное путем посева продукта и (или) его разведений в или на агаризованную селективно-диагностическую среду, подсчете после инкубирования при температуре 37 °С типичных и атипичных колоний и определении возможности бактерий из этих колоний ферментировать лактозу с образованием газа по методам, приведенным в настоящем стандарте.

При необходимости, подтверждают по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.

3.3.2 Количество бактерий, содержащееся в 1 см или 1 грамме продукта, определенное по методу НВЧ, указанному в настоящем стандарте.

4 Метод выявления колиформных бактерий и определения количества по методу НВЧ

Методы выявления и определения НВЧ колиформных бактерий основаны на высеве определенного количества продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду с лактозой, инкубировании посевов, учете положительных пробирок, пересеве культуральной жидкости в жидкую селективную среду для учета газообразования или пересева, при необходимости, культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды для подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.

4.1 Метод выявления колиформных бактерий

4.1.1 Пробирку с селективной обогатительной средой инокулируют продуктом или разведением навески продукта и инкубируют при температуре 37 °С 24 или 48 ч.

4.1.2 Пробирку с подтверждающей средой инокулируют из пробирки, полученной по 4.1.1, где отмечено образование газа и/или помутнение и инкубируют при температуре 37 °С 24 или 48 ч.

4.1.3 Присутствие колиформных бактерий считается подтвержденным, в случае если отмечено помутнение и образование газа после осмотра пробирки, полученной по 4.1.2.

4.2 Метод НВЧ - определение количества колиформных бактерий

4.2.1 Три пробирки с жидкой обогатительной средой двойной концентрации инокулируют определенным количеством продукта, если исходный продукт жидкий, или определенным количеством исходной суспензии в случае другого продукта.

4.2.2 Три пробирки с жидкой обогатительной средой нормальной концентрации инокулируют определенным количеством продукта и/или разведением продукта, если исходный продукт жидкий, или определенным количеством исходной суспензии и/или разведением в случае другого продукта.

4.2.3 Посевы в пробирках, содержащие обогатительную среду двойной концентрации, инкубируют при температуре 37 °С 24 ч. Посевы в пробирках со средой нормальной концентрации, инкубируют 24 или 48 ч, после этого в этих пробирках отмечают наличие газа и/или помутнения, мешающего выявлению образования газа.

4.2.4 Пробирки с подтверждающей средой инокулируют культурами из пробирок с обогатительной селективной средой двойной концентрации и культурами из пробирок с обогатительной селективной средой нормальной концентрации, в которых отмечено образование газа и/или помутнение.

Посевы в пробирках с подтверждающей средой инкубируют при температуре 37 °С 24 или 48 ч, после этого в пробирках отмечают образование газа.

4.2.5 Наиболее вероятное число колиформных бактерий в 1 см или 1 г пробы продукта (НВЧ) рассчитывают исходя из числа пробирок с подтверждающей средой (4.2.4), показавших образование газа. Для определения наиболее вероятного числа пользуются таблицей ГОСТ 26670.

1.1. Настоящие методические указания предназначены для специалистов органов, осуществляющих функции по контролю и надзору в сфере обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения, организаций и учреждений Роспотребнадзора, лечебно-профилактических и других организаций независимо от организационно-правовой формы и формы собственности.

1.2. Методические указания устанавливают методы санитарно-бактериологических исследований в учреждениях здравоохранения, других организациях лечебного профиля. Объектами санитарно-бактериологических исследований, на которые распространяются настоящие методические указания, являются:

· объекты окружающей среды, в т.ч. изделия медицинского назначения, зонды, катетеры, бужи, резиновые перчатки и другие изделия из резин и металлов, шовный материал, подготовленный к использованию, и прочее, спецодежда;

1.3. Номенклатура, кратность и объем санитарно-бактериологических исследований устанавливается действующими нормативно-методическими документами с учетом санитарно-эпидемиологической обстановки.

1.4. Для санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности изделий медицинского назначения в учреждениях здравоохранения и других организациях лечебного профиля могут быть использованы питательные среды лабораторного и промышленного приготовления, расходные материалы, биологические препараты, указанные в настоящих методических указаниях. Применение других коммерческих питательных сред (расходных материалов, биологических препаратов) допускается при наличии методик исследования, утвержденных и разрешенных к применению в установленном порядке.

3.1. Исследования бактериальной обсемененности воздушной среды

3.1.1. Исследования бактериальной обсемененности воздушной среды проводят в помещениях лечебных организаций в зависимости от их функционального назначения на санитарно-микробиологические показатели:

общее количество микроорганизмов в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3 );

количество колоний S . aureus в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3 );

количество плесневых и дрожжевых грибов в 1 м 3 воздуха.

3.1.2. Пробы воздуха отбирают аспирационным методом с помощью аппаратов и устройств, разрешенных к применению в установленном порядке.

Количество пропущенного воздуха должно составлять 100 дм 3 для определения общего количества микроорганизмов, дрожжевых и плесневых грибов и 250 дм 3 для определения S. aureus . Исследование воздуха седиментационным методом не допускается.

3.1.3. Для определения общего количества микроорганизмов в 1 м 3 воздуха забор проб проводят на питательный агар типа МПА, СПА, ГРМ-агар и другие, приготовленные согласно инструкций по применению. Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение (48 ± 2) ч, подсчитывают количество выросших колоний и производят перерасчет на 1 м 3 воздуха. При наличии роста колоний дрожжевых и плесневых грибов, их подсчитывают и делают пересчет на 1 м 3 воздуха. В протоколе количество дрожжевых и плесневых грибов указывают отдельно.

Примечание : При переносе аппаратов и устройств для отбора проб воздуха из одного помещения в другое их поверхность обрабатывают раствором дезинфицирующего средства. Столик, внутренние стыки, крышку и прочие части прибора с внутренней и внешней стороны протирают спиртом (70 %).

Для определения наличия S. aureus забор проб проводят на желточно-солевые среды на основе сред: элективно-солевой агар, стафилококк-агар, маннитолагар или среда № 10 по ГФ XII, агар Байд-Паркер. Чашки с посевами инкубируют в термостате при 37 °С (48 ± 2) ч.

2. Второй-третий день.

На вышеуказанных средах стафилококк растет в виде круглых, блестящих, маслянистых, выпуклых, пигментированных колоний. Следует учитывать, что стафилококки, выделенные от человека, дают положительную лецитовителлазную реакцию в 60 - 70 % случаев. Отвивка на скошенный агар для дальнейшего исследования не менее 2 колоний, подозрительных на стафилококк. Для исследования отвивают прежде всего колонии, дающие положительную лецитовителлазную реакцию (образование радужного венчика). При отсутствии на чашках таких колоний дальнейшему исследованию подвергаются пигментированные колонии, схожие по морфологии со стафилококком. При одновременном наличии на чашках колоний стафилококка, отличающихся по пигменту, следует отвивать не менее двух колоний различного вида. Пробирки с посевом помещают в термостат при 37 °С на (24 ± 2) ч.

3. Четвертый день.

После инкубации у выделенных штаммов проверяют морфологию, тинкториальные свойства (окраска по Граму) и наличие плазмокоагулирующей активности в реакции плазмокоагуляции (РПК).

Если культура обладает только плазмокоагулирующей или только лецитовителлазной активностью, то для окончательного ответа требуется учитывать другие признаки, позволяющие определить принадлежность штамма к виду S. aureus (ферментация маннита, гемолитическая активность).

При необходимости, после выделения чистой культуры, проводят определение чувствительности/устойчивости к антибиотикам, дезинфицирующим средствам, бактериофагам.

Учет результатов дополнительных тестов. Окончательная выдача ответа.

3.2. Исследования микробной обсемененности объектов внешней среды

3.2.1. Бактериологическое исследование микробной обсемененности объектов внешней среды предусматривает определение стафилококков, бактерий группы кишечных палочек, сальмонелл, синегнойной палочки. Отбор проб с поверхностей различных объектов осуществляют методом смывов. По эпидемиологическим показаниям номенклатура исследований микробной обсемененности объектов внешней среды может быть расширена.

3.2.2. Взятие смывов производят стерильными ватными тампонами, вмонтированными в пробирки. Для увлажнения тампонов в пробирки наливают по 2,0 мл стерильной 0,1 % пептонной воды с добавлением нейтрализаторов дезинфицирующих средств.

3.2.3. При контроле мелких предметов смывы забирают с поверхности всего предмета. При контроле предметов с большой поверхностью смывы проводят в нескольких местах исследуемого предмета общей площадью примерно 100 см 2 .

3.2.4. Для обнаружения стафилококков делают высев 0,2 - 0,3 мл смывной жидкости в пробирку с 5,0 мл 6,5 % солевого бульона. Засеянные пробирки инкубируют при 37 °С в течение (24 ± 2) ч, после чего делают высев на желточно-солевые среды на основе сред: элективно-солевой агар, стафилококкагар, манитолагар или среда № 10 по ГФ XII, агар Байд-Паркер. Дальнейшие исследования выделенных культур стафилококков проводят по п. 3.1.4.

3.2.5. Для обнаружения бактерий группы кишечных палочек делают высев 0,2 - 0,3 мл смывной жидкости в пробирку с 5,0 мл среды Кесслера. Засеянные пробирки инкубируют при 37 °С в течение (24 ± 2) ч и делают пересев на среду Эндо. Выросшие колонии на среде Эндо подвергают дальнейшему изучению для установления их возможной принадлежности к патогенным энтеробактериям.

3.2.6. Для обнаружения сальмонелл делают высев 0,2 - 0,3 мл смывной жидкости в пробирку с 5,0 мл одной из сред обогащения (магниевая, селенитовая или среда Раппапорта-Вассилиадиса). Засеянные пробирки инкубируют при 37 °С в течение 18 - 20 ч, делают пересев на среду Эндо и висмут-сульфит агар с последующим отбором подозрительных колоний и их идентификацией.

3.2.7. Для обнаружения синегнойной палочки делают высев на среду № 8 (бульон для накопления стафилококков и синегнойной палочки) и среду № 9 (для определения синегнойной палочки по наличию пигмента пиоцианина) или питательные среды в соответствии с ГФ XII. Колонии, подозрительные на синегнойную палочку (колонии с ровными или слегка волнистыми краями, гладкой блестящей поверхностью с характерным запахом и пигментом, однако, следует учесть, что запах и пигмент могут сильно варьировать или вообще отсутствовать), пересевают на скошенный агар.

P. aeruginosa - грамотрицательная, подвижная, оксидазоположительная палочка, окисляющая, но не ферментирующая глюкозу, дающая рост при 42 °С.

3.2.8. Ориентировочный перечень объектов, подлежащих санитарно-бактериологическому контролю методом смывов:

А. Операционный блок:

· маска наркозного аппарата;

· тройник наркозного аппарата;

· емкости и приспособления для мытья и обработки рук;

· фартуки (клеенчатые или полиэтиленовые);

· шланг вакуум-отсоса, внутренняя часть емкости;

· шланг кислородной подводки;

· стоики для введения лекарственных средств и вспомогательные приспособления;

· ручка бестеневой лампы;

· руки персонала, участвующего в операции;

· медицинские изделия многократного применения;

Б. Послеоперационные палаты, отделения, палаты реанимации и интенсивной терапии:

· кровать и постельное белье, подготовленные для больного;

· полотенца и приспособления для обработки рук персонала;

· шланг кислородной подводки;

· запасная наркозная аппаратура (набор реанимационной укладки);

· шланг вакуум-отсоса, внутренняя часть емкости;

· внутренняя поверхность шкафов и холодильников (для хранения лекарственных средств, градусников);

· медицинские изделия многоразового использования;

В. Перевязочные, процедурные:

· кушетка и приспособления для перевязок;

· полотенца и приспособления для обработки рук персонала;

· мебель (медицинские столы, тумбочки);

· оборудование для химической стерилизации (стойки, чехлы для хранения стерильных эндоскопов, емкости с крышкой для химической стерилизации);

· гибкая часть эндоскопов и оптика;

· внутренняя поверхность шкафов и холодильников для хранения лекарственных препаратов и изделий медицинского назначения;

· внутренняя и наружная поверхности бактерицидных камер для хранения простерилизованных изделий медицинского назначения.

4.1. Отбор проб на стерильность производит специалист после прохождения инструктажа по технике выполнения отбора проб для микробиологического анализа.

4.2. Все изделия медицинского назначения, подлежащие контролю, направляют в микробиологическую лабораторию в упаковке, в которой осуществляли их стерилизацию, дополнительно заворачивают в стерильную простыню или помещают в стерильную наволочку.

При стерилизации изделий в неупакованном виде в отделении отбор проб проводят в стерильные емкости, соблюдая правила асептики.

Контроль стерильности проводят путем прямого посева (погружения) изделий целиком (при их небольших размерах) или отдельных деталей (разъемные изделия) и фрагментов (отрезанные стерильными ножницами кусочки шовного, перевязочного материала и т.п.) в питательные среды. При посеве изделия или его части непосредственно в питательную среду количество среды в пробирке (колбе, флаконе и т.д.) должно быть достаточным для полного погружения изделия или его части.

При проверке стерильности более крупных изделий проводят отбор проб методом смывов с различных участков поверхности изделий: с помощью стерильного пинцета (корнцанга) каждый участок тщательно протирают марлевой салфеткой (размер салфетки 5 ´ 5 см), увлажненной стерильной питьевой водой. Каждую салфетку помещают в отдельную пробирку (колбу, флакон) с питательной средой.

У изделий, имеющих функциональные каналы, рабочий конец опускают в пробирку с питательной средой и с помощью стерильного шприца или пипетки 1 - 2 раза промывают канал этой средой.

4.3. Для контроля стерильности используют следующие питательные среды: тиогликолевую, бульон Сабуро (с ингибитором посторонней микрофлоры - теллурит калия или левомицетин).

При контроле изделий каждого наименования обязателен одновременный посев на обе указанные питательные среды.

На каждый вид исследуемого материала используют по две пробирки каждой среды.

При посеве изделия или его части непосредственно в питательную среду количество среды в пробирке (колбе, флаконе и т.д.) должно быть достаточным для полного погружения изделия или его части.

4.4. Посевы в тиогликолевой среде выдерживают в термостате при температуре 32 °С. Посевы в бульоне Сабуро - при температуре 20 - 22 °С в течение 14 суток при контроле изделий, простерилизованных растворами химических средств и газовым методом, в течение 7 суток - простерилизованных физическими методами (паровой, воздушный).

4.5. Учет результатов исследования на стерильность.

При отсутствии роста микроорганизмов во всех пробирках (колбах, флаконах) делают заключение о стерильности изделий. Материал не стерилен при росте микрофлоры.

5.1. Смывы с рук персонала производят стерильными марлевыми салфетками размером 5 ´ 5 см, смоченной в нейтрализаторе. Марлевой салфеткой тщательно протирают ладони, околоногтевые и межпальцевые пространства обеих рук. После отбора проб марлевую салфетку помещают в широкогорлые пробирки или колбы с физиологическим раствором и стеклянными бусами, встряхивают в течение 10 мин. Жидкость засевают глубинным способом на 2 чашки Петри с мясопептонным агаром (по 0,5 мл) и в 2 пробирки с 0,5 %-м сахарным бульоном (по 1 мл). Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение 48 ч.

5.2. Учет результатов.

Отсутствие роста патогенных и условно патогенных бактерий.

6.1. Требования к помещению для посева на стерильность

6.1.1. Контроль стерильности изделий проводят с соблюдением асептических условий, исключающих возможность вторичной контаминации изделий микроорганизмами.

Контроль стерильности изделий проводят в боксах с ламинарным потоком воздуха. При отсутствии боксов с ламинарным потоком воздуха контроль стерильности проводят в боксированных помещениях (бокс с предбоксником).

6.1.2. В боксированном помещении поверхность пола, стен, потолка, мебели должна быть гладкой, без щелей, устойчивой к многократному действию моющих и дезинфицирующих средств. Полы должны быть нескользкими, иметь гидроизоляцию. Поверхность столов не должна иметь швов и трещин.

6.1.3. Боксы оборудуют приточно-вытяжной вентиляцией (с преобладанием притока над вытяжкой) с подачей в них воздуха через бактериальные фильтры. В боксе и предбокснике устанавливают бактерицидные облучатели в соответствии с нормами, предусмотренными действующими нормативно-методическими документами.

6.2. Подготовка бокса, инструментов и персонала к работе

6.2.1. Перед проведением работы поверхности в помещениях бокса и предбоксника (стены, пол, оборудование и др.), а также внутренние поверхности бокса с ламинарным потоком воздуха обрабатывают раствором дезинфицирующего средства, разрешенного к применению в установленном порядке.

6.2.2. Через 45 - 60 мин после обработки в бокс вносят все необходимые для работы материалы и инструменты, кроме образцов изделий.

6.2.3. Перед началом работ бокс с ламинарным потоком воздуха включают на время, достаточное для обеспечения полного обмена воздуха, а затем помещают в него необходимый для работы материал.

6.2.4. В боксе и предбокснике перед работой включают бактерицидные облучатели.

6.2.5. Инструменты, посуду и спецодежду, используемые в работе, предварительно стерилизуют при следующем режиме: температура 32 °С, время стерилизационной выдержки - 90 мин; изделия из резин (перчатки и т.д.) - при температуре 120 °С в течение 60 мин.

6.2.6. Перед посевом исследуемый материал вносят в предбоксник, предварительно снимая наружную мягкую упаковку. В предбокснике пакеты, биксы протирают снаружи с помощью стерильного пинцета (корнцанга) стерильной салфеткой (ватным тампоном), обильно смоченной раствором дезинфицирующего средства, обладающего спороцидными свойствами, разрешенного к применению в установленном порядке, и оставляют на 30 мин. При поступлении изделий, упакованных в два слоя (бумага, перманганаты, ткани), первый слой снимают в предбокснике и изделия во внутренней упаковке сразу переносят в бокс.

6.2.7. Перед входом в бокс работники лаборатории тщательно моют руки теплой водой с мылом, вытирают их стерильным полотенцем (салфеткой), надевают в предбокснике бахилы, стерильные халаты, 4-слойные маски, шапочки и стерильные перчатки.

6.2.8. В процессе посева в боксе проверяют обсемененность воздуха. Для этого на рабочий стол ставят 2 чашки с мясопептонным агаром (МПА), открывая их на 15 мин, затем чашки помещают в термостат при температуре 37 °С на (48 ± 2) ч. Допускается рост не более трех колоний неспорообразующих сапрофитов.

Для контроля стерильности питательные среды после изготовления и стерилизации помещают в термостат при температуре 37 °С на (48 ± 2) ч.

Бульон Сабуро контролируют полностью (всю приготовленную серию пробирок или колб).

Для тиогликолевой среды термостатируют 1 % от общего числа приготовленных пробирок или колб каждой серии. Для проведения исследований материала на стерильность эту часть сред не используют.

Читайте также: