При исследовании молока для определения патогенного стафилококка посев проводят на

Обновлено: 04.07.2024

Грудное молоко – уникальный по своему составу продукт, содержащий множество полезных для малыша веществ. В настоящее время большинство матерей стремятся к полноценному грудному вскармливанию.

Ведь известно, что грудное молоко, полностью обеспечивает малыша всеми пищевыми компонентами, необходимыми для полноценного роста (белками, жирами, углеводами, минеральными веществами и витаминами), потому что содержит их в необходимых количествах и правильных пропорциях. Кроме того, в мамином молоке имеются специальные биологически активные вещества, так называемые защитные факторы, поддерживающие иммунитет детского организма. Собственные механизмы, предотвращающие инфекционные заболевания, у младенца незрелы, а молозиво и грудное молоко благодаря своему составу защищают слизистую оболочку кишечника от воспалений, подавляя рост болезнетворных микроорганизмов, а также стимулируют созревание клеток кишечника и выработку факторов собственной иммунной защиты. Самая большая концентрация защитных факторов отмечается в молозиве, в зрелом молоке она снижается, но в тоже время увеличивается объем молока, и, в результате ребенок получает защиту от множества заболеваний постоянно, в течение всего периода грудного вскармливания. Чем продолжительнее грудное вскармливание, тем более защищен малыш от болезней.

Раньше считалось, что грудное молоко абсолютно стерильно, но многочисленные исследования доказали, что это не совсем так. В молоке все же могут присутствовать разные микроорганизмы. В основном это представители условно-патогенной микрофлоры, которые чаще всего спокойно существуют на коже, слизистых оболочках, в кишечнике и не причиняют никакого вреда. Однако при определенных условиях (снижение иммунитета, хронические заболевания, общая ослабленностьорганизма после перенесенного инфекционного заболевания, кишечный дисбактериоз) они начинают быстро размножаться, вызывая различные заболевания.
Основными бактериями, которые могут жить в грудном молоке, являются: стафилококки (эпидермальный и золотистый), энтеробактерии, грибы рода кандида.
Наиболее опасным из этой компании считается золотистый стафилококк. Именно он, проникнув в молочную железу, может вызвать гнойный мастит у кормящей мамы. А попав в организм малыша вместе с грудным молоком, стафилококк может вызвать такие заболевания, как:

энтероколит (частый, жидкий, водянистый стул, боль в животе, повышение температуры, частые срыгивания, рвота);
гнойные воспаления на коже;
явления кишечного дисбактериоза (учащенный стул, избыточное газообразование, сопровождающееся вздутием живота и отхождением большого количества газов во время дефекации, частые срыгивания, появление в кале непереваренных комочков, изменение цвета кала – желто-зеленый, цвет болотной тины).

Грибы рода кандида, гемолизирующая кишечная палочка и клебсиеллы, проникающие к ребенку с грудным молоком, способны сбраживать глюкозу, сахарозу и лактозу, образовывая при этом большое количество газа. Это, в свою очередь, вызывает у ребенка боли, вздутие животика и понос.

Иногда кормление ребенка может омрачиться инфекционной болезнью мамы. Остается ли грудное молоко полезным для ребенка, если в него проникает инфекция? В этом случае возникает опасность передачи инфекции ребенку через грудное молоко и встает вопрос о продолжении грудного вскармливания. Вопрос продолжать грудное вскармливание или нет, решается совместно с лечащим педиатром.

При некоторых болезнях матери грудное вскармливание абсолютно противопоказано. Кормить нельзя, если у мамы:

активная форма туберкулеза (признаки болезни ярко выражены, и в организме имеются патологические изменения);
сифилис, если заражение произошло после 32 недель беременности;
ВИЧ-инфекция и вирусный гепатит;
хронические заболевания сердечно-сосудистой системы, почек и печени в стадии обострения;
выраженное снижение гемоглобина и истощение у матери;
тяжелое течение и осложнения сахарного диабета;
злокачественные новообразования;
любые заболевания, требующие длительного лечения препаратами, вредными для ребенка;
наркомания, чрезмерное употребление алкоголя;
острые психические заболевания.

В случае острого гнойного мастита кормление грудью прекращают (чаще всего на время лечения антибиотиками, до 7 дней). При других формах мастита (не гнойных) специалисты рекомендуют продолжать грудное вскармливание. Это позволит быстро ликвидировать застой молока.

Очень часто для выявления возбудителей заболевшим кормящим мамам предлагается сдать грудное молоко на анализ, с помощью которого определяют микробиологическую стерильность молока, после чего решается вопрос о грудном вскармливании. Исследование проводят в бактериологических лабораториях ЦГиЭ или медицинских учреждений, информация о которых имеется у участкового педиатра. Насколько оправданы такие исследования? По данным Всемирной организацией здравоохранения, каждый болезнетворный микроб, поражающий кормящую мать, стимулирует выработку специальных защитных белков — антител, поступающих в грудное молоко и защищающих младенцев, как доношенных, так и недоношенных. Ученые выявили противобактериальные и противовирусные факторы, имеющиеся в грудном молоке, способные противостоять большинству инфекций. Исследовались грудное молоко и кал младенцев, это молоко потребляющих. Оказалось, что в большинстве случаев микроорганизмы, обнаруженные в молоке, в кале ребенка отсутствуют. Это говорит о том, что микробы, способные вызывать заболевания, попадая с молоком в кишечник малыша, не всегда там не приживаются, чему способствуют защитные свойства грудного молока. Таким образом, даже если в молоке выявлены какие-то микроорганизмы, но нет признаков острого гнойного мастита, грудное вскармливание будет безопасным, ведь с молоком малыш получает и защиту от болезней.

В каких же случаях нужно сдать молоко на анализ? Всем кормящим женщинам совсем не обязательно сдавать молоко на анализ, чтобы узнать, не опасно ли оно для ребенка. Такое исследование необходимо проводить только в тех случаях, если есть подозрения на инфекционные заболевания у малыша или воспалительные заболевания молочной железы у мамы.
Показания будут следующие.

Со стороны ребенка:

повторяющиеся гнойно-воспалительные заболевания кожи;
дисбактериоз;
длительная диарея (частый жидкий стул) с зеленью и слизью.

Со стороны мамы:

признаки мастита (воспаления молочной железы) – боль в груди, повышение температуры тела, покраснение кожи молочной железы, гнойные выделения из нее.

Как собрать молоко для анализа?

При сборе грудного молока на анализ важно понимать, что необходимо постараться исключить возможность попадания бактерий с кожи в молоко. В противном случае результат исследования может оказаться недостоверным. Существуют определенные правила сбора грудного молока для посева.

В первую очередь необходимо приготовить емкость для сцеженного молока. Это могут быть стерильные одноразовые пластиковые стаканчики (их можно купить в аптеке) или чистые стеклянные баночки, которые предварительно необходимо прокипятить вместе с крышкой в течение 15–20 минут.

Емкостей для сцеженного молока должно быть две, так как молоко для анализа из каждой молочной железы собирается отдельно. На контейнерах должна быть пометка, из какой груди взято молоко.

Перед сцеживанием необходимо помыть руки и грудь теплой водой с мылом.

Первые 5–10 мл сцеженного молока не подходят для исследования, и их следует слить. После этого необходимое количество грудного молока (для анализа потребуется 5–10 мл из каждой молочной железы) нужно сцедить в приготовленные стерильные емкости и плотно закрыть их крышками. Доставка в лабораторию не должна превышать 2 часов с момент отбора молока.

В лаборатории молоко высеивается на специальную питательную среду. Примерно через 5–7 дней на ней вырастают колонии различных микробов. Дальше определяют, к какой группе возбудителей относятся данные микроорганизмы, и подсчитывают их количество.

Оцениваем результат анализа грудного молока

Вариант 1. При посеве молока не наблюдается роста микрофлоры, т.е. молоко стерильно. Стоит отметить, что такой результат анализа встречается очень редко.

Вариант 2. При посеве молока выросло незначительно количество неболезнетворных микроорганизмов (эпидермальный стафилококк, энтерококки). Эти бактерии являются представителями нормальной микрофлоры слизистых и кожи и не представляют опасности. Их допустимая норма содержания в грудном молоке – не более 250 колоний бактерий на 1 мл молока (КОЕ/мл).

Вариант 3. При посеве молока обнаружены болезнетворные микроорганизмы (золотистый стафилококк, клебсиеллы, гемолизирующие кишечные палочки, грибы рода кандида, синегнойная палочка).

Надо ли лечиться, если ничего не болит?

Когда в грудном молоке присутствует золотистый стафилококк или другие болезнетворные патогенные микроорганизмы, но признаков инфекции у кормящей женщины нет, грудное вскармливание не прекращают, но при этом, как правило, маме назначают лечение (внутрь и местно) препаратами из группы антисептиков, которые не противопоказаны при кормлении грудью, а ребенку доктор пропишет пробиотики (бифидо- и лактобактерии) для профилактики дисбактериоза.
Многие женщины думают, что если нет признаков заболевания, то и лечение можно не проводить. Однако такое мнение нельзя признать правильным. Проблема в том, что в подобной ситуации состояние мамы может не ухудшится, а вот малышу навредить можно. Если ребенка долгое время кормить инфицированным молоком, то состав бактерий в его кишечнике может нарушиться и защита организма даст сбой. Поэтому маме надо обязательно лечиться, не прерывая грудного вскармливания.

Если же трещины все-таки появились, то нужно обязательно своевременно заняться их лечением, чтобы не допускать присоединения инфекции и развития мастита.

Стандарт распространяется на молоко и молочные продукты, закваски, бактериальные концентраты и препараты и устанавливает два метода определения Staphylococcus aureus в определенном объеме или навеске продукта - определение количества с предварительным обогащением; определение количества без предварительного обогащения.

ГОСТ 30347-97

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
STAPHYLOCOCCUS AUREUS

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ
ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ
Минск

Предисловие

ВНЕСЕН Госстандартом Российской Федерации

2 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации,метрологии и сертификации(протокол № 11 от 25 апреля 1997 г.)

За принятие проголосовали:

Наименование национального органа по стандартизации

Главная государственная инспекция Туркменистана

3 Постановлением Государственного комитета Российской Федерациипо стандартизации, метрологии и сертификации от 25 сентября 1997 г. № 341межгосударственный стандарт ГОСТ 30347-97 введен в действие непосредственно вкачестве государственного стандарта Российской Федерации с 1 июля 1998 г. справом досрочного введения

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Июль 2000 г.

Содержание

МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ

Методы определения Staphylococcus aureus

Milk and milk products. Methods for determination of staphylococcus aureus

Настоящий стандартраспространяется на молоко и молочные продукты, закваски, бактериальныеконцентраты и препараты и устанавливает два метода определения Staphylococcus aureus в определенном объеме илинавеске продукта - определение количества с предварительным обогащением;определение количества без предварительного обогащения.

Методопределения Staphylococcus aureus с предварительнымобогащением основан на высеве навески продукта и разведении его в жидкую селективнуюсреду, инкубировании посевов, учете положительных пробирок (колб), пересеве наплотные селективные среды с последующим подтверждением принадлежности выросшихколоний к Staphylococcus aureus .

Методопределения количества Staphylococcus aureus безпредварительного обогащения посевом на агаризованные селективные среды основанна высеве продукта или разведении его на поверхности плотной среды,инкубировании, подсчете типичных колоний Staphylococcus aureus споследующим подтверждением выросших колоний к Staphylococcus aureus поплазмокоагулирующей способности.

В настоящемстандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа

ГОСТ10444.11-89 Продукты пищевые. Методы определения молочнокислыхмикроорганизмов

ГОСТ27583-88 Яйца куриные пищевые. Технические условия

3.1 Аппаратура,материалы, реактивы по ГОСТ9225 со следующими дополнениями:

сухая плазмакроличья, цитратная;

контрольныйштамм Staphylococcus aureus ;

калия теллурит[2],раствор с массовой концентрацией 10 г/дм 3 ;

глицин [1],раствор с массовой концентрацией 200 г/дм 3 ;

натрия пируват[8],раствор с массовой концентрацией 200 г/дм 3 ;

фуксин основной[5],спиртовой раствор с массовой концентрацией 50 г/дм 3 ;

яйца куриныепищевые по ГОСТ27583;

3.2 Питательные среды

3.2.1Гидролизованное и стерильное обезжиренное молоко по ГОСТ10444.11 (3.3.1 и 3.3.3).

3.2.3Желточную эмульсию готовят следующим образом.

Свежее куриноеяйцо моют водопроводной водой, затем протирают ваткой, смоченной в спирте, иобсушивают. Отделяют желток и вносят его в 100 см 3 стерильногораствора хлористого натрия по ГОСТ9225. Тщательно перемешивают. Приготовленная эмульсия может храниться притемпературе 0-5 °С не более 72 ч.

3.2.4 Солевой бульон*:

Состав: натрийхлористый ( NaCl ) - 7,5 г;

питательный сухой бульон -1,5 г;

или гидролизованное молоко -100 см 3 .

Приготовление:в 100 см 3 дистиллированной воды вносят 1,5 г сухого питательногобульона, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватный тампон, добавляют 7,5 г NaCl ,устанавливают рН (6,9 ± 0,1).

Разливают впробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (10 ±1) мин.

Или к 100 см 3 гидролизованного молока добавляют 7,5 г NaCl , устанавливают рН (6,9 ±0,1), разливают и стерилизуют, как указано выше.

Состав: питательный агар***

для культивированиямикроорганизмов (на основе гидролизата кильки) [10]- 35 г

питательный агар II ***

(на основе гидролизатакормовых дрожжей) [10]- 24 г;

натрий хлористый ( NaCl ) -75 г;

эмульсия желточная - 50,0 см 3 ;

вода дистиллированная - 1 дм 3 .

Приготовление:в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара длякультивирования микроорганизмов или 24 г питательного агара сухого II ,добавляют 75 г хлористого натрия ( NaCl ), кипятят до полногорасплавления агара, фильтруют через ватный тампон, разливают во флаконы иликолбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин. Послестерилизации охлаждают до температуры (45 ± 1) °С и добавляют 50 см 3 предварительно подготовленной желточной эмульсии. Смесь тщательно перемешиваюти разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5сут.

3.2.6 Молочно-солевой агар**

Состав: питательный агар*** для культивированиямикроорганизмов (на основе гидролизата кильки) [10]- 35 г

или питательныйагар II *** (на основе гидролизата кормовых дрожжей) [10]- 24,0 г; натрий хлористый ( NaCl ) - 75,0 г;

молокообезжиренное - 100 см 3 ;

водадистиллированная - 1 дм 3 .

Приготовление:среду готовят, указано в 3.2.5,но после охлаждения до температуры (45 ± 1) °С добавляют вместо желточнойэмульсии 100 см 3 стерильного обезжиренного молока. Смесь тщательноперемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильникене более 5 сут.

3.2.7 Агар Байрд-Паркера * 4

дрожжевой экстракт [3]- 1,0 г;

* Допускается применениесолевого бульона [9],который готовится согласно указанию на этикетке.

** Допускается использоватьсолевой агар [9],который готовится согласно указанию на этикетке и к которому после стерилизациидобавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.

*** При изменении заводом-изготовителемколичества вносимой среды на 1 дм дистиллированной воды, количество средывносится согласно указанию на этикетке.

* 4 Допускается использовать агар Байрд-Паркера [9].Среда готовится согласно указанию на этикетке.

мясной экстракт - 5,0 г;

литий хлористый, гексагидрат[4] -5,0 г;

вода дистиллированная - 1 дм 3 .

Раствор пирувата натрия:

пируват натрия [8]- 20,0 г;

вода дистиллированная - 100см 3 .

вода дистиллированная -100,0 см 3 .

3.2.7.1Приготовление основы среды: в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 10г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористоголития, 20 г агара.

При отсутствиимясного экстракта, триптона и дрожжевого экстракта вместо дистиллированной водыприменяют 1 дм 3 мясопептонного бульона или питательный агар длякультивирования микроорганизмов сухой или питательный агар сухой II [10].

Все компоненты,внесенные в 1 дм 3 дистиллированной воды (мясопептонный бульон),нагревают и перемешивают до полного растворения, охлаждают до температуры 50-60°С. Устанавливают рН (7,2 ± 0,1), разливают в колбы или бутылки по 90 см 3 и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин.

Прииспользовании сухой среды в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 36 гпитательного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г питательногоагара сухого II , добавляют 5 г хлористого лития. Нагревают до полногорастворения, охлаждают до температуры 50-60 °С, устанавливают рН (7,2 ± 0,1),разливают и стерилизуют, как указано выше.

Готовую основусреды хранят не более 30 сут при температуре (6 ± 2) °С.

3.2.7.2Перед использованием к 90 см 3 расплавленной основы среды добавляютасептически стерилизованные фильтрованием через мембранный фильтр растворы: 6,3см 3 раствора глицина, 5 см 3 раствора пирувата натрия; 1см 3 раствора теллурита калия; 5 см 3 желточной эмульсии.

Допускаетсярастворы глицина, пирувата натрия, теллурита калия и желточную эмульсиюготовить в асептических условиях на стерильной дистиллированной воде.

Послетщательного перемешивания приготовленную среду разливают в чашки Петри.

Чашки со средойможно хранить не более 48 ч.

4.1 Приготовление растворов и реактивов

4.1.1 Раствор плазмыкроличьей цитратной готовится согласно инструкции по применению плазмы,прилагаемой к упаковке.

4.1.2Растворы и реактивы для окраски препаратов готовят по ГОСТ9225.

4.1.3Приготовление реактивов для окраски по Грому

4.1.3.1 Приготовление реактива 1

В 100 см 3 этилового спирта растворяют 0,5 г кристаллического фиолетового [6].

4.1.3.2Приготовление реактива 2

К 96 см 3 спиртового раствора йодистого калия массовой концентрацией 5 г/дм 3 добавляют 2 см 3 спиртового раствора основного фуксина [5]массовой концентрацией 50 г/дм 3 и 2 см 3 спиртовогораствора йода массовой концентрацией 50 г/дм 3 .

Йодистый калийрастворяют в спирте на водяной бане при температуре (45 ± 5) °С при постоянномпомешивании.

4.2Отбор и подготовка проб по ГОСТ9225.

5.1 Метод определения количества Staphylococcus aureus спредварительны м обогащением

5.1.1 Подготовкаи проведение контроля

5.1.1.1 Изнавески продукта готовят ряд десятикратных разведений по ГОСТ9225 так, чтобы можно было определить наличие или отсутствие Staphylococcus aureus в определенной массе(объеме), указанной в нормативном документе на конкретный продукт.

5.1.1.2Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см 3 в пробирки иликолбочки с солевым бульоном (3.2.4).

Соотношениемежду количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением ипитательной средой 1 : 10.

Пробирки и колбочкис посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.

5.1.1.3Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на солевом бульоне,к Staphylococcus aureus делают пересев петлей избульона для получения изолированных колоний на чашки Петри с подсушеннымисредами типа Байрд-Паркера (3.2.7),желточно-солевой агар или молочно-солевой агар (3.2.5; 3.2.6).

Чашки спосевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24-48ч.

5.1.1.4После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерныхколоний.

На желточно-солевомагаре колонии Staphylococcus aureus имеют форму плоских дисковдиаметром 2-4 мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета сровными краями; вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнениясреды.

Намолочно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus растутв виде непрозрачных круглых колоний, окрашенных от белого до оранжевого цвета,диаметром 2-4 мм, слегка выпуклых.

На средеБайрд-Паркера колонии Staphylococcus aureus растутв виде черных, блестящих, выпуклых колоний диаметром 1-1,5 мм, окруженных зонойпросветления среды шириной 1-3 мм.

5.1.1.5С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных колоний и пересеиваютна поверхность скошенного питательного агара, как указано в 3.2.5, но без добавления хлористогонатрия и желточной эмульсии.

Посевывыдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч. У выросшихколоний определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмыкролика.

5.1.1.6Из пяти изолированных, характерных для Staphylococcus aureus колоний,делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Дляприготовления препарата на чистое и охлажденное после фламбирования предметноестекло наносят петлей каплю дистиллированной воды, в которую вносят петлейнебольшое количество агаровой культуры, не размешивая в воде. Затем вносятпетлей каплю реактива 1, приготовленного по 4.1.3.1. Смесь распределяют научастке примерно 1 см 2 , просушивают при температуре (20 ± 2) °С ификсируют, медленно пронося предметное стекло над пламенем горелки. На одномстекле можно готовить по шесть - восемь мазков, отделяя их один от другоголиниями, проведенными с лицевой стороны стекла.

Препаратополаскивают водой и тщательно просушивают фильтровальной бумагой.

Послепросушивания на препарат наносят с избытком реактив 2, приготовленный по4.1.3.2 так, чтобы жидкость покрыла всю поверхность стекла. Продолжительностьокрашивания 0,5 -1 мин. После окрашивания препарат быстро ополаскиваютпроточной водой, направляя струю под углом на стекло, помещенное вертикально.Препарат просушивают фильтровальной бумагой и просматривают под микроскопом с иммерсионнойсистемой. Микробы, красящиеся по Граму, будут темно-фиолетового цвета, некрасящиеся по Граму - красного цвета.

Стафилококкиокрашиваются по Граму положительно (темно-фиолетового цвета), имеютшарообразную форму и располагаются скоплениями, чаще всего напоминающимигроздья винограда.

5.1.1.7Постановка реакции плазмокоагуляции

В пробирку с0,5 см 3 разведенной кроличьей плазмы вносят петлю суточной агаровойкультуры. Внесенную культуру тщательно размешивают. Одну пробирку с плазмойоставляют незасеянной, а в другую засевают контрольный штамм Staphylococcus aureus (коагулазоположительныйстафилококк). Пробирки помещают в термостат и выдерживают при температуре (37 ±1) °С в течение 3-6 ч. Если через 6 ч коагуляции плазмы не произошло, тооставляют эти пробирки до 24 ч. Если через 24 ч плазма не свернулась, тоиспытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной.

При определениикоагулазной активности реакцию считают отрицательной в тех случаях, когда вплазме не образуются отдельные нити или сгустки, или в тех случаях, когда вплазме появились отдельные нити (реакцию плазмокоагуляции оценивают на одинплюс).

Реакцию считаютположительной, если:

+ + + -сгусток, имеющий небольшой отсек;

+ +- сгусток в виде взвешенного мешочка.

Все триварианта являются положительным результатом.

При полученииположительной реакции считают, что в посевах обнаружен Staphylococcus aureus .

5.1.2Обработка результатов контроля

Результатыоценивают по каждой пробе отдельно.

5.1.3Оформление результатов контроля

Морфологические,культуральные свойства и положительная реакция плазмокоагуляции свидетельствуюто присутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной массе продукта.

5.2 Метод определения количества Staphylococcus aureus безпредварительного обогащения

5.2.1Проведение контроля

5.2.1.11 см 3 жидкого продукта или его разведения (5.1.1) наносят наповерхность питательных сред (3.2.5 или 3.2.6 или 3.2.7) в 3 чашки Петри, тщательнорастирают шпателем по поверхности питательной среды. Посевы инкубируют притемпературе (37 ± 1) °С в течение 24-48 ч. Чашки Петри с посевами инкубируютдном вверх.

5.2.1.2После термостатирования подсчитывают количество характерных колоний на каждойчашке Петри (5.1.4). С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерныхи/или подозрительных колоний Staphylococcus aureus ,а в случае роста менее пяти - все колонии характерные для Staphylococcus aureus и пересевают на поверхностьскошенного питательного агара, разлитого в пробирки, как указано в 3.2.5, но без добавленияхлористого натрия и желточной эмульсии. Пробирки с посевами выдерживают втермостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.

У выросшихкультур определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кроликав соответствии с требованиями 5.1.6 и 5.1.7.

5.2.2Обработка результатов контроля

Результатыоценивают по каждой пробе отдельно.

Если приизучении характерных колоний в 80 % случаев, то есть не менее чем в 4 из 5колоний подтвержден рост Staphylococcus aureus ,то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашках Петри (5.1.7),принадлежат к Staphylococcus aureus . В остальных случаяхколичество Staphylococcus aureus определяют, исходя изпроцентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерныхколоний, взятых для подтверждения.

5.2.3Оформление результатов контроля

Количествоколоний Staphylococcus aureus в 1 г или 1 см 3 Хпосле определения его в определенной навеске продукта вычисляют по формуле

где - количество колоний,выросших на всех чашках Петри в пределах одного разведения или засеянногообъема;

п - число десятикратныхразведений.

Подсчитываемколичество колоний Staphylococcus aureus , выросших на трех засеянныхчашках при посевах продукта или его разведений:

1 гили 1 см 3 продукта - 84 96 72

10 -1 разведение - 9 10 7

10 -1 разведение - 84 96 72

10 -2 разведение - 99 10 7

[1] ТУ 6-09-09-200-84 Глицин для медицинских целей

[2] ТУ 6-09-2060-77 Калий теллуристокислый водный

[3] ТУ 6-09-3462-73 Экстракт дрожжевой. Технические условия

[4] ТУ 6-09-3751-83 Литий хлорид 1-водный. Технические условия

[5] ТУ 6-09-3804-82 Фуксин основной для микробиологических целей.Технические условия

[6] ТУ 6-09-4119-75 Кристаллический фиолетовый. Технические условия

[7] ТУ 6-09-4510-77 Экстракт дрожжевой очищенный. Технические условия

[9] ТУ 10-02-02-789-176-94 Среды питательные сухие для определения Staphylococcus aureus . Технические условия

Ключевыеслова :питательные среды, коагулазоположительные стафилококки, характерные колонии,окраска по Граму, коагулирование плазмы

ГОСТ27583-88. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52121-2003. Яйцакуриные пищевые. Технические условия

Методы определения молока от маститных коров. Проведение постановки каталазной, лейкоцитной, бромтимоловой проб. Пробы отстаивания и пробы с щелочью. Определение наличия в молоке бактериофага, антибиотиков. Методика проведения микроскопии мазка молока.

Рубрика	Сельское, лесное хозяйство и землепользование
Вид	разработка урока
Язык	русский
Дата добавления	13.08.2015
Размер файла	322,3 K

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Тема: Исследование молока на присутствие стафилококков, стрептококков, бактериофага и антибиотиков

Цель занятия. Задачи

Оборудование и материалы

Цель занятия. Задачи

Цель занятия. Научиться распознавать маститное молоко, обнаруживать бактериофаг и антибиотики.

1. Учесть результаты предыдущего занятия (общее количество бактерий в 1 см 3 обычного и пастеризованного молока), коли-титр, количество протеолитических, маслянокислых бактерий, дрожжей и плесневых грибов. 2. Ознакомиться с методами исследования молока от маститных коров, провести постановку каталазной, лейкоцитной, бромтимоловой проб, пробы отстаивания и пробы с щелочью. 3. Определить наличие в молоке бактериофага, антибиотиков. 4. Провести микроскопию мазков молока.

Оборудование и материалы

Посевы от предыдущего занятия, пробы молока, загрязненного стафилококками и стрептококками, молока от здоровых коров, набор красителей, бактериологические петли, предметные стекла, микроскопы, каталазник Функе, водяная баня, центрифуга, пробирки с МПБ, раствор метиленового синего, чашки Петри с агаром, пипетки, чистые культуры стрептококка, шпатели Дригальского, фильтрат молока, комбинированный индикатор, фильтр Зейтца стерильный, колба Бунзена стерильная с резиновой пробкой.

Методические указания

Исследование молока от маститных коров. Возбудителями воспалительного процесса вымени могут быть различные микроорганизмы, в результате действия которых секреция молока отклоняется от нормы и реакция молока из слабокислой переходит в щелочную. Молоко становится солено-горьким, в нем появляются хлопья или тянущиеся нити. Позднее выделяется гнойная жидкость, иногда с неприятным запахом. Наиболее опасное поражение вымени вызывают стрептококки - Str. mastitidis, Str. agalactiae и стафилококки - Staph. aureus.

Указанные стрептококки сходны между собой. Величина кокков 0,5. 1 мкм в диаметре. Они неподвижны, спор и капсул не образуют, грамположительны, не образуют пигментов. На агаре формируют мелкие, слегка мутные колонии. Желатин не разжижают. При отстое молока, полученного от больных животных, на дне сосуда оседают гной, фибрин и микробные клетки. В мазках из маститного молока Str. mastitidis наблюдается в виде коротких цепочек, заключенных в лейкоцитах, Str. agalactiae - в виде небольших скоплений; встречаются и диплококки.

Золотистый стафилококк Staph. aureus, обнаруживаемый в маститном молоке, - это сферический кокк диаметром 0,8. . .0,9 мкм. Спор и капсул не образует, неподвижный. Легко окрашивается всеми анилиновыми основными красками. Грамположительный, на всех обычных питательных средах растет в виде скоплений колоний неправильной формы. Растет при оптимальной температуре 34 … 37°С. Факультативный анаэроб при посеве штрихом на МПА растет в виде золотистого налета с блестящей поверхностью. На кровяном агаре вокруг колоний образуется выраженная зона гемолиза. Незначительно разжижает желатин. На МПБ дает равномерное помутнение. Хорошо растет на молоке, разлагает лактозу и вызывает свертывание молока. Содержит кислые протеазы, что вызывает пептонизацию сгустка.

Для распознавания маститного молока ставят каталазную, лейкоцитную и бромтимоловую пробы, проводят бактериологические и бактериоскопические исследования.

Каталазная проба: в каталазник Функе вносят 15 см 3 молока, подогретого до 25 °С, и 5 см 3 1%-ного раствора пероксида водорода. Жидкости перемешивают и внутреннюю трубку каталазника Функе вставляют так, чтобы уровень жидкости был на ее нулевом делении. Каталазник ставят на водяную баню при температуре 25 °С на 2 ч. Отсчитывают высоту уровня жидкости, которая соответствует объему выделившегося кислорода. При выделении свыше 2 см 3 кислорода молоко считается подозрительным на мастит.

Лейкоцитная проба: в центрифужные градуированные пробирки вносят по 10 см 3 молока от каждой пробы и центрифугируют 5 мин при частоте вращения 1200 об/мин. При наличии в пробирке осадка, достигающего делений 0,5. 1, молоко считается подозрительным; наличие осадка, достигающего делений 1. 2, указывает на то, что молоко получено от маститных коров. При микроскопии осадка такого молока обнаруживается большое количество многоядерных лейкоцитов и стрептококков.

Бромтимоловая проба. В углублениях на фарфоровой пластинке 5 капель молока смешивают с 1 каплей 0,2 %-ного раствора бромтимолового синего в 60 %-ном спирте. Молоко, полученное от здоровых коров, окрашивается в желтый цвет (рН 6,3 … 6,5), от маститных - в зеленый (рН 6,5 … 7,0) и даже синий (рН 7,0 … 7,5).

При тяжелых формах мастита реакция молока может быть кислой и оно окрашивается в желтый цвет.

Проба отстаивания (проба Мутовина): для проведения пробы из каждой доли вымени (соска) выдаивают 10 … 15 см 3 молока в пробирки и оставляют их в штативе при температуре 4 … 8 °С. Пробирки просматривают через 2 … 3 ч и вторично через 16 … 24 ч. При этом определяют цвет молока, наличие осадка и примесей, высоту слоя сливок и их внешний вид. Маститное молоко бывает синеватым, водянистым. Слой сливок менее 0,5 мм указывает на заболевание. Признаком заболевания является также розовый цвет сливок (наличие в них эритроцитов). Хлопья указывают на большое количество лейкоцитов.

Проба с щелочью: на предметное стекло наносят 5 капель молока, добавляют 2 капли 1 н. раствора NaOH и смешивают в течение 20 с. Если молоко доброкачественное, образуется прозрачная смесь, если маститное, наблюдаются хлопья и нити.

Определение бактериофага в молоке. В настоящее время найдены бактериофаги (рис. 1), способные разрушать различные виды молочнокислых бактерий. В молоко бактериофаг попадает с бактериями, содержащимися в кормах, коже и вымени животного. Вторичное загрязнение молока бактериофагом возможно при хранении и транспортировании. На молочных заводах основным источником фага является сырье, сборное молоко, обсемененное микробами. Для исследования на наличие бактериофага пробы молока отбирают в стерильную посуду. Нагревают на водяной бане до 40°С, добавляют 10 %-ную молочную или уксусную кислоту до осаждения белков. Свернувшееся молоко фильтруют через стерильный бумажный фильтр, а затем через стерильный фильтр Зейтца. Фильтрат собирают в стерильную пробирку.

Рис. 1 Бактериофаг мезофильных молочнокислых стрептококков.

Для проведения качественной пробы на бактериофаг в опытную пробирку с 10 см 3 стерильного обезжиренного молока с метиленовым синим вносят 1 петлю чувствительной культуры молочнокислого стрептококка и 1 см 3 фильтрата. Контролем служит другая пробирка с 10 см 3 той же среды. В нее вносят только одну бактериальную петлю чувствительной культуры. Обе пробирки помещают в термостат при 30 °С и наблюдают через 6.. .8 и 24 ч. Если через 24 ч в опытной пробирке культура не вырастет (бульон прозрачный) или синий цвет молока не изменится, считают, что в фильтрате присутствует бактериофаг с сильным литическим действием; если бульон остается прозрачным через 6.. .8 ч либо слегка помутнеет или молоко с метиленовым синим не изменится, а через 24 ч МПБ помутнеет, а молоко восстановится, но не свернется, то считают, что в фильтрате присутствует бактериофаг со слабым литическим действием.

В контрольной пробирке через 6 … 8 ч бульон мутнеет, метиленовый синий в молоке восстанавливается, через 24 ч наблюдается обильное помутнение бульона или восстановление и свертывание молока.

Определение антибиотиков в молоке. Антибиотики (пенициллин, тетрациклин, стрептомицин и др.) попадают в молоко при лечении мастита у коров. Они нарушают молочнокислое брожение. Наличие антибиотиков и моющих или дезинфицирующих средств в молоке устанавливают с использованием прямых и косвенных методов.

Прямое микроскопирование основано на подавлении размножения бактерий и изменении их формы под влиянием антибиотиков. В пробирку отбирают 10 см 3 исследуемого молока, закрывают корковой пробкой и ставят на водяную баню при температуре 80 … 85 °С на 5 мин. Затем быстро охлаждают до 40 °С. маститный корова каталазный антибиотик

В контрольную пробирку отбирают 10 см 3 молока, которое заведомо не содержит антибиотиков. В обе пробирки добавляют по 3 … 4 капли свежей культуры чувствительного к антибиотикам термофильного стрептококка, выращенного на гидролизованном или обезжиренном молоке. Тщательно встряхнув закрытые пробками пробирки, ставят их на водяную баню при температуре 40 °С на 90 мин. Затем микроскопируют окрашенные препараты с иммерсионным объективом. На присутствие антибиотиков указывают резкое уменьшение количества клеток в испытуемом молоке по сравнению с контролем, наличие утолщенных форм клеток и их скопление.

Восстановление метиленового синего: в пробирки с исследуемым и контрольным молоком вносят по 1 см 3 раствора метиленового синего (см. пробу на редуктазу) и затем 3…4 капли свежей культуры чувствительного к антибиотикам термофильного стрептококка. Встряхнув, пробирки ставят на водяную баню при температуре 38…40 °С на 5,5 ч. Следят за изменением цвета в исследуемом образце по сравнению с контролем, в котором метиленовый синий должен восстанавливаться. Наличие синего цвета в исследуемом молоке указывает на присутствие антибиотиков.

Восстановление резазурина: в пробирки с исследуемым и контрольным молоком вносят по 1 см 3 раствора резазурина (см. пробу с резазурином); 3…4 капли чувствительного к антибиотикам термофильного стрептококка перемешивают и ставят на водяную баню на 45 мин. Отмечают изменение цвета исследуемого образца по сравнению с контролем. Фиолетово-розовый или сине-стальной цвет молока указывает на присутствие антибиотиков.

На присутствие антибиотиков или других термостойких ингибиторов указывает серовато-голубой цвет исследуемого молока.

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 ноября 2016 г. N 1824-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 30347-2016 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 сентября 2017 г.

ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 5, 2017 год

Поправка внесена изготовителем базы данных

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на молоко и молочную продукцию и устанавливает методы определения Staphylococcus aureus (S. aureus) в определенном объеме или навеске продукта - определение с предварительным обогащением и определение без предварительного обогащения.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты*

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификационный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 33951-2016 Молоко и молочная продукция. Методы определения молочнокислых микроорганизмов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 26809.1-2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты

ГОСТ 32901-2014 Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологического анализа

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующими определениями:

3.1 коагулазоположительные стафилококки: Грамположительные, каталазоположительные микроорганизмы, которые образуют типичные и/или атипичные колонии на или в селективно-диагностической питательной среде, дающие положительную реакцию на коагулазу на кроличьей плазме.

3.2 Staphylococcus aureus (S. aureus): Коагулазоположительные стафилококки, образующие ацетоин и ферментирующие мальтозу в аэробных условиях при определении этих биохимических тестов по методам, приведенным в настоящем стандарте.

4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы

4.1 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы - по ГОСТ 32901 со следующими дополнениями:

Микробиологическое исследование, позволяющее выявить инфицированность золотистым стафилококком и определить количество возбудителя. При выявлении патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов будет определена их чувствительность к антимикробным препаратам (антибиотикам и бактериофагам). В ином случае чувствительность к антибиотикам и бактериофагам не определяется, т.к. не имеет диагностического значения.

Синонимы английские

Staphylococcus aureus culture, MRSA culture (Methicillin-resistant S. aureus culture), quantitative.

Метод исследования

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Грудное молоко, кал, мазок из зева, мазок с конъюнктивы, мазок из носа, мазок урогенитальный (с секретом предстательной железы), мокроту, отделяемое раны, отделяемое уха, ректальный мазок, среднюю порцию утренней мочи.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Общая информация об исследовании

Золотистые стафилококки (Staphylococcus aureus) – грамположительные условно-патогенные бактерии рода Staphylococcus, являющиеся наиболее частой причиной стафилококковых, в частности внутрибольничных, инфекций. Золотистые стафилококки в норме могут располагаться на коже, слизистой оболочке носа и реже в гортани, влагалище, кишечнике. Они встречаются у 30 % здоровых людей.

Если у человека слабая иммунная система или нарушен нормальный состав микрофлоры, то при повреждении кожи (слизистых оболочек) золотистый стафилококк может приводить к разнообразным местным и системным инфекционно-воспалительным поражениям:

кожи (карбункулам, импетиго, фолликулиту),
молочных желез (маститу),
дыхательных путей и ЛОР-органов (тонзиллиту, гаймориту, отиту, фарингиту, ларинготрахеиту, пневмонии),
мочевыводящих путей (уретриту, циститу, пиелонефриту),
пищеварительной системы (энтероколиту, аппендициту, перитониту, парапроктиту, холециститу),
костно-суставной системы (остеомиелиту, артриту).

В отдельных случаях возможна генерализация инфекции с развитием септикопиемии. Производимый золотистым стафилококком энтеротоксин вызывает пищевые отравления и синдром токсического шока. Основные источники инфекции: здоровые (носители) и больные люди, домашние и сельскохозяйственные животные, а также пища, содержащая возбудителя инфекции (чаще всего это сахаросодержащие молочные продукты). Инфицирование может происходить контактным и воздушно-пылевым путем. Возможно аутоинфицирование.

Определение количества бактерий может потребоваться, например, чтобы понять, нужно ли проводить лечение: в некоторых случаях, если количество небольшое, лечение не проводится. Решение о его необходимости зависит от клинических проявлений, а также от количества стафилококка. При небольшом содержании микробов и отсутствии симптоматики лечение может вообще не понадобиться, т. к. и в норме на слизистой могут находиться эти микробы. Стафилококк в кишечнике обнаруживается постоянно, это не повод для лечения, но если его количество превышено, тогда нужны меры (бактерия может вызывать колики и расстройства). Стафилококк в мазке без симптомов вагинита также является нормой, в то время как большие количества стафилококка в мазке, наряду с повышением лейкоцитов, требуют лечения.

Наличие стафилококка не обязательно означает инфекцию, это может быть бессимптомное носительство, например при посеве мазков из носа и зева носительством считается количество бактерий до 10 3 . Однако более высокие показатели говорят нам о золотистом стафилококке как о причине заболевания, и это уже далеко не бессимптомное носительство.

Многое зависит от возраста пациента. Например, золотистый стафилококк в количестве 10 4 является вполне нормальным показателем для детей старше 1 года, но у грудных детей в таком количестве уже потребует лечения.

В любом случае наличие стафилококка при отсутствии симптомов болезни – еще не повод к назначению лекарств.

Количество стафилококка может определяться до и после лечения. Если выясняется, что рост возбудителя обильный, значит, инфекция набирает обороты, предыдущая терапия была неудачной и срочно требуется новый курс лечения; умеренный и скудный рост микроорганизмов по результатам последних анализов говорит об успешности терапии. Кроме того, в дальнейшем необходимо контролировать количество стафилококков в течение 1 или 2 месяцев после пройденного лечения.

Отмечено также, что после пребывания больных в хирургической клинике стафилококк обнаруживался у них вдвое чаще, чем при поступлении. У больных, поступающих в стационары, наблюдается замена антибиотикочувствительных стафилококков на антибиотикоустойчивые.

Лечение больных стафилококковой болезнью препаратами пенициллина или другими давно применяемыми антибиотиками часто остается безрезультатным, поскольку такие препараты нередко только усугубляют тяжесть течения инфекции. Поэтому так важно установить, какие антибиотики будут эффективны при лечении стафилококка.

Для чего используется исследование?

Для определения целесообразности лечения.
Для дифференциации бактерионосительства и опасного инфицирования.
Для контроля за состоянием пациента после проведенного лечения.
Для того чтобы подтвердить, что стафилококк является причиной возникшего заболевания (об этом свидетельствуют высокие показатели посева).

Что означают результаты?

Референсные значения: нет роста.

Золотистый стафилококк в мазке в небольших количествах является частью нормальной микрофлоры человека. Значительное повышение стафилококка в мазке может быть симптомом воспалительного процесса, кожных инфекций (угри и пр.) и очень опасных заболеваний (пневмония, остеомиелит, эндокардит и др.). Результат посева интерпретирует врач исходя из того, в каком количестве выделены микроорганизмы.

Читайте также: